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Resumo

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura de células-tronco mesenquimais das artérias do cordão umbilical, veia e geléia de Wharton.

Resumo

As células-tronco mesenquimais do cordão umbilical (UC-MSCs) são uma importante fonte celular para a medicina regenerativa. As UC-MSCs podem ser isoladas da geléia de Wharton do cordão umbilical, bem como das artérias umbilicais e da veia umbilical. Eles são conhecidos como células-tronco perivasculares obtidas de artérias umbilicais (UCA-PSCs), células-tronco perivasculares obtidas da veia umbilical (UCV-PSCs) e células-tronco mesenquimais obtidas da geléia de Wharton (WJ-MSCs). UCA-PSCs e UCV-PSCs são pericitos derivados de regiões perivasculares que são progenitoras de MSCs. O isolamento e a cultura dos três tipos de células são uma fonte importante para o estudo do transplante e reparo de células-tronco. O presente protocolo se concentra no isolamento e cultura de células por meio de separação mecânica, cultura aderente e rastreamento de células. Por meio dessa técnica, os três tipos diferentes de células-tronco podem ser derivados. Os marcadores de superfície celular foram detectados por citometria de fluxo. As células-tronco foram detectadas quanto ao potencial de diferenciação de múltiplas linhagens por diferenciação adipogênica, osteogênica e semelhante a neurais, o que é consistente com o fenótipo das MSCs. Este protocolo experimental expande a fonte de UC-MSCs. Além disso, o método de isolamento celular fornece uma base para estudos adicionais da medicina regenerativa e outras aplicações.

Introdução

As células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano (UC-MSCs) são amplamente utilizadas na medicina regenerativa devido à sua operação não invasiva, baixa imunogenicidade e falta de disputa ética1. Em muitos estudos, as UC-MSCs isoladas da geléia de Wharton (WJ) podem se fixar na parede, sofrer multidiferenciação e expressar marcadores de células-tronco mesenquimais (MSCs)2. No entanto, quase todas as CTMs são originárias da região perivascular3. Os pericitos, como um subconjunto de células perivasculares, são células progenitoras dasCTMs 4. Portanto, as UC-MSCs podem ser isoladas do cordão umbilical WJ, artérias umbilicais (UCAs) e veia umbilical (UCV), conhecidas como UCA-PSCs, UCV-PSCs e WJ-MSCs, respectivamente5. Este método teve como objetivo isolar e cultivar os três diferentes tipos de células-tronco. O isolamento e a cultura de UCA-PSCs, UCV-PSCs e WJ-MSCs são muito importantes para fornecer mais fontes de MSCs.

O presente estudo descreve o isolamento, a cultura e a aplicação futura de UCA-PSCs, UCV-PSCs e WJ-MSCs, que possuem adesão celular, expressam os marcadores de MSCs e possuem diferenciação multidirecional. As células-tronco isoladas foram observadas em microscopia e submetidas a cultura celular, passagem celular, criopreservação celular e recuperação celular. A lógica por trás do uso dessa técnica eram as células rastejando para fora do tecido. Em comparação com o método anterior, como citometria de fluxo ou técnicas de esferas imunomagnéticas, que eram complexas e caras6, as US-MSCs podem ser massivamente isoladas pelo método de separação aderente e rastreamento celular; estes foram utilizados no estudo anterior5. A análise de citometria de fluxo foi realizada nas células-tronco derivadas para detectar se essas células expressam marcadores MSC. A diferenciação multidirecional das células-tronco foi introduzida para detectar se os três tipos de células têm o potencial de se diferenciar em adipócitos, osteoblastos e neuroblastos. O isolamento e a cultura de três tipos de células-tronco do cordão umbilical foram importantes no uso clínico e úteis para pesquisadores em diversas aplicações futuras.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Clínica do Terceiro Hospital Afiliado da Universidade de Soochow. O consentimento informado por escrito foi obtido dos sujeitos humanos. Indivíduos com parto vaginal a termo ou cesariana foram incluídos no presente estudo para obtenção do cordão umbilical. O cordão umbilical é proveniente de recém-nascidos saudáveis, sem viés de gênero. O recém-nascido apresentou índice de Apgar de 8 a 10. O índice de Apgar é um teste rápido para recém-nascidos administrado logo após o nascimento. Este teste verifica o tônus muscular, a frequência cardíaca e outros sinais de um bebê para ver se algum atendimento médico ou de emergência adicional é necessário7. Por outro lado, pacientes com doenças maiores, como coração, fígado, rim ou outras doenças infecciosas, foram excluídos do presente estudo.

1. Coleta de cordão umbilical humano

  1. Coloque o cordão umbilical do recém-nascido em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e transporte a 4 °C.
    NOTA: Três cordões umbilicais de três doadores foram utilizados no presente estudo.
  2. Remova o sangue do cordão umbilical imediatamente em condições estéreis e corte ao longo do longo eixo dos vasos sanguíneos em 20 cm do cordão umbilical. Separe os 20 cm apropriados das artérias e veias umbilicais e remova a geléia de Wharton da superfície com cuidado.
    NOTA: As culturas de explantes foram obtidas de cada região, picadas em pequenos pedaços (1-2 mm3) para evitar contaminação cruzada entre os três tipos de células-tronco.
  3. Corte as artérias umbilicais, a veia e a geléia de Wharton em um tamanho de 1-2 mm3 e inocule-as em placas de cultura de células de 100 mm. Realizar a inoculação das artérias umbilicais, veia e geléia de Wharton com pinça após um relatório publicado anteriormente5. Não pré-revestir as placas de cultura de 100 mm.
    NOTA: O intervalo entre as artérias umbilicais, veia ou geléia de Wharton foi de cerca de 1 cm. Um tempo de coleta muito longo antes de separar as células pode afetar a viabilidade e a quantidade celular. Recomenda-se separar imediatamente as artérias e veias do cordão umbilical. O tempo de coleta foi de até 4 h.

2. Isolamento e cultura de UCA-PSCs, UCV-PSCs e WJ-MSCs

  1. Coloque as placas de cultura de células de cabeça para baixo por 3 h em uma incubadora de CO2 a 5% a 37 ° C para garantir que as artérias umbilicais, a veia e o tecido gelatinoso de Wharton se prendam firmemente às placas de cultura de células antes de adicionar o meio de cultura.
    1. Após 3 h, retorne as placas de cultura de células à colocação normal. Adicione 5 mL de meio de cultura celular (LG-DMEM, 10% FBS, 100 UI / mL de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina, consulte a Tabela de Materiais) à placa de cultura de células.
  2. Adicione 3 mL e 2 mL do meio de cultura na placa de cultura de células no3º e7º dia da primeira semana, respectivamente. Tenha cuidado para não tocar nos blocos de tecido das artérias do cordão umbilical, veia e geléia de Wharton.
  3. Troque metade do meio líquido duas vezes na segunda semana e todo o meio líquido duas vezes na terceira semana.
  4. Observe as células rastejando para fora dos blocos de tecido aproximadamente 7 dias após a cultura e, em seguida, descarte os blocos de tecido quando as células estiverem 80% fundidas em ~ 2 semanas.
    1. Quando as células estiverem 100% fundidas, passe-as na proporção de 1:3 com 2 mL de tripsina a 0,05% após centrifugação a 600 x g por 4 min à temperatura ambiente.
      NOTA: As células primárias isoladas de um cordão umbilical foram cerca de 2 x 106 UCA-PSCs, 1 x 106 UCV-PSCs e 2 x 106 WJ-MSCs. As 2 x 106 UCA-PSCs, 1 x 106 UCV-PSCs e 2 x 106 WJ-MSCs foram isoladas de 20 cm de cordão umbilical. As células rastejaram para fora em todos os três cordões umbilicais, o que indicou que os resultados entre os isolamentos eram repetíveis.
    2. Semear as células, mantendo uma concentração de 5 x 105/100 cm2 na placa de cultura. Preserve as células 5 x 105 em 1 mL de solução de criopreservação (90% FBS, 10% DMSO). Células de terceira a quinta passagem foram usadas no presente estudo.

3. Detecção de marcadores de superfície MSC por citometria de fluxo

  1. Digerir as células de terceira geração com 0,05% de tripsina para obter uma suspensão unicelular. Centrifugue as células a 600 x g por 4 min à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante da célula usando uma pipeta Pasteur. Em seguida, ressuspenda 1 x 105 células em 100 μL de PBS (1% FBS). Avalia o número de células contando as células usando um hemocitômetro seguindo um relatório publicado anteriormente8.
  2. Incube as células 1 x 105 com vários anticorpos de ficoeritrina contra CD13 (FITC, 0,1 mg / mL), CD34 (FITC, 0,1 mg / mL), CD45 (FITC, 0,1 mg / mL), CD73 (FITC, 0,1 mg / mL) e HLA-DR (FITC, 0,1 mg / mL) no escuro por 30 min. Para controles, incube 1 x 105 células com FITC-IgG (FITC Mouse Anti-Human IgG, 0,1 mg / mL) (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Centrifugue as células a 600 x g por 4 min em temperatura ambiente e, em seguida, descarte o sobrenadante da célula usando uma pipeta Pasteur. Ressuspenda 1 x 105 células em 500 μL de PBS (1% FBS), detecte por citometria de fluxo e analise por FlowJo2 (consulte a Tabela de Materiais).

4. Diferenciação de UCA-PSCs, UCV-PSCs e WJ-MSCs em adipócitos

  1. Inocular as células de terceira geração em placas de 24 poços a uma densidade de 6 x 104 células/cm2 com 500 μL de meio celular (LG-DMEM, 10% FBS, 100 UI/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina, ver Tabela de Materiais) por poço em uma incubadora de CO5% 2 a 37 °C.
  2. Mude o meio celular após 24 h e mude o grupo controle para meio celular (LG-DMEM, 10% FBS, 100 UI / mL de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina). Conduza os experimentos depois que as células estiverem 80% fundidas em placas de 24 poços.
    NOTA: As células dos grupos que induziram a adipogênese foram alteradas para um meio de indução adipogênica (kit de diferenciação adipogênica, ver Tabela de Materiais). O meio das células em ambos os grupos foi alterado a cada 3 dias.
  3. Observe gotículas lipídicas nas células aproximadamente 21 dias após a indução no grupo de indução adipogênica e, em seguida, termine a indução adipogênica.
    NOTA: O meio adipogênico foi substituído por meio de cultura celular para encerrar a indução adipogênica 2,5. Além disso, as células do grupo controle não mostraram nenhuma mudança significativa.
  4. Lave as células três vezes com PBS por 5 min e depois fixe com paraformaldeído a 4% por 15 min em temperatura ambiente. Em seguida, lave as células três vezes com PBS por 5 min cada.
  5. Descarte o PBS e seque as células em temperatura ambiente por aproximadamente 20 min. Em seguida, adicione 500 μL de solução de óleo vermelho O (0,5%) (ver Tabela de Materiais) ao poço por 10 min.
  6. Remova a solução de óleo vermelho O e lave as células com PBS três vezes por 5 min cada. Observe as células ao microscópio.

5. Diferenciação das células-tronco em osteoblastos

  1. Coloque 500 μL de gelatina a 0,1% (consulte a Tabela de Materiais) por poço em placas de cultura de 24 poços e descarte-o após 30 min.
  2. Inocular 6 x 104/cm2 de células de terceira geração em placas de cultura de 24 poços e adicionar 500 μL de meio de cultura celular ou meio de indução osteogénica (Kit de Diferenciação Osteogénica, ver Tabela de Materiais) a cada poço numa incubadora de CO 5%2 a 37 °C. No grupo controle, troque o meio de cultura celular a cada 3 dias, ao mesmo tempo em que substitui o meio de indução osteogênica no grupo de diferenciação osteogênica a cada 3 dias.
  3. Após 3-4 semanas, verifique se há deposição de cálcio preto nas células. Lave o poço com PBS três vezes por 5 min cada.
  4. Fixe as células em temperatura ambiente com paraformaldeído a 4% por 15 min e lave com PBS três vezes por 5 min cada. Adicione a solução de coloração vermelha de alizarina (1%) ao poço por 20 min em temperatura ambiente e depois descarte-a.
  5. Após secar por 30 min em temperatura ambiente, observe as células ao microscópio.

6. Diferenciação das células-tronco em neurônios

  1. Inocular as células de terceira geração 6 x 104/cm2 em placas de cultura de 24 poços, onde foram pré-colocadas lâminas de cobertura estéreis tratadas com L-polilisina. Coloque as folhas de escalada de células (consulte a Tabela de Materiais) nas placas de 24 poços para diferenciar as células em neurônios. Cultive as células nas folhas de escalada de células.
  2. Em seguida, adicione 500 μL de meio de cultura celular ao poço e substitua o meio de cultura celular por 500 μL de meio de indução neurogênica9 (ver Tabela de Materiais) após 24 h.
  3. Após indução por 24 h, adicione 10-7 mol/ L de ATRA e 10 ng/mL de bFGF (ver Tabela de Materiais) à solução para manter a diferenciação induzida de neurônios.
  4. Termine a indução quando sinapses celulares óbvias forem formadas. Verifique as sinapses celulares óbvias usando a técnica de microscopia (consulte a Tabela de Materiais).
    NOTA: A coloração por imunofluorescência foi usada para identificar marcadores específicos de neurônios de enolase específica de neurônios (NSE, ver Tabela de Materiais), que é um marcador de neurônios2.
  5. Realize imagens confocais nas folhas de escalada da célula.

7. Coloração de imunofluorescência

  1. Depois de descartar a solução de cultura de células, lave as células com 500 μL de PBS três vezes por 5 min cada.
  2. Em seguida, adicione 500 μL de paraformaldeído a 4% ao poço e fixe as células em temperatura ambiente por 45 min.
  3. Lave as células com PBS três vezes por 5 minutos cada.
  4. Permeabilize as células com 100 μL de Triton-X a 0,5% em temperatura ambiente por 5 min.
  5. Lave as células com 500 μL de PBS com 1% de BSA três vezes por 5 min cada.
  6. Incube as células com 500 μL de PBS com 3% de BSA e 0,1% de Triton X-100 por poço a 37 ° C por 45 min para bloquear o local de ligação inespecífico.
  7. Diluir o anticorpo primário contra NSE (1:100, ver Tabela de Materiais) com PBS (1:100) contendo 1% de BSA e 0,1% de Triton X-100 e incubar as células com o anticorpo primário durante a noite a 4 °C.
  8. Depois de descartar o anticorpo primário, lave as células com 500 μL de PBS contendo 1% de BSA três vezes por 5 minutos cada.
  9. Dilua o anticorpo secundário fluorescente (cabra Anti-Mouse IgG H & L, Alexa Fluor 488, consulte Tabela de Materiais) com PBS (1:200) contendo 1% de BSA e 0,1% de Triton X-100 a 1:200 e incube as células com o anticorpo secundário a 37 °C no escuro por 60 min.
  10. Lave as células com 500 μL de PBST (PBS contendo 0,1% de Tween-20) por poço três vezes no escuro por 5 min cada.
  11. Em seguida, adicione 200 μL de coloração DAPI (PBST diluído, 0,1 μg/mL) ao poço para corar o núcleo à temperatura ambiente sem luz por 5 min.
  12. Lave as células com 500 μL de PBST três vezes no escuro por 5 min cada.
  13. Adicione o agente de têmpera antifluorescência à lâmina e, em seguida, cubra suavemente a lâmina com uma lamínula. Adicione gotas de esmalte ao redor da tampa de vidro para fixá-la.
  14. Observe o vidro com um microscópio confocal a laser. Use as seguintes configurações de microscopia: canal verde com laser de 488 nm e canal DAPI com 405 nm.

8. Ensaio de proliferação

  1. Semeie 2 x 103 células por poço em placas de 96 poços. Adicione 100 μL de meio de cultura celular em cada poço.
  2. Adicione 10 μL de kit de contagem de células-8 (CCK-8, consulte a Tabela de Materiais) em cada poço.
  3. Após 2 dias de incubação, medir o valor de DO a 450 nm num leitor de microplacas nos dias 1-7.
  4. Analise os valores de OD dos diferentes tipos de células-tronco usando software estatístico (consulte a Tabela de Materiais) e apresente-os como meios ± SD. Realize a análise de variância (ANOVA) unidirecional. Considere o valor de P < 0,05 estatisticamente significativo.

Resultados

Isolamento e cultura de UCA-PSCs, UCV-PSCs e WJ-MSCs do cordão umbilical
As artérias umbilicais, a veia umbilical e a geléia de Wharton foram separadas mecanicamente do cordão umbilical e cortadas em 2-3 cm3 pedaços. A distância entre artérias, veias ou blocos de tecido gelatinoso de Wharton era de aproximadamente 1 cm, dispostos em forma de quincunce (Figura 1A-C). Os três tipos de cé...

Discussão

Este estudo isolou três tipos diferentes de células das artérias do cordão umbilical, veia e geléia de Wharton. O cordão umbilical foi resíduo de entrega, e seu uso foi simples, seguro e sem disputa ética5. As UC-MSCs são originais e têm forte capacidade de diferenciação1. Estudos anteriores mostraram que a quantidade de UC-MSCs isoladas de cordões umbilicais pelo método de digestão de colagenase, tripsina e hialuronidase nã...

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores desejam agradecer o apoio do Projeto de Pesquisa Básica do Departamento de Ciência e Tecnologia de Changzhou sob o número de concessão CJ20200110 (para YJY), da Fundação Nacional de Ciências da Natureza da China (82001629, XQS), do Programa Juvenil da Fundação de Ciências Naturais da Província de Jiangsu (BK20200116, XQS) e do Financiamento de Pesquisa de Pós-Doutorado da Província de Jiangsu (2021K277B, XQS).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Adipogenic differentiation kitGibcoA1007001Multidirectional differentiation
Alizarin red staining solutionSigmaA5533Multidirectional differentiation
Antibody against CD13Thermo Fisher ScientificMA1-12034flow analysis
Antibody against CD34BD Biosciences560942flow analysis
Antibody against CD45BD Biosciences561865flow analysis
Antibody against CD73BD Biosciences940294flow analysis
Antibody against HLA-DRBD Biosciences555560flow analysis
Anti-fluorescence quenching agentAbcamAB103748Immunofluorescence
Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)abcamab150113Multidirectional differentiation
ATRASTEMCELL Technologies302-79-4cell culture
bFGFGibco13256029Multidirectional differentiation
BSASigmaV900933Immunofluorescence
Cell incubatorThermo Fisher ScientificHERAcell 240icell culture
Cell-counting kit-8DojindoCK04cell proliferation
CentrifugeThermo Fisher ScientificSorvall™ MTX-150cell culture
DAPISigma10236276001Immunofluorescence
DMSOSigmaD1435cell culture
FBSGibco10099141cell culture
FITC Mouse Anti-Human IgGBD Biosciences560952flow analysis
Flow CytometerThermo Fisher ScientificA24864flow analysis
Fluorescence microscopeThermo Fisher ScientificIM-5flow analysis
GelatinSigma48722Multidirectional differentiation
Leica MicroscopeLeicaDM500Multidirectional differentiation
LG-DMEM mediumGibco11-885-084cell culture
Microplate readerThermo Fisher ScientificA51119500Ccell proliferation
Neurogenic inductionGibcoA1647801Multidirectional differentiation
Oil red O solutionSigmaO1516Multidirectional differentiation
Osteogenic inductionCyagenHUXXC-90021Multidirectional differentiation
ParaformaldehydeSangon Biotech30525-89-4Immunofluorescence
Pasteur pipetteBiosharpBS-XG-03Lcell culture
PBS (phosphate buffered saline)HycloneSH30256.LScell culture
Penicillin streptomycinHycloneSV30010cell culture
Primary antibody against NSESanta Cruz Biotechnologysc-292097Multidirectional differentiation
SPSS 22.0IBMSPSS 22.0Statistical analysis
The cell climbing sheetsCITOTEST Scientific80346-0910Multidirectional differentiation
TritonX-100Sangon Biotech9002-93-1Immunofluorescence
TrypsinGibco25300120cell culture

Referências

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