شراء وإزالة الخلايا من الأطراف الخلفية للفئران باستخدام مفاعل حيوي قائم على التروية خارج الجسم الحي لزراعة الخيول المركبة الوعائية

Summary

وصفنا التقنية الجراحية وعملية إزالة الخلايا للأطراف الخلفية للفئران المركبة. يتم إجراء عملية إزالة الخلايا باستخدام كبريتات دوديسيل الصوديوم منخفضة التركيز من خلال نظام تروية آلة خارج الجسم الحي .

Abstract

يحتاج المرضى الذين يعانون من إصابات رضحية شديدة وفقدان الأنسجة إلى إعادة بناء جراحية معقدة. زرع الأوعية الدموية المركب (VCA) هو وسيلة ترميمية متطورة لنقل أنسجة متعددة كوحدة فرعية مركبة. على الرغم من الطبيعة الواعدة ل VCA ، فإن متطلبات مثبطات المناعة طويلة الأجل تمثل قيدا كبيرا بسبب زيادة خطر الإصابة بالأورام الخبيثة وسمية الأعضاء النهائية والالتهابات الانتهازية. تعد هندسة الأنسجة للسقالات المركبة اللاخلوية بديلا محتملا في تقليل الحاجة إلى كبت المناعة. هنا ، يتم وصف شراء الطرف الخلفي للفئران وإزالة الخلايا اللاحقة باستخدام كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS). تعتمد استراتيجية الشراء المقدمة على الشريان الفخذي المشترك. تم بناء نظام مفاعل حيوي قائم على التروية الآلية واستخدامه لإزالة الخلايا خارج الجسم الحي من الطرف الخلفي. تم إجراء عملية إزالة الخلايا بالتروية بنجاح ، مما أدى إلى ظهور أبيض شفاف يشبه الطرف الخلفي. لوحظت شبكة وعائية سليمة وقابلة للتنفيذ في جميع أنحاء الطرف الخلفي. أظهرت التحليلات النسيجية إزالة المحتويات النووية والحفاظ على بنية الأنسجة عبر جميع حجرات الأنسجة.

Introduction

VCA هو خيار ناشئ للمرضى الذين يحتاجون إلى إعادة بناء جراحية معقدة. تؤدي الإصابات الرضحية أو استئصال الورم إلى فقدان الأنسجة الحجمية التي قد يكون من الصعب إعادة بنائها. تقدم VCA زرع أنسجة متعددة مثل الجلد والعظام والعضلات والأعصاب والأوعية كطعم مركب من متبرع إلى متلقي¹. على الرغم من طبيعتها الواعدة ، فإن VCA محدودة بسبب الأنظمة المثبطة للمناعة طويلة الأجل. يؤدي استخدام هذه الأدوية مدى الحياة إلى زيادة خطر الإصابة بالعدوى الانتهازية والأورام الخبيثة وسمية الأعضاء النهائية¹،^2،3. للمساعدة في تقليل و / أو القضاء على الحاجة إلى كبت المناعة ، تظهر السقالات المهندسة للأنسجة باستخدام أساليب إزالة الخلايا ل VCA وعدا كبيرا.

يستلزم نزع الخلايا من الأنسجة الاحتفاظ بهيكل المصفوفة خارج الخلية مع إزالة المحتويات الخلوية والنووية. يمكن إعادة ملء هذه السقالة منزوعة الخلايا بخلايا خاصة بالمريض⁴. ومع ذلك ، فإن الحفاظ على شبكة ECM للأنسجة المركبة يمثل تحديا إضافيا. ويرجع ذلك إلى وجود أنواع متعددة من الأنسجة ذات كثافات الأنسجة المختلفة ، والبنى ، والمواقع التشريحية داخل السقالة. يقدم البروتوكول الحالي تقنية جراحية وطريقة إزالة الخلايا للطرف الخلفي للفئران. هذا نموذج إثبات المفهوم لتطبيق تقنية هندسة الأنسجة هذه على الأنسجة المركبة. يمكن أن يؤدي ذلك أيضا إلى بذل جهود لاحقة لتجديد الأنسجة المركبة من خلال إعادة الخلوية.

Protocol

تم استخدام ذكور جثة لويس الفئران (300-430 جم) التي تم الحصول عليها من معهد أبحاث مستشفى تورنتو العام لجميع التجارب. بالنسبة لجميع العمليات الجراحية ، تم استخدام أدوات ومستلزمات معقمة للحفاظ على تقنية التعقيم (انظر جدول المواد). تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية الصادرة عن لجنة رعاية الحيوان في معهد أبحاث مستشفى تورنتو العام ، شبكة الصحة الجامعية (تورنتو ، أونتاريو ، كندا). تم إزالة ما مجموعه أربعة أطراف خلفية.

1. التحضير قبل الجراحة

1. تحضير 50 مل من محلول ملحي هيبارين 5٪. من كيس ملحي سعة 50 مل ، أخرج 2.5 مل من محلول ملحي باستخدام حقنة سعة 5 مل وتخلص منها. باستخدام حقنة سعة 5 مل ، أضف 2.5 مل من الهيبارين إلى الكيس الملحي. اقلب الكيس الملحي لخلط محتوياته.
2. ضع فأرا جثة في وضع ضعيف تحت وسادة زرقاء. حلق الطرف الخلفي ومنطقة الفخذ بشكل محيطي باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية وإزالة الشعر.
3. أحضر الجرذ إلى المحطة الجراحية وقم بتطبيق محلول فرك اليود Povidone باستخدام شاش على الطرف الخلفي ومنطقة الفخذ. بعد ذلك ، ضع 70٪ من كحول الأيزوبروبيل لمسح محلول التنظيف باستخدام الشاش.
4. تخلص من الوسادة الزرقاء من الخطوة 1.2 وقم بتغييرها إلى قفازات جديدة معقمة.

2. شراء الأطراف الخلفية للفئران

1. قم بعمل شق جلدي باستخدام شفرة جراحية # 10 وعداء شفرة # 3 على طول مستوى الرباط الإربي ، والانتقال من الاتجاه الجانبي إلى الاتجاه الإنسي (الشكل 1 أ). استخدم ملقط Adson لتثبيت الجلد المحيط لضمان شق سلس.
2. عندما تتعرض الدهون الكامنة ، استخدم تشريح حاد لتشريح الدهون بعناية. حدد موقع الأوعية الشرسوفية العلوية.
3. استخدم المقص المجهري للتشريح القريب وكشف العصب الفخذي والشريان والوريد الأساسي على مستوى الرباط الإربي.
4. تحت مجهر التشريح ، حدد الأوعية الفخذية وقم بتشريح الشريان والوريد عن قرب باستخدام ملقط دقيق للحصول على طول كاف من نقاط التشعب في الشبكة الشريانية (الشكل 1 ب).
5. ربط الشريان الفخذي والوريد بشكل منفصل باستخدام 6-0 غرز.
6. إجراء تشريح محيطي حول ما تبقى من الطرف الخلفي دون تعطيل الأوعية الفخذية المربوطة.
7. انقل عظم الفخذ إلى منتصف الطول باستخدام قاطع العظام.
8. لعزل الطرف الخلفي بالكامل ، قم بنقل الأوعية الفخذية المربوطة أسفل الأربطة باستخدام مقص مصغر.
9. قنية الشريان الفخذي باستخدام قسطرة وعائية 24 G تحت مجهر التشريح. استخدم ملقط ناعم لإدخال القنية بعناية. اغسل بمحلول ملحي هيباريني حتى يلاحظ تدفق واضح من الوريد الفخذي.
10. قم بتأمين القنية عن طريق ربط خياطة واحدة حول الوعاء المقنن وخياطة أخرى بعيدا حول القنية نفسها. تأكد من وضع القنية بالقرب منها لمنع انسداد نقاط التشعب.
11. اغمر الأطراف الخلفية المشتراة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) حتى إزالة الخلايا.

الشكل 1: شراء الطرف الخلفي للفئران. (أ) وضع علامات على شق الجلد على مستوى الرباط الإربي من الجانبي إلى الإنسي. (ب) منظر للوريد الفخذي والشريان الفخذي، اللذين تم تشريحهما بالقرب من الرباط الأربي، المشار إليهما بالخط المنقط. الاختصارات: L = الجانبي. م = وسطي ؛ FV = الوريد الفخذي ؛ FA = الشريان الفخذي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. إعداد الحلول

1. في قارورة زجاجية سعة 6 لتر ، قم بإعداد خزان منظف سعة 5 لتر من كبريتات دوديسيل الصوديوم بنسبة 0.25٪ (SDS) عن طريق إذابة 12.5 جم من مسحوق SDS في 5 لتر من الماء المقطر عالي النقاء. قم بتغطية فتحة القارورة بالبارافيلم لإغلاقها.
2. في وعاء زجاجي سعة 1 لتر ، قم بإعداد 1 لتر من محلول SDS بنسبة 0.25٪ بشكل منفصل عن طريق إذابة 2.5 جم من SDS في 1 لتر من الماء المقطر عالي النقاء. أضف قضيب تقليب لخلط المحلول على محرك مغناطيسي حتى يذوب كل SDS.
3. تحضير 1 لتر من محلول غسيل 1x PBS بمحلول مضاد حيوي مضاد حيوي (AA) بنسبة 1٪. في دورق سعة 1 لتر ، أضف 990 مل من محلول 1x PBS و 10 مل من AA.
4. بشكل منفصل ، في وعاء زجاجي سعة 500 مل ، قم بإعداد محلول 1x PBS + 1٪ AA مرة أخرى باستخدام 495 مل من محلول 1x PBS و 5 مل من AA.
5. تحضير 200 مل من محلول حمض البيراسيتيك 1٪ (PAA) / 4٪ إيثانول (EtOH). تحضير هذا الحل تحت غطاء الدخان.

4. بناء المفاعل الحيوي ودائرة التروية

ملاحظة: راجع الشكل 2 لمعرفة تكوين المفاعل الحيوي ودائرة التروية خلال الخطوات المذكورة.

1. في غرفة سعة 500 مل (حاوية بلاستيكية) ، قم بحفر ثلاثة ثقوب (1/4 بوصة) في المواقع المحددة في الشكل 2: المنفذ A هو خط المدخل ، والمنفذ B هو خط التجديد ، والمنفذ C هو خط المخرج. قم بإزالة البلاستيك الزائد والتخلص منه. رش ومسح الغرفة مع 70 ٪ من الإيثانول.
2. قطع ثلاثة أنابيب سيليكون بطول 5 سم وأدخل واحدة في منتصف الطريق في كل منفذ من الغرفة. قم بتوصيل موصل Luer ذكر على فتحة المنفذ A المواجه للداخل من الغرفة وموصل Luer أنثى على الطرف الآخر من الأنبوب خارج الغرفة.
3. قم بتوصيل موصل Luer أنثى في المنفذ B والمنفذ C على طرفي الأنابيب المواجهة للخروج من الغرفة.
4. في غطاء محكم الغلق للحاوية البلاستيكية ، احفر ثقبا واحدا على سطح الغطاء.
5. قطع أنبوب سيليكون 3 سم وأدخله في فتحة الغطاء. تأكد من وجود حوالي 2 سم من الأنبوب خارج الغطاء ، كما هو موضح في الشكل 2.
6. تعقيم كل من الغرفة والغطاء مع الأنابيب.
7. قطع اثنين من أنابيب السيليكون 30 سم باستخدام مقص. قم بتوصيل 1/16 بوصة بموصل 1/8 بوصة على أحد طرفي كل أنبوب.
8. بشكل منفصل ، قم بقطع أنبوبين سيليكون مقاس 12 سم باستخدام مقص. قم بتوصيل 1/16 بوصة بموصل 1/8 بوصة على أحد طرفي كلا الأنبوبين. قم بتوصيل موصل Luer ذكر على الطرف الآخر من أنبوب واحد وموصل Luer أنثى بالأنبوب الآخر.
9. تعقيم جميع مواد الأنابيب من الخطوة 4.7 والخطوة 4.8. قم بتضمين أنبوبي مضخة 3 توقفات (1.85 مم) في التعقيم.
10. قم بإعداد ثلاث محبس ثلاثية الاتجاهات ، ومرشح حقنة واحد ، واثنين من الماصات المصلية سعة 1 مل ، وحقنة واحدة سعة 10 مل لإعداد إزالة الخلايا. قم بإزالة الفلتر من الماصات المصلية سعة 1 مل.

الشكل 2: تحضير بناء المفاعل الحيوي ودائرة التروية. الجهاز الموضح لدائرة التروية بما في ذلك (أ) المضخة التمعجية و (ب) الكاسيتات المقابلة لكل من خطوط المدخل والمخرج. (ج، د) يتم أيضا عرض أنابيب السيليكون مقاس 12 سم و 30 سم مع الموصلات المعنية. (ه) أنابيب للمضخة التمعجية (1.85 مم). غرفة المفاعل الحيوي مع منافذ موسومة ل (F) التدفق ، (G) منفذ التجديد ، و (H) التدفق الخارجي. (I) غطاء المفاعل الحيوي الموضح مع منفذ التهوية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

5. إزالة الخلايا من الأطراف الخلفية الفئران

1. ضع الحجرة المعقمة والمسمار على ثلاث محبس ثلاثية الاتجاهات للاستخدام مرة واحدة عند المدخل والمخرج وخطوط التجديد. تأكد من أن محبس القفل الخاص بمنفذ التجديد مغطى بالمنفذين المتبقيين لمنع التسرب.
2. قم بتوصيل الأنابيب المصنوعة في الخطوة 4.8 بمحبس عند خطوط المدخل والمخرج.
3. قم بتوصيل الأنابيب التمعجية بالأنابيب في الخطوة أعلاه. ثبت الكاسيت على الأنبوب التمعجي وضعه على المضخة التمعجية. لا تقم بتأمين الكاسيت مع وجود الأنابيب في مكانها حتى الآن.
4. قم بتوصيل أنبوب واحد من الخطوة 4.7 بنهاية الأنبوب التمعجي لخط المخرج من الخطوة أعلاه. قم بتوصيل ماصة مصلية سعة 1 مل على الطرف الآخر. النهاية المرفقة بماصة مصلية في قارورة خزان النفايات.
5. كرر الخطوة 4.7 لخط المدخل. نهاية الأنبوب المتصل بالماصة المصلية في خزان المنظفات. أغلق فتحة قارورة خزان المنظفات باستخدام البارافيلم على الفور. انظر الشكل 3 أ ، ب للحصول على نظرة عامة على دائرة إزالة الخلايا.
6. أضف 0.25٪ SDS من الجرة الزجاجية سعة 1 لتر (الخطوة 3.2) إلى غرفة المفاعل الحيوي على مستوى منتصف الطريق.
7. خذ الطرف الخلفي الذي تم شراؤه باستخدام ملقط Adson وقم بتعليقه في غرفة المفاعل الحيوي بعناية.
8. استخدم زوجين من ملقط Adson لتوجيه الجزء المقنن من الطرف الخلفي إلى خط المدخل. أثناء إمساك القنية بزوج واحد من الملقط ، استخدم الزوج الآخر من الملقط للف وتأمين خط المدخل إلى القنية. تأكد من عدم سحب القنية أو لفها لمنع التفكيك.
9. بمجرد تأمينه ، أضف المزيد من SDS بنسبة 0.25٪ من البرطمان الزجاجي سعة 1 لتر لغمر الطرف بالكامل ، حسب الحاجة. تأكد من غمر منفذ المخرج أيضا في خزان المفاعل الحيوي لضمان الحفاظ على التدفق الخارجي المتسق (الشكل 3C).
10. قم بتوصيل مرشح حقنة يستخدم مرة واحدة بمنفذ التهوية الموجود على غطاء غرفة المفاعل الحيوي ، مع الإشارة إلى الخطوة 4.4 والخطوة 4.5.
11. قم بتأمين غطاء المفاعل الحيوي وتأكد من إغلاق الغرفة من جميع الجوانب (الشكل 3 ب).
12. لإزالة الهواء من الأنابيب وتجهيز دائرة التروية ، استخدم حقنة جديدة سعة 10 مل تستخدم مرة واحدة لسحب المنظف من خزان المنظف باستخدام محبس ثلاثي الاتجاهات عند خط المدخل.
13. بمجرد السحب ، استخدم نفس السائل لإدخاله في محبس 3 اتجاهات عند خط المخرج. تأكد من وجود منظف في جميع أنحاء الأنبوب في كل من خطوط المدخل والمخرج.
14. اضغط لأسفل وقم بتأمين الكاسيت بالأنبوب في المضخة التمعجية. قم بتشغيل المضخة التمعجية باستخدام زر الطاقة.
    1. على شاشة المضخة التمعجية ، انتقل إلى علامة التبويب الثانية باستخدام مفتاح السهم لتعيين معدل الإرواء للقناة الأولى. معدل تدفق الإدخال كطريقة التسليم وضبط معدل التروية على 1 مل / دقيقة. تأكد من صحة اتجاه التدفق وفقا لإعداد الجهاز. كرر للقناة الثانية.
    2. قم بمعايرة المضخة التمعجية لضمان تدفق كمية السائل التي يتم توصيلها عبر خط المدخل و / أو المأخوذة من خط المخرج بمعدل ثابت بين الاثنين. تأكد من ضبط معرف الأنبوب على 1.85 مم.
15. ابدأ عملية إزالة الخلايا عبر التروية الآلية بمعدل 1 مل / دقيقة لكل من خطوط المدخل والمخرج عن طريق الضغط على زر الطاقة على لوحة المفاتيح. راقب وتأكد من أن التدفق متسق ومستمر في كل من خطوط المدخل والمخرج.
16. استمر في إزالة الخلايا والمراقبة يوميا. استخدم 1 لتر من 0.25٪ SDS (الخطوة 3.2) لتجديد خزان المفاعل الحيوي من خلال منفذ التجديد ، حسب الحاجة. ابحث عن مظهر أبيض شفاف للأنسجة ، والذي سيظهر بحلول اليوم 5 ، مما يشير إلى إزالة الخلايا من الأطراف الخلفية للفئران.

الشكل 3: نظرة عامة على دائرة المفاعل الحيوي لإزالة الخلايا من الطرف الخلفي للفئران . (أ) تمثيل تخطيطي لدائرة تروية المفاعل الحيوي. تشير الأسهم الزرقاء إلى اتجاه تدفق المنظفات والنفايات. (ب) نظرة عامة على دائرة نزع الخلايا مع مفاعل حيوي يحتوي على الطرف الخلفي للفئران. يؤدي خزان SDS (القارورة اليسرى) إلى المضخة التمعجية وإلى أنبوب مدخل المفاعل الحيوي. يتم توصيل التدفق الخارجي بخزان النفايات (القارورة اليمنى) من خلال المضخة التمعجية. (ج) (ط) مفاعل حيوي يحتوي على طرف خلفي للفئران مع أنبوب مدخل متصل بالشريان الفخذي المقنن. (II) منفذ التجديد الموجود في الزاوية لتزويد المنظفات. (III) أنابيب التدفق معلقة في خزان التعليق. اختصار: SDS = كبريتات دوديسيل الصوديوم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

6. الغسيل والتعقيم بعد إزالة الخلايا

1. بعد تأكيد إزالة الخلايا ، استبدل خزان المنظفات بخزان 1x PBS + 1٪ AA. ختم فتح القارورة مع بارافيلم. ابدأ 1x PBS + 1٪ نضح AA بمعدل 1 مل / دقيقة واستمر لمدة يومين.
2. استبدل خزان 1x PBS + 1٪ AA ب 200 مل من خزان 0.1٪ PAA / 4٪ EtOH وابدأ التروية عند 1 مل / دقيقة لمدة 2 ساعة.
3. افصل الطرف الخلفي عن خط المدخل باستخدام زوجين من ملقط Adson المعقم ، مع زوج واحد من الملقط للف خط المدخل والآخر يحمل القنية. تأكد من عدم سحب القنية لمنع التفكيك.
4. قم بتخزين الطرف في وعاء زجاجي سعة 500 مل يحتوي على 1x PBS + 1٪ AA عند 4 درجات مئوية حتى يتم استخدامه مرة أخرى.

النتائج

كان بروتوكول الشراء ناجحا في عزل الشرايين الفخذية المشتركة وتفريغها لخطوات التروية اللاحقة. تظهر صور التشريح التمثيلية في الشكل 1 أ ، ب موقع الشق وتعرض الأوعية الفخذية بمسافة كافية من نقاط التشعب. يوضح الشكل 2 الجهاز المطلوب لإعداد المفاعل الحيوي ...

Discussion

الأطراف الخلفية للفئران مفيدة كنماذج تجريبية في VCA⁵. تمثل هندسة الأنسجة للسقالات اللاخلوية الخطوة الأولى في معالجة أوجه القصور في أنظمة كبت المناعة طويلة الأجل المرتبطة ب VCA. يشكل استخدام الطعوم المركبة تحديا إضافيا نظرا لوجود أنسجة متعددة ، لكل منها خصائص وظيفية ومناعية وهي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL	Baxter Corporation	JB1308M
1 mL Disposable Serological Pipets	VWR	75816-102
10 cc Disposable Syringes			Obtained from Research Institution
3-way Stopcock			Obtained from Research Institution
5cc Disposable Syringes			Obtained from Research Institution
70% Isopropyl Alcohol			Obtained from Research Institution
Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm	VWR	CA28143-310
Adson Forceps, Straight	Fine Science Tools	11006-12
Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”)	VWR	38112
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL	Multicell	450-115-EL
Bone Cutter	Fine Science Tools	12029-12
Connectors for  1/16" to 1/8" Tubes	McMasterCarr	5117K52
Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID	McMasterCarr	51525K328
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fine Forceps with Micro-Blunted Tips	Fine Science Tools	11253-20
Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL	LEO Pharma Inc.	006174-09
Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID	McMasterCarr	51525K322
Micro Needle Holder	WLorenz	04-4125
Microscissors	WLorenz	SP-4506
Peracetic Acid	Sigma Aldrich	269336-100ML
Peristaltic Pump, 3-Channel	Cole Parmer	RK-78001-68
Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL	Wisent	311-425-CL
Povidone Surgical Scrub Solution			Obtained from Research Institution
Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL	Cole Parmer	RK-96450-40
Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone	Cole Parmer	RK-96410-16
Scalpel Blade - #10	Fine Science Tools	10010-00
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg	Bioshop	SDS003.1
Surgical Suture #6-0	Covidien	VS889