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  • Materiales
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Resumen

El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de células madre mesenquimales de las arterias del cordón umbilical, la vena y la jalea de Wharton.

Resumen

Las células madre mesenquimales del cordón umbilical (UC-MSC) son una fuente celular importante para la medicina regenerativa. Las UC-MSC pueden aislarse del cordón umbilical, así como de las arterias umbilicales y la vena umbilical. Se conocen como células madre perivasculares obtenidas de las arterias umbilicales (UCA-PSC), células madre perivasculares obtenidas de la vena umbilical (UCV-PSC) y células madre mesenquimales obtenidas de la jalea de Wharton (WJ-MSC). Las UCA-PSCs y las UCV-PSCs son pericitos derivados de regiones perivasculares que son progenitoras de las MSCs. El aislamiento y cultivo de los tres tipos de células es una fuente importante para el estudio del trasplante y la reparación de células madre. El presente protocolo se centra en el aislamiento y cultivo de células mediante separación mecánica, cultivo adherente y arrastre celular. A través de esta técnica, se pueden derivar los tres tipos diferentes de células madre. Los marcadores de superficie celular se detectaron mediante citometría de flujo. Se detectó el potencial de diferenciación multilinaje de las células madre mediante diferenciación adipogénica, osteogénica y de tipo neural, lo que es consistente con el fenotipo de las MSC. Este protocolo experimental expande la fuente de UC-MSCs. Además, el método de aislamiento celular proporciona una base para estudios posteriores de la medicina regenerativa y otras aplicaciones.

Introducción

Las células madre mesenquimales del cordón umbilical humano (UC-MSC) son ampliamente utilizadas en medicina regenerativa debido a su funcionamiento no invasivo, baja inmunogenicidad y falta de disputa ética1. En muchos estudios, las UC-MSCs aisladas de la jalea de Wharton (WJ) pueden adherirse a la pared, sufrir multidiferenciación y expresar marcadores de células madre mesenquimales (MSCs)2. Sin embargo, casi todas las MSC se originan en la región perivascular3. Los pericitos, como subconjunto de las células perivasculares, son células progenitoras de las MSCs4. Por lo tanto, las UC-MSCs pueden aislarse del cordón umbilical WJ, las arterias umbilicales (UCAs) y la vena umbilical (UCV), conocidas como UCA-PSCs, UCV-PSCs y WJ-MSCs, respectivamente5. Este método tenía como objetivo aislar y cultivar los tres tipos diferentes de células madre. El aislamiento y el cultivo de las UCA-PSC, UCV-PSC y WJ-MSC son muy importantes para proporcionar más fuentes de MSC.

El presente estudio describe el aislamiento, cultivo y aplicación futura de UCA-PSCs, UCV-PSCs y WJ-MSCs, las cuales tienen adhesión celular, expresan los marcadores de MSCs y tienen diferenciación multidireccional. Las células madre aisladas se observaron al microscopio y se sometieron a cultivo celular, paso celular, criopreservación celular y recuperación celular. La razón detrás del uso de esta técnica eran las células que se arrastraban fuera del tejido. En comparación con el método anterior, como la citometría de flujo o las técnicas de perlas inmunomagnéticas, que eran complejas y costosas6, las US-MSCs pueden ser aisladas masivamente por el método de separación adherente y rastreo celular; Estos fueron utilizados en el estudio previo5. Se realizó un análisis de citometría de flujo en las células madre derivadas para detectar si estas células expresan marcadores MSC. Se introdujo la diferenciación multidireccional de las células madre para detectar si los tres tipos de células tienen el potencial de diferenciarse en adipocitos, osteoblastos y neuroblastos. El aislamiento y el cultivo de tres tipos de células madre del cordón umbilical fueron importantes en el uso clínico y útiles para los investigadores para diversas aplicaciones futuras.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética en Investigación Clínica del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad de Soochow. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los sujetos humanos. Se incluyeron en el presente estudio individuos con parto vaginal a término o cesárea para obtener el cordón umbilical. El cordón umbilical proviene de recién nacidos sanos y sin sesgos de género. El neonato tuvo una puntuación de Apgar de 8-10. El puntaje de Apgar es una prueba rápida para los recién nacidos que se administra poco después de su nacimiento. Esta prueba verifica el tono muscular, la frecuencia cardíaca y otros signos del bebé para ver si se necesita atención médica adicional o de emergencia7. Por otro lado, se excluyeron del presente estudio los pacientes con enfermedades importantes, como corazón, hígado, riñón u otras enfermedades infecciosas.

1. Recolección de cordón umbilical humano

  1. Colocar el cordón umbilical del recién nacido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y transportarlo a 4 °C.
    NOTA: En el presente estudio se utilizaron tres cordones umbilicales de tres donantes.
  2. Extraer la sangre del cordón umbilical inmediatamente en condiciones estériles y cortar a lo largo del eje largo de los vasos sanguíneos en 20 cm del cordón umbilical. Separe los 20 cm apropiados de las arterias umbilicales y la vena, y retire la gelatina de Wharton de la superficie con cuidado.
    NOTA: Se obtuvieron cultivos de explantes de cada región, picados en trozos pequeños (1-2mm3) para evitar la contaminación cruzada entre los tres tipos de células madre.
  3. Corte las arterias umbilicales, la vena y la jalea de Wharton a un tamaño de 1-2mm3 e inocule en placas de cultivo celular de 100 mm. Realizar la inoculación de las arterias umbilicales, la vena y la jalea de Wharton con pinzas siguiendo un informe publicado anteriormente5. No recubra previamente las placas de cultivo de 100 mm.
    NOTA: El intervalo entre las arterias umbilicales, la vena o la jalea de Wharton fue de aproximadamente 1 cm. Un tiempo de recolección demasiado largo antes de separar las células puede afectar la viabilidad y la cantidad de células. Se recomienda separar las arterias y la vena del cordón umbilical inmediatamente. El tiempo de recogida fue de hasta 4 h.

2. Aislamiento y cultivo de UCA-PSC, UCV-PSC y WJ-MSCs

  1. Coloque las placas de cultivo celular boca abajo durante 3 h en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C para asegurar que las arterias umbilicales, la vena y el tejido gelatinoso de Wharton se adhieran firmemente a las placas de cultivo celular antes de añadir el medio de cultivo.
    1. Después de 3 h, vuelva a colocar las placas de cultivo celular en su posición normal. Añada 5 mL de medio de cultivo celular (LG-DMEM, FBS al 10%, 100 UI/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina, ver Tabla de Materiales) a la placa de cultivo celular.
  2. Añadir 3 mL y 2 mL del medio de cultivo en la placa de cultivo celular el3º y7º día de la primera semana, respectivamente. Tenga cuidado de no tocar los bloques de tejido de las arterias del cordón umbilical, las venas y la gelatina de Wharton.
  3. Cambie la mitad del medio líquido dos veces en la segunda semana y todo el medio líquido dos veces en la tercera semana.
  4. Observe las células que se arrastran fuera de los bloques de tejido aproximadamente 7 días después del cultivo, y luego deseche los bloques de tejido cuando las células estén fusionadas en un 80% a las ~ 2 semanas.
    1. Cuando las células estén fusionadas al 100%, pasarlas en una proporción de 1:3 con 2 mL de tripsina al 0,05% después de la centrifugación a 600 x g durante 4 min a temperatura ambiente.
      NOTA: Las células primarias aisladas de un cordón umbilical fueron aproximadamente 2 x 106 UCA-PSC, 1 x 106 UCV-PSC y 2 x 106 WJ-MSC. Las 2 x 106 UCA-PSCs, 1 x 106 UCV-PSCs y 2 x 106 WJ-MSCs se aislaron a partir de 20 cm de cordón umbilical. Las células se arrastraron hacia afuera en los tres cordones umbilicales, lo que indicó que los resultados entre aislamientos eran repetibles.
    2. Siembrar las células, manteniendo una concentración de 5 x 105/100cm2 en la placa de cultivo. Conserve las 5 x 105 células en 1 mL de solución de criopreservación (90% FBS, 10% DMSO). En el presente estudio se utilizaron celdas de tercer a quinto paso.

3. Detección de marcadores de superficie MSC por citometría de flujo

  1. Digiera las células de tercera generación con tripsina al 0,05% para obtener una suspensión unicelular. Centrifugar las células a 600 x g durante 4 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante celular con una pipeta Pasteur. A continuación, vuelva a suspender 1 x 105 células en 100 μL de PBS (1% de FBS). Evalúa el número de células contando las células con un hemocitómetro siguiendo un informe publicado anteriormente8.
  2. Incubar las células 1 x 105 con varios anticuerpos de ficoeritrina contra CD13 (FITC, 0,1 mg/mL), CD34 (FITC, 0,1 mg/mL), CD45 (FITC, 0,1 mg/mL), CD73 (FITC, 0,1 mg/mL) y HLA-DR (FITC, 0,1 mg/mL) en la oscuridad durante 30 minutos. Para los controles, incubar 1 x 105 células con FITC-IgG (FITC Mouse Anti-Human IgG, 0,1 mg/mL) (ver Tabla de Materiales).
  3. Centrifugar las células a 600 x g durante 4 min a temperatura ambiente y, a continuación, desechar el sobrenadante celular con una pipeta Pasteur. Vuelva a suspender 1 x 105 células en 500 μL de PBS (1% de FBS), detecte mediante citometría de flujo y analice mediante FlowJo2 (consulte la tabla de materiales).

4. Diferenciación de UCA-PSCs, UCV-PSCs y WJ-MSCs en adipocitos

  1. Inocular las células de tercera generación en placas de 24 pocillos a una densidad de 6 x 104 células/cm2 con 500 μL de medio celular (LG-DMEM, FBS al 10%, 100 UI/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina, ver Tabla de Materiales) por pocillo en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C.
  2. Cambie el medio celular después de 24 h y cambie el grupo de control a medio celular (LG-DMEM, FBS al 10%, 100 UI/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina). Realice los experimentos después de que las células estén fusionadas en un 80% en placas de 24 pocillos.
    NOTA: Las células de los grupos que indujeron la adipogénesis se cambiaron a un medio de inducción adipogénico (kit de diferenciación adipogénica, ver Tabla de Materiales). El medio de las células en ambos grupos se cambió cada 3 días.
  3. Observe las gotas de lípidos en las células aproximadamente 21 días después de la inducción en el grupo de inducción adipogénica y luego finalice la inducción adipogénica.
    NOTA: El medio adipogénico fue reemplazado por medio de cultivo celular para terminar la inducción adipogénica 2,5. Además, las células del grupo de control no mostraron cambios significativos.
  4. Lave las celdas tres veces con PBS durante 5 minutos y luego fije con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave las celdas tres veces con PBS durante 5 minutos cada una.
  5. Deseche el PBS y seque las celdas a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. A continuación, añada 500 μL de solución de aceite rojo O (0,5%) (ver Tabla de Materiales) al pozo durante 10 min.
  6. Retire la solución de aceite rojo O y lave las células con PBS tres veces durante 5 minutos cada una. Observa las células bajo un microscopio.

5. Diferenciación de las células madre en osteoblastos

  1. Coloque 500 μL de gelatina al 0,1% (ver Tabla de Materiales) por pocillo en placas de cultivo de 24 pocillos y deséchelo después de 30 min.
  2. Inocular 6 x 104/cm2 de células de tercera generación en placas de cultivo de 24 pocillos y añadir 500 μL de medio de cultivo celular o medio de inducción osteogénico (kit de diferenciación osteogénica, véase la tabla de materiales) a cada pocillo en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C. En el grupo de control, cambie el medio de cultivo celular cada 3 días, mientras que también reemplaza el medio de inducción osteogénico en el grupo de diferenciación osteogénica cada 3 días.
  3. Después de 3-4 semanas, verifique si hay depósitos de calcio negro en las células. Lave el pocillo con PBS tres veces durante 5 minutos cada una.
  4. Fije las celdas a temperatura ambiente con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos y lave con PBS tres veces durante 5 minutos cada una. Agregue la solución de tinción de rojo de alizarina (1%) al pocillo durante 20 minutos a temperatura ambiente y luego deséchela.
  5. Después de secar durante 30 minutos a temperatura ambiente, observe las células bajo un microscopio.

6. Diferenciación de las células madre en neuronas

  1. Inocular las células de tercera generación de 6 x 104/cm2 en placas de cultivo de 24 pocillos, donde se colocaron portaobjetos estériles tratados con L-polilisina. Coloque las láminas trepadoras de células (consulte la Tabla de materiales) en las placas de 24 pocillos para diferenciar las células en neuronas. Cultive las células en las láminas trepadoras de células.
  2. A continuación, añada 500 μL de medio de cultivo celular al pocillo y sustituya el medio de cultivo celular por 500 μL de medio de inducción neurogénica9 (véase la Tabla de Materiales) después de 24 h.
  3. Después de la inducción durante 24 h, añadir 10-7 mol/L de ATRA y 10 ng/mL de bFGF (ver Tabla de Materiales) a la solución para mantener la diferenciación inducida de las neuronas.
  4. Termina la inducción cuando se forman sinapsis celulares obvias. Verifique las sinapsis celulares obvias utilizando la técnica de microscopía (ver Tabla de Materiales).
    NOTA: La tinción de inmunofluorescencia se utilizó para identificar marcadores neuronales específicos de la enolasa neuronal específica (NSE, ver Tabla de materiales), que es un marcador de neuronas2.
  5. Realice imágenes confocales en las láminas trepadoras de celdas.

7. Tinción de inmunofluorescencia

  1. Después de desechar la solución de cultivo celular, lave las células con 500 μL de PBS tres veces durante 5 minutos cada una.
  2. A continuación, añada 500 μL de paraformaldehído al 4% al pocillo y fije las celdas a temperatura ambiente durante 45 min.
  3. Lave las celdas con PBS tres veces durante 5 minutos cada una.
  4. Permeabilizar las células con 100 μL de Triton-X al 0,5% a temperatura ambiente durante 5 min.
  5. Lave las células con 500 μL de PBS con BSA al 1% tres veces durante 5 minutos cada una.
  6. Incubar las células con 500 μL de PBS con 3% de BSA y 0,1% de Triton X-100 por pocillo a 37 °C durante 45 min para bloquear el sitio de unión inespecífico.
  7. Diluir el anticuerpo primario contra NSE (1:100, ver Tabla de Materiales) con PBS (1:100) que contenga 1% de BSA y 0,1% de Triton X-100, e incubar las células con el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C.
  8. Después de desechar el anticuerpo primario, lavar las células con 500 μL de PBS que contienen 1% de BSA tres veces durante 5 minutos cada una.
  9. Diluir el anticuerpo secundario fluorescente (goatat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488, ver Tabla de Materiales) con PBS (1:200) que contiene 1% de BSA y 0,1% de Triton X-100 a 1:200, e incubar las células con el anticuerpo secundario a 37 °C en la oscuridad durante 60 min.
  10. Lave las células con 500 μL de PBST (PBS que contiene 0,1% de Tween-20) por pocillo tres veces en la oscuridad durante 5 minutos cada una.
  11. A continuación, añada 200 μL de tinción con DAPI (PBST diluido, 0,1 μg/mL) al pocillo para teñir el núcleo a temperatura ambiente sin luz durante 5 min.
  12. Lave las células con 500 μL de PBST tres veces en la oscuridad durante 5 minutos cada una.
  13. Agregue el agente de enfriamiento antifluorescente al portaobjetos y luego cubra suavemente el portaobjetos con un cubreobjetos. Agrega gotas de esmalte de uñas alrededor del cubreobjetos para fijarlo.
  14. Observe el vidrio con un microscopio confocal láser. Utilice los siguientes ajustes de microscopía: canal verde con láser de 488 nm y canal DAPI con 405 nm.

8. Ensayo de proliferación

  1. Siembre 2 x 103 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Agregue 100 μL de medio de cultivo celular en cada pocillo.
  2. Agregue 10 μL del kit de conteo de células-8 (CCK-8, consulte la Tabla de materiales) en cada pocillo.
  3. Después de 2 días de incubación, mida el valor de OD a 450 nm en un lector de microplacas en los días 1 a 7.
  4. Analizar los valores de OD de los diferentes tipos de células madre utilizando software estadístico (ver Tabla de Materiales) y presentarlos como medios ± SD. Realizar análisis de varianza unidireccional (ANOVA). Considere que el valor de P < 0,05 es estadísticamente significativo.

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Resultados

Aislamiento y cultivo de UCA-PSCs, UCV-PSCs y WJ-MSCs del cordón umbilical
Las arterias umbilicales, la vena umbilical y la gelatina de Wharton se separaron mecánicamente del cordón umbilical y se cortaron entrozos de 2-3 cm 3. La distancia entre las arterias, las venas o los bloques de tejido gelatinoso de Wharton era de aproximadamente 1 cm, dispuestos en forma de quincuncio (Figura 1A-C)....

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Discusión

Este estudio aisló tres tipos diferentes de células de las arterias del cordón umbilical, la vena y la gelatina de Wharton. El cordón umbilical era un residuo de entrega, y su uso era sencillo, seguro y sin disputas éticas5. Las UC-MSC son originales y tienen una fuerte capacidad de diferenciación1. Estudios previos han demostrado que la cantidad de UC-MSCs aisladas de los cordones umbilicales por el método de digestión de colagenas...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer el apoyo del Proyecto de Investigación Básica de la Oficina de Ciencia y Tecnología de Changzhou bajo la subvención número CJ20200110 (a YJY), la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza de China (82001629, XQS), el Programa Juvenil de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (BK20200116, XQS) y la Financiación de Investigación Postdoctoral de la Provincia de Jiangsu (2021K277B, XQS).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Adipogenic differentiation kitGibcoA1007001Multidirectional differentiation
Alizarin red staining solutionSigmaA5533Multidirectional differentiation
Antibody against CD13Thermo Fisher ScientificMA1-12034flow analysis
Antibody against CD34BD Biosciences560942flow analysis
Antibody against CD45BD Biosciences561865flow analysis
Antibody against CD73BD Biosciences940294flow analysis
Antibody against HLA-DRBD Biosciences555560flow analysis
Anti-fluorescence quenching agentAbcamAB103748Immunofluorescence
Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)abcamab150113Multidirectional differentiation
ATRASTEMCELL Technologies302-79-4cell culture
bFGFGibco13256029Multidirectional differentiation
BSASigmaV900933Immunofluorescence
Cell incubatorThermo Fisher ScientificHERAcell 240icell culture
Cell-counting kit-8DojindoCK04cell proliferation
CentrifugeThermo Fisher ScientificSorvall™ MTX-150cell culture
DAPISigma10236276001Immunofluorescence
DMSOSigmaD1435cell culture
FBSGibco10099141cell culture
FITC Mouse Anti-Human IgGBD Biosciences560952flow analysis
Flow CytometerThermo Fisher ScientificA24864flow analysis
Fluorescence microscopeThermo Fisher ScientificIM-5flow analysis
GelatinSigma48722Multidirectional differentiation
Leica MicroscopeLeicaDM500Multidirectional differentiation
LG-DMEM mediumGibco11-885-084cell culture
Microplate readerThermo Fisher ScientificA51119500Ccell proliferation
Neurogenic inductionGibcoA1647801Multidirectional differentiation
Oil red O solutionSigmaO1516Multidirectional differentiation
Osteogenic inductionCyagenHUXXC-90021Multidirectional differentiation
ParaformaldehydeSangon Biotech30525-89-4Immunofluorescence
Pasteur pipetteBiosharpBS-XG-03Lcell culture
PBS (phosphate buffered saline)HycloneSH30256.LScell culture
Penicillin streptomycinHycloneSV30010cell culture
Primary antibody against NSESanta Cruz Biotechnologysc-292097Multidirectional differentiation
SPSS 22.0IBMSPSS 22.0Statistical analysis
The cell climbing sheetsCITOTEST Scientific80346-0910Multidirectional differentiation
TritonX-100Sangon Biotech9002-93-1Immunofluorescence
TrypsinGibco25300120cell culture

Referencias

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