3種類の臍帯間葉系幹細胞の単離と培養

要約

本プロトコルは、臍帯動脈、静脈、およびウォートンゼリーからの間葉系幹細胞の単離および培養について記述している。

要約

臍帯間葉系幹細胞(UC-MSC)は、再生医療の重要な細胞源です。UC-MSCは、ウォートンゼリーの臍帯から、また臍帯動脈や臍帯静脈からも単離することができます。これらは、臍帯動脈から得られる血管周囲幹細胞(UCA-PSC)、臍帯静脈から得られる血管周囲幹細胞(UCV-PSC)、ウォートンゼリーから得られる間葉系幹細胞(WJ-MSC)として知られています。UCA-PSCおよびUCV-PSCは、MSCの前駆細胞である血管周囲領域に由来する周皮細胞であり、3種類の細胞の単離と培養は、幹細胞の移植と修復を研究するための重要な情報源です。現在のプロトコルは、機械的分離、接着培養、および細胞の這い出すことによる細胞の単離と培養に焦点を当てています。この技術により、3種類の幹細胞を作製することができます。細胞表面マーカーはフローサイトメトリーによって検出されました。幹細胞は、脂肪形成性、骨形成性、および神経様分化による多系統分化能が検出され、これはMSCの表現型と一致しています。この実験的なプロトコルは、UC-MSCの供給源を拡大します。また、細胞単離法は、再生医療などのさらなる研究の基礎となるものです。

概要

ヒト臍帯間葉系幹細胞(UC-MSC)は、その非侵襲的な手術、免疫原性の低下、倫理的紛争の欠如から、再生医療で広く使用されています¹。多くの研究で、ウォートンゼリー(WJ)から単離されたUC-MSCは、壁に付着し、多分化を起こし、間葉系幹細胞(^MSC)のマーカーを発現することができます2。しかし、ほとんどすべてのMSCは血管周囲領域³に由来します。周皮細胞は、血管周囲細胞のサブセットとして、MSCの前駆細胞である⁴。したがって、UC-MSCは、臍帯WJ、臍帯動脈(UCA)、および臍帯静脈(UCV)から分離することができ、それぞれUCA-PSC、UCV-PSC、およびWJ-MSCとして知られています⁵。この方法は、3種類の幹細胞を分離して培養することを目的としています。UCA-PSC、UCV-PSC、およびWJ-MSCの単離と培養は、MSCの供給源を増やすために非常に重要です。

本研究では、細胞接着性を持ち、MSCのマーカーを発現し、多方向の分化を有するUCA-PSC、UCV-PSC、およびWJ-MSCの単離、培養、および将来の応用について説明します。単離された幹細胞を顕微鏡観察し、細胞培養、細胞継代、細胞凍結保存、および細胞回収を行いました。この技術を使用する根拠は、細胞が組織から這い出ることでした。フローサイトメトリーや免疫磁気ビーズ技術など、複雑^{で高価な従来の}方法6と比較して、US-MSCは接着分離および細胞クローリング法によって大規模に単離することができます。これらは^{以前の研究5}で使用されました。フローサイトメトリー分析を、これらの細胞がMSCマーカーを発現しているかどうかを検出するために、誘導された幹細胞に対して実行されました。幹細胞の多方向分化を導入し、3種類の細胞が脂肪細胞、骨芽細胞、神経芽細胞に分化する可能性があるかどうかを検出しました。臍帯からの3種類の幹細胞の単離と培養は、臨床使用において重要であり、研究者が将来の多様なアプリケーションに取り組むのに役立ちました。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

すべての実験手順は、東呉大学第三附属病院臨床研究倫理委員会によって承認されました。インフォームド 書面による同意は、人間の被験者から得られました。満期の経腟分娩または帝王切開を受けた個人は、臍帯を取得するために本研究に含まれました。臍帯は、性別の偏見のない健康な新生児から採取されます。新生児のアプガースコアは8-10でした。アプガースコアは、新生児が出生直後に行われる簡単なテストです。このテストでは、赤ちゃんの筋緊張、心拍数、およびその他の兆候をチェックして、追加の医療または救急医療が必要かどうかを確認します⁷。一方、心臓、肝臓、腎臓、その他の感染症などの主要な疾患の患者は、本研究から除外されました。

1.人間の臍帯の収集

1. 新生児の臍帯をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に入れ、4°Cで輸送します。
   注:本研究では、3人のドナーからの3つの臍帯が使用されました。
2. 無菌状態ですぐに臍帯血を採取し、臍帯の20cmで血管の長軸に沿って切断します。へその動脈と静脈の適切な20 cmを分離し、表面のウォートンゼリーを慎重に取り除きます。.
   注:外植片培養物は、3種類の幹細胞間の交差汚染を避けるために、各領域から採取し、小片(1〜2 mm³)に刻んだ。
3. 臍帯動脈、静脈、ウォートンゼリーを1〜^2mm3 の大きさに切り取り、100mmの細胞培養皿に接種します。以前に発表されたレポート⁵に従って、ピンセットを使用して臍帯動脈、静脈、およびウォートンゼリーの接種を行います。100 mmの培養プレートをプレコートしないでください。
   注:臍帯動脈、静脈、またはウォートンゼリーの間の間隔は約1cmでした。細胞を分離するまでの採取時間が長すぎると、細胞の生存率や量に影響を与える可能性があります。動脈と静脈をすぐに臍帯から分離することをお勧めします。収集時間は最大4時間でした。

2. UCA-PSC、UCV-PSC、WJ-MSCの単離と培養

1. 細胞培養皿を逆さまにして37°Cの5%_CO2 インキュベーターに3時間置き、臍帯動脈、静脈、およびウォートンゼリー組織が細胞培養皿にしっかりと付着してから培地を添加します。
   1. 3時間後、細胞培養皿を通常の配置に戻します。5 mLの細胞培養培地(LG-DMEM、10% FBS、100 IU/mLのペニシリン、および100 μg/mLのストレプトマイシン、 材料表を参照)を細胞培養皿に加えます。
2. 最初の週の3^日目 と^7日目に 、それぞれ3 mLと2 mLの培地を細胞培養皿に加えます。臍帯動脈の組織ブロック、静脈、ウォートンゼリーに触れないように注意してください。
3. 液体媒体の半分を2週目に2回交換し、液体培地全体を3週目に2回交換します。
4. 培養後約7日目に細胞が組織ブロックから這い出るのを観察し、~2週間で細胞が80%融合したら組織ブロックを廃棄します。
   1. 細胞が100%融合したら、600 x g で室温で4分間遠心分離した後、2 mLの0.05%トリプシンと1:3の割合で継代します。
      注:臍帯から単離された初代細胞は、約2 x 10⁶ UCA-PSC、1 x 10⁶ UCV-PSC、および2 x 10⁶ WJ-MSCでした。2 x 10⁶ UCA-PSC、1 x 10⁶ UCV-PSC、および2 x 10⁶ WJ-MSCは、20 cmの臍帯から単離されました。細胞は3つの臍帯すべてから這い出ており、単離間の結果が再現性があることを示しました。
   2. 培養皿中の5 x 10⁵/100 cm² の濃度を維持しながら、細胞に播種します。5 x 10⁵ 細胞を1 mLの凍結保存溶液(90% FBS、10% DMSO)で保存します。本研究では、3代目から5代目の細胞を使用しました。

3. フローサイトメトリーによるMSC表面マーカーの検出

1. 第3世代細胞を0.05%トリプシンで消化し、単一細胞懸濁液を得る。細胞を600 x g で室温で4分間遠心分離し、パスツールピペットを使用して細胞上清を廃棄します。次に、1 x 10⁵ 細胞を100 μLのPBS(1% FBS)に再懸濁します。以前に公開されたレポート⁸に従って、血球計算盤を使用して細胞をカウントすることにより、細胞数を評価します。
2. 1 x 10⁵ 細胞を、CD13(FITC、0.1 mg/mL)、CD34(FITC、0.1 mg/mL)、CD45(FITC、0.1 mg/mL)、CD73(FITC、0.1 mg/mL)、およびHLA-DR(FITC、0.1 mg/mL)に対するさまざまなフィコエリトリン抗体と混合して、暗所で30分間インキュベートします。コントロールとしては、1 x 10⁵ 細胞をFITC-IgG(FITC Mouse Anti-Human IgG, 0.1 mg/mL)とインキュベートします( 材料表を参照)。
3. 細胞を600 x g で室温で4分間遠心分離し、パスツールピペットを使用して細胞上清を廃棄します。1 x 10⁵ 細胞を500 μLのPBS(1% FBS)に再懸濁し、フローサイトメトリーで検出し、FlowJo² で解析します( 材料の表を参照)。

4. UCA-PSC、UCV-PSC、WJ-MSCの脂肪細胞への分化

1. 第3世代細胞を密度6 x 10⁴ 細胞/cm² の24ウェルプレートに、ウェルあたり500 μLの細胞培地(LG-DMEM、10% FBS、100 IU/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシン、材料 表を参照)を37°Cの5%_CO2 インキュベーターで接種します。
2. 24時間後に細胞培地を変更し、対照群を細胞培地(LG-DMEM、10%FBS、100IU/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシン)に変更します。細胞を24ウェルプレートで80%融合させた後、実験を行います。
   注:脂肪形成を誘導した群の細胞を脂肪形成誘導培地に変更した(脂肪形成分化キット、 材料の表を参照)。両群の細胞の培地は3日ごとに交換した。
3. 脂肪形成誘導群の誘導後約21日で細胞内の脂肪滴を観察し、その後、脂肪形成誘導を終了します。
   注:脂肪形成培地を細胞培養培地に置換して、脂肪形成誘導^2,5を終了させた。さらに、対照群の細胞は有意な変化を示さなかった。
4. 細胞をPBSで5分間3回洗浄した後、室温で4%パラホルムアルデヒドで15分間固定します。次に、細胞をPBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。
5. PBSを廃棄し、細胞を室温で約20分間乾燥させます。次に、500 μLのオイルレッドO溶液(0.5%)( 材料表を参照)をウェルに10分間加えます。
6. オイルレッドO溶液を除去し、細胞をPBSで3回、各5分間洗浄します。顕微鏡で細胞を観察します。

5. 幹細胞の骨芽細胞への分化

1. ウェルあたり500 μLの0.1%ゼラチン( 材料表を参照)を24ウェル培養プレートに入れ、30分後に廃棄します。
2. 第3世代細胞の6 x 10⁴/cm² を24ウェル培養プレートに接種し、500 μLの細胞培養培地または骨形成誘導培地(Osteogenic Differentiation Kit、 材料表を参照)を37°Cの5%_CO2 インキュベーターで各ウェルに加えます。 対照群では、細胞培養液を3日ごとに交換するとともに、骨形成分化群の骨形成誘導培地も3日ごとに交換します。
3. 3〜4週間後、細胞内に黒色カルシウムが沈着しているかどうかを確認します。PBSでウェルを3回、それぞれ5分間洗います。
4. 細胞を室温で4%パラホルムアルデヒドで15分間固定し、PBSで5分間ずつ3回洗浄します。アリザリン赤色染色液(1%)をウェルに室温で20分間加え、廃棄します。
5. 室温で30分間乾燥させた後、顕微鏡で観察してください。

6. 幹細胞のニューロンへの分化

1. 6 x 10⁴/cm² 第 3 世代細胞を 24 ウェル培養プレートに接種し、L-ポリリジンで処理した滅菌カバースライドを置換します。細胞クライミングシート( 材料の表を参照)を24ウェルプレートに置き、細胞をニューロンに分化させます。細胞クライミングシートで細胞を培養します。
2. 次に、500 μLの細胞培養培地をウェルに加え、24時間後に細胞培養培地を500 μLの神経原性誘導培地⁹ ( 材料表を参照)と交換します。
3. 24時間誘導した後、^10-7 mol/LのATRAと10 ng/mLのbFGF( 材料の表を参照)を溶液に加え、ニューロンの誘導分化を維持します。
4. 明らかな細胞シナプスが形成されたら、誘導を終了します。顕微鏡法を使用して明らかな細胞シナプスを確認します( 材料の表を参照)。
   注:免疫蛍光染色は、ニューロンのマーカーであるニューロン特異的エノラーゼ(NSE、材料の表を参照)のニューロン特異的マーカーを同定するために使用^{されました2。}
5. 細胞クライミングシート上で共焦点イメージングを行います。

7. 免疫蛍光染色

1. 細胞培養液を廃棄した後、細胞を500μLのPBSで5分間ずつ3回洗浄します。
2. 次に、500 μLの4%パラホルムアルデヒドをウェルに加え、細胞を室温で45分間固定します。
3. 細胞をPBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。
4. 0.5% Triton-X 100 μL で室温 5 分間、細胞を透過処理します。
5. 細胞を500 μL PBSと1% BSAで5分間ずつ3回洗浄します。
6. ウェルあたり3% BSAおよび0.1% Triton X-100を含む500 μLのPBSと細胞をインキュベートし、37°Cで45分間インキュベートし、非特異的結合部位をブロックします。
7. NSEに対する一次抗体(1:100、 材料表を参照)を1% BSAおよび0.1% Triton X-100を含むPBS(1:100)で希釈し、細胞を一次抗体と4°Cで一晩インキュベートします。
8. 一次抗体を廃棄した後、1% BSAを含むPBS500 μLで細胞を5分間ずつ3回洗浄します。
9. 蛍光二次抗体(ヤギ抗マウスIgG H&L、Alexa Fluor 488、 表を参照)を1% BSAおよび0.1% Triton X-100を含むPBS(1:200)で1:200で希釈し、2次抗体と37°Cの暗所で60分間インキュベートします。
10. ウェルあたり500 μLのPBST(0.1% Tween-20を含むPBS)で細胞を暗所で3回、各5分間洗浄します。
11. 次に、200 μL の DAPI 染色 (PBST 希釈、0.1 μg/mL) をウェルに加え、室温で光なしで 5 分間核を染色します。
12. 細胞を500 μLのPBSTで暗所で3回、それぞれ5分間洗浄します。
13. スライドに蛍光消光剤を添加し、スライドをカバーガラスでやさしく覆います。カバーガラスの周りにマニキュアの滴を追加して固定します。
14. レーザー共焦点顕微鏡でガラスを観察します。次の顕微鏡設定を使用します:488 nmレーザーのグリーンチャンネルと405 nmのDAPIチャンネル。

8. 増殖アッセイ

1. ウェルあたり2 x 10³ 個の細胞を96ウェルプレートに播種します。各ウェルに100 μLの細胞培養培地を加えます。
2. 10 μL の Cell-counting kit-8 (CCK-8、 材料表を参照) を各ウェルに加えます。
3. 2日間のインキュベーション後、1日目から7日目にマイクロプレートリーダーで450nmのOD値を測定します。
4. 統計ソフトウェア( 「Table of Materials」を参照)を使用して、さまざまな種類の幹細胞のOD値を分析し、それらをSD±平均値として提示します。一元配置分散分析(ANOVA)を実行します。0.05< P 値を統計的に有意であると考えてください。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

臍帯からのUCA-PSC、UCV-PSC、およびWJ-MSCの単離と培養
臍帯動脈、臍帯静脈、ウォートンゼリーを臍帯から機械的に分離し、2〜^3cm3個に切断しました。動脈、静脈、またはウォートンゼリー組織ブロック間の距離は約1 cmで、五分角状に配置されていました(図1A-C)。3種類の幹細胞を組織付着培養法

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

この研究では、臍帯動脈、静脈、ウォートンゼリーから3種類の細胞を分離しました。臍帯は分娩廃棄物であり、その使用は簡単で安全で、倫理的な問題がありませんでした⁵。UC-MSCは独創的で、強力な分化能力^{を持っています1}。これまでの研究では、コラゲナーゼ、トリプシン、およびヒアルロニダーゼ消化法によって臍帯から単...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adipogenic differentiation kit	Gibco	A1007001	Multidirectional differentiation
Alizarin red staining solution	Sigma	A5533	Multidirectional differentiation
Antibody against CD13	Thermo Fisher Scientific	MA1-12034	flow analysis
Antibody against CD34	BD Biosciences	560942	flow analysis
Antibody against CD45	BD Biosciences	561865	flow analysis
Antibody against CD73	BD Biosciences	940294	flow analysis
Antibody against HLA-DR	BD Biosciences	555560	flow analysis
Anti-fluorescence quenching agent	Abcam	AB103748	Immunofluorescence
Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	abcam	ab150113	Multidirectional differentiation
ATRA	STEMCELL Technologies	302-79-4	cell culture
bFGF	Gibco	13256029	Multidirectional differentiation
BSA	Sigma	V900933	Immunofluorescence
Cell incubator	Thermo Fisher Scientific	HERAcell 240i	cell culture
Cell-counting kit-8	Dojindo	CK04	cell proliferation
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Sorvall™ MTX-150	cell culture
DAPI	Sigma	10236276001	Immunofluorescence
DMSO	Sigma	D1435	cell culture
FBS	Gibco	10099141	cell culture
FITC Mouse Anti-Human IgG	BD Biosciences	560952	flow analysis
Flow Cytometer	Thermo Fisher Scientific	A24864	flow analysis
Fluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific	IM-5	flow analysis
Gelatin	Sigma	48722	Multidirectional differentiation
Leica Microscope	Leica	DM500	Multidirectional differentiation
LG-DMEM medium	Gibco	11-885-084	cell culture
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific	A51119500C	cell proliferation
Neurogenic induction	Gibco	A1647801	Multidirectional differentiation
Oil red O solution	Sigma	O1516	Multidirectional differentiation
Osteogenic induction	Cyagen	HUXXC-90021	Multidirectional differentiation
Paraformaldehyde	Sangon Biotech	30525-89-4	Immunofluorescence
Pasteur pipette	Biosharp	BS-XG-03L	cell culture
PBS (phosphate buffered saline)	Hyclone	SH30256.LS	cell culture
Penicillin streptomycin	Hyclone	SV30010	cell culture
Primary antibody against NSE	Santa Cruz Biotechnology	sc-292097	Multidirectional differentiation
SPSS 22.0	IBM	SPSS 22.0	Statistical analysis
The cell climbing sheets	CITOTEST Scientific	80346-0910	Multidirectional differentiation
TritonX-100	Sangon Biotech	9002-93-1	Immunofluorescence
Trypsin	Gibco	25300120	cell culture