Obtention et décellularisation de membres postérieurs de rat à l’aide d’un bioréacteur ex vivo basé sur la perfusion pour l’allotransplantation composite vascularisée

Résumé

Nous décrivons la technique chirurgicale et le processus de décellularisation des membres postérieurs composites du rat. La décellularisation est réalisée à l’aide de dodécylsulfate de sodium à faible concentration à l’aide d’un système de perfusion machine ex vivo .

Résumé

Les patients présentant des lésions traumatiques graves et une perte de tissu nécessitent une reconstruction chirurgicale complexe. L’allotransplantation composite vascularisée (ACV) est une voie reconstructive évolutive pour le transfert de plusieurs tissus en tant que sous-unité composite. Malgré la nature prometteuse de l’ACV, les besoins immunosuppresseurs à long terme constituent une limitation importante en raison du risque accru de tumeurs malignes, de toxicité pour les organes terminaux et d’infections opportunistes. L’ingénierie tissulaire des échafaudages composites acellulaires est une alternative potentielle pour réduire le besoin d’immunosuppression. Ici, l’obtention d’un membre postérieur de rat et sa décellularisation ultérieure à l’aide de dodécylsulfate de sodium (SDS) sont décrites. La stratégie d’approvisionnement présentée est basée sur l’artère fémorale commune. Un système de bioréacteur à perfusion automatique a été construit et utilisé pour la décellularisation ex vivo du membre postérieur. Une décellularisation réussie de la perfusion a été réalisée, ce qui a donné un aspect blanc translucide du membre postérieur. Un réseau vasculaire intact et perfusable dans tout le membre postérieur a été observé. Les analyses histologiques ont montré l’élimination du contenu nucléaire et la préservation de l’architecture tissulaire dans tous les compartiments tissulaires.

Introduction

L’AVC est une option émergente pour les patients nécessitant une reconstruction chirurgicale complexe. Les lésions traumatiques ou les résections tumorales entraînent une perte de tissu volumétrique qui peut être difficile à reconstruire. VCA offre la transplantation de plusieurs tissus tels que la peau, les os, les muscles, les nerfs et les vaisseaux sous forme de greffe composite d’un donneur à un receveur¹. Malgré sa nature prometteuse, l’ACV est limitée en raison des régimes immunosuppresseurs à long terme. L’utilisation à vie de ces médicaments augmente le risque d’infections opportunistes, de tumeurs malignes et de toxicité pour les organes terminaux ^1,2,3. Pour aider à réduire et / ou éliminer le besoin d’immunosuppression, les échafaudages d’ingénierie tissulaire utilisant des approches de décellularisation pour VCA sont très prometteurs.

La décellularisation tissulaire consiste à conserver la structure de la matrice extracellulaire tout en éliminant le contenu cellulaire et nucléaire. Cet échafaudage décellularisé peut être repeuplé avec des cellules spécifiques au patient⁴. Cependant, la préservation du réseau ECM de tissus composites est un défi supplémentaire. Cela est dû à la présence de plusieurs types de tissus avec des densités, des architectures et des emplacements anatomiques variables dans un échafaudage. Le présent protocole propose une technique chirurgicale et une méthode de décellularisation pour un membre postérieur de rat. Il s’agit d’un modèle de preuve de concept pour appliquer cette technique d’ingénierie tissulaire aux tissus composites. Cela peut également inciter à des efforts ultérieurs pour régénérer les tissus composites par recellularisation.

Protocole

Des rats Lewis mâles cadavériques (300 à 430 g) obtenus de l’Institut de recherche de l’Hôpital général de Toronto ont été utilisés pour toutes les expériences. Pour toutes les interventions chirurgicales, des instruments et des fournitures stériles ont été utilisés pour maintenir la technique aseptique (voir le tableau des matériaux). Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux lignes directrices du Comité de protection des animaux de l’Institut de recherche de l’Hôpital général de Toronto, Réseau universitaire de santé (Toronto, ON, Canada). Au total, quatre membres postérieurs ont été décellularisés.

1. Préparation préchirurgicale

1. Préparer 50 ml de solution saline héparinée à 5 %. Dans un sac de solution saline de 50 mL, prélever 2,5 mL de solution saline à l’aide d’une seringue de 5 ml et jeter. À l’aide d’une seringue de 5 mL, ajouter 2,5 mL d’héparine dans le sac salin. Retourner le sac salin pour mélanger son contenu.
2. Placez un rat cadavérique en décubitus dorsal sous un coussin bleu. Rasez circonférentiellement le membre postérieur et l’aine à l’aide d’un rasoir électrique et enlevez les poils.
3. Amenez le rat au poste chirurgical et appliquez la solution de gommage à l’iode de povidone à l’aide d’une gaze sur le membre postérieur et la région de l’aine. Par la suite, appliquez de l’alcool isopropylique à 70% pour essuyer la solution de gommage à l’aide de gaze.
4. Jetez le tampon bleu de l’étape 1.2 et changez-le en nouveaux gants stériles.

2. Obtention de membres postérieurs de rat

1. Faites une incision cutanée à l’aide d’une lame chirurgicale #10 et d’un glisseur de lame #3 le long du ligament inguinal, en passant d’une direction latérale à une direction médiale (Figure 1A). Utilisez des pinces Adson pour maintenir la peau environnante afin d’assurer une incision en douceur.
2. Lorsque la graisse sous-jacente est exposée, utilisez une dissection émoussée pour disséquer soigneusement la graisse. Localisez les vaisseaux épigastriques supérieurs.
3. Utilisez des microciseaux pour disséquer proximally et exposer le nerf fémoral sous-jacent, l’artère et la veine au niveau du ligament inguinal.
4. Au microscope à dissection, identifier les vaisseaux fémoraux et disséquer l’artère et la veine de façon proximale à l’aide de pinces fines pour obtenir une longueur suffisante à partir des points de bifurcation du réseau artériel (figure 1B).
5. Litruer l’artère fémorale et la veine séparément à l’aide de sutures 6-0.
6. Effectuer une dissection circonférentielle autour du reste du membre postérieur sans perturber les vaisseaux fémoraux ligaturés.
7. Transecter l’os fémoral à mi-longueur à l’aide d’un coupe-os.
8. Pour isoler complètement le membre postérieur, transectez les vaisseaux fémoraux ligaturés sous les ligatures à l’aide de microciseaux.
9. Canuler l’artère fémorale à l’aide d’un angiocathéter de 24 G au microscope à dissection. Utilisez une pince fine pour insérer la canule avec précaution. Rincer avec une solution saline héparinée jusqu’à ce que l’écoulement de la veine fémorale soit clair.
10. Fixez la canule en attachant une suture autour du récipient canulé et une autre suture distalement autour de la canule elle-même. Assurez-vous que la canule est placée à proximité pour éviter de bloquer les points de bifurcation.
11. Immerger les membres postérieurs obtenus dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) jusqu’à la décellularisation.

Figure 1 : Prélèvement d’un membre postérieur de rat. (A) Marquage de l’incision cutanée au niveau du ligament inguinal du latéral au médial. (B) Vue de la veine fémorale et de l’artère fémorale, qui ont été disséquées proximale vers le ligament inguinal, indiquée par la ligne pointillée. Abréviations : L = latéral; M = médiane; FV = veine fémorale; FA = artère fémorale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Préparation des solutions

1. Dans une fiole en verre de 6 L, préparer un réservoir de détergent de 5 L de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 0,25 % en dissolvant 12,5 g de poudre de SDS dans 5 L d’eau distillée ultrapure. Couvrir l’ouverture de la fiole avec un parafilm pour la sceller.
2. Dans un bocal en verre de 1 L, préparer 1 L de solution de SDS à 0,25% séparément en dissolvant 2,5 g de SDS dans 1 L d’eau distillée ultrapure. Ajouter une barre d’agitation pour mélanger la solution sur un agitateur magnétique jusqu’à ce que toute la FDS soit dissoute.
3. Préparer 1 L de 1x solution de lavage PBS avec 1% Solution Antimycotique (AA) antibiotique. Dans une fiole de 1 L, ajouter 990 mL de 1x solution de PBS et 10 mL d’AA.
4. Séparément, dans un bocal en verre de 500 mL, préparer à nouveau 1x PBS + 1% de solution AA en utilisant 495 mL de 1x solution de PBS et 5 mL d’AA.
5. Préparer 200 mL de solution d’acide peracétique (AAP) à 1 % et d’éthanol à 4 % (EtOH). Préparez cette solution sous une hotte.

4. Construction de bioréacteurs et de circuits de perfusion

REMARQUE : Reportez-vous à la figure 2 pour connaître la configuration du bioréacteur et du circuit de perfusion tout au long des étapes indiquées.

1. Dans une chambre de 500 ml (contenant en plastique), percez trois trous (1/4 po) aux emplacements indiqués à la figure 2 : Le port A est la ligne d’entrée, le port B est la ligne de réapprovisionnement et le port C est la ligne de sortie. Retirez et jetez l’excès de plastique. Vaporiser et essuyer la chambre avec de l’éthanol à 70%.
2. Coupez trois tubes en silicone de 5 cm de long et insérez-en un à mi-chemin dans chaque orifice de la chambre. Connectez un connecteur Luer mâle sur l’ouverture du port A face à l’intérieur de la chambre et un connecteur Luer femelle à l’autre extrémité du tube à l’extérieur de la chambre.
3. Connectez un connecteur Luer femelle aux ports B et C aux extrémités des tubes orientés vers l’extérieur de la chambre.
4. Dans un couvercle hermétique pour le récipient en plastique, percez un trou sur la surface du couvercle.
5. Coupez un tube en silicone de 3 cm et insérez-le dans le trou du couvercle. Assurez-vous qu’environ 2 cm du tube sont situés hors du couvercle, comme le montre la figure 2.
6. Stérilisez la chambre et le couvercle avec le tube.
7. Couper deux tubes en silicone de 30 cm à l’aide de ciseaux. Connectez un 1/16 in à un connecteur 1/8 in à une extrémité de chaque tube.
8. Couper séparément deux tubes en silicone de 12 cm à l’aide de ciseaux. Connectez un 1/16 in à un connecteur 1/8 in à une extrémité des deux tubes. Connectez un connecteur Luer mâle à l’autre extrémité d’un tube et un connecteur Luer femelle à l’autre tube.
9. Stériliser tout le matériau de tubulure des étapes 4.7 et 4.8. Inclure deux tubes de pompe à 3 arrêts (1,85 mm) dans la stérilisation.
10. Préparez trois robinets d’arrêt à 3 voies, un filtre à seringue, deux pipettes sérologiques de 1 ml et une seringue de 10 ml pour la configuration de la décellularisation. Retirez le filtre des pipettes sérologiques de 1 mL.

Figure 2 : Préparation du bioréacteur et construction du circuit de perfusion. Appareil représenté du circuit de perfusion comprenant (A) pompe péristaltique et (B) cassettes correspondantes pour les conduites d’entrée et de sortie. (C, D) Des tubes en silicone de 12 cm et 30 cm sont également présentés avec les connecteurs respectifs. E) Tubes pour pompe péristaltique (1,85 mm). Chambre du bioréacteur avec orifices marqués pour (F) l’entrée, (G) l’orifice de réapprovisionnement et (H) l’écoulement sortant. (I) Couvercle du bioréacteur avec orifice de ventilation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Décellularisation des membres postérieurs du rat

1. Placez la chambre stérilisée et vissez sur trois robinets d’arrêt à 3 voies à usage unique au niveau des conduites d’entrée, de sortie et de réapprovisionnement. Assurez-vous que le robinet d’arrêt de l’orifice de réapprovisionnement est bouché à ses deux orifices restants pour éviter les fuites.
2. Fixer les tubes fabriqués à l’étape 4.8 aux robinets d’arrêt aux lignes d’entrée et de sortie.
3. Connectez le tube péristaltique aux tubes à l’étape ci-dessus. Fixez la cassette sur le tube péristaltique et placez-la sur la pompe péristaltique. Ne fixez pas encore les cassettes avec le tube en place.
4. Connectez un tube de l’étape 4.7 à l’extrémité du tube péristaltique de la ligne de sortie à partir de l’étape supérieure. Branchez une pipette sérologique de 1 mL à l’autre extrémité. Suspendre l’extrémité fixée à l’aide d’une pipette sérologique dans la fiole du réservoir de déchets.
5. Répétez l’étape 4.7 pour la ligne d’entrée. Suspendre l’extrémité du tube fixé à la pipette sérologique dans le réservoir de détergent. Sceller immédiatement l’ouverture du flacon réservoir de détergent avec un parafilm. Voir la figure 3A,B pour un aperçu du circuit de décellularisation.
6. Ajouter 0,25 % de SDS du bocal en verre de 1 L (étape 3.2) dans la chambre du bioréacteur à mi-chemin.
7. Prenez le membre postérieur procuré à l’aide d’une pince Adson et suspendez-le soigneusement dans la chambre du bioréacteur.
8. Utilisez deux paires de pinces Adson pour guider la partie canulée du membre postérieur jusqu’à la ligne d’entrée. Tout en tenant la canule avec une paire de pinces, utilisez l’autre paire de pinces pour tordre et fixer la conduite d’entrée à la canule. Assurez-vous que la canule n’est pas tirée ou tordue pour empêcher la décanulation.
9. Une fois fixé, ajoutez plus de FDS à 0,25% du bocal en verre de 1 L pour submerger complètement le membre, au besoin. S’assurer que l’orifice de sortie est également immergé dans le réservoir du bioréacteur pour s’assurer que le débit sortant constant est maintenu (figure 3C).
10. Fixer un filtre à seringue à usage unique à l’orifice de ventilation situé sur le couvercle de la chambre du bioréacteur, en se référant aux étapes 4.4 et 4.5.
11. Fixez le couvercle du bioréacteur et assurez-vous que la chambre est scellée de tous les côtés (figure 3B).
12. Pour éliminer l’air des tubes et amorcer le circuit de perfusion, utilisez une nouvelle seringue à usage unique de 10 ml pour aspirer le détergent du réservoir de détergent à l’aide du robinet d’arrêt à 3 voies à la conduite d’entrée.
13. Une fois tiré, utilisez le même fluide à insérer dans le robinet d’arrêt à 3 voies à la ligne de sortie. Assurez-vous qu’il y a du détergent présent dans tout le tuyau aux lignes d’entrée et de sortie.
14. Appuyez et fixez les cassettes avec le tube dans la pompe péristaltique. Allumez la pompe péristaltique à l’aide du bouton d’alimentation.
    1. Sur l’écran de la pompe péristaltique, passez au deuxième onglet à l’aide de la touche fléchée pour définir le taux de perfusion du premier canal. Débit d’entrée comme mode de livraison et régler le débit de perfusion à 1 mL/min. S’assurer que le sens d’écoulement est correct en fonction de la configuration de l’appareil. Répétez l’opération pour le deuxième canal.
    2. Calibrer la pompe péristaltique pour s’assurer que la quantité de liquide fournie par la conduite d’entrée et/ou prélevée dans la conduite de sortie s’écoule à un rythme constant entre les deux. Assurez-vous que l’ID du tube est réglé sur 1,85 mm.
15. Commencez la décellularisation par perfusion de la machine à 1 mL/min pour les lignes d’entrée et de sortie en appuyant sur le bouton d’alimentation du clavier. Surveiller et s’assurer que le débit est constant et continu aux lignes d’entrée et de sortie.
16. Poursuivre la décellularisation et surveiller quotidiennement. Utilisez la FDS de 1 L de 0,25 % (étape 3.2) pour réapprovisionner le réservoir du bioréacteur par l’orifice de réapprovisionnement, au besoin. Recherchez un aspect blanc et translucide du tissu, qui apparaîtra au jour 5, indiquant la décellularisation des membres postérieurs du rat.

Figure 3 : Vue d’ensemble du circuit du bioréacteur de décellularisation de perfusion du membre postérieur du rat. (A) Représentation schématique du circuit de perfusion du bioréacteur. Les flèches bleues indiquent la direction du flux de détergent et de déchets. (B) Vue d’ensemble du circuit de décellularisation avec bioréacteur contenant le membre postérieur du rat. Le réservoir SDS (flacon gauche) mène à la pompe péristaltique et au tube d’entrée du bioréacteur. Le débit sortant est relié au réservoir de déchets (fiole droite) par la pompe péristaltique. (C) (I) Bioréacteur contenant un membre postérieur de rat avec tube d’admission relié à l’artère fémorale canulée. (II) Port de réapprovisionnement situé dans le coin pour la perfusion du détergent. (III) Tubes de sortie suspendus dans le réservoir en suspension. Abréviation : FDS = dodécylsulfate de sodium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Lavage et stérilisation post-décellularisation

1. Après la confirmation de la décellularisation, remplacez le réservoir de détergent par le réservoir 1x PBS + 1% AA. Sceller l’ouverture de la fiole avec un parafilm. Commencez 1x PBS + 1% de perfusion AA à 1 mL / min et continuez pendant 2 jours.
2. Remplacer le réservoir 1x PBS + 1% AA par 200 mL de réservoir 0,1% PAA/4% EtOH et commencer la perfusion à 1 mL/min pendant 2 h.
3. Déconnectez le membre postérieur de la ligne d’entrée à l’aide de deux paires de pinces Adson stériles, avec une paire de pinces pour tordre la ligne d’entrée et l’autre tenant la canule. Assurez-vous que la canule n’est pas tirée pour empêcher la décanulation.
4. Conservez le membre dans un bocal en verre de 500 ml contenant 1x PBS + 1% AA à 4 °C jusqu’à nouvelle utilisation.

Résultats

Le protocole d’approvisionnement a permis d’isoler et de canuler les artères fémorales communes pour les étapes de perfusion subséquentes. Les images de dissection représentatives de la figure 1A, B montrent l’emplacement de l’incision et l’exposition des vaisseaux fémoraux à une distance suffisante des points de bifurcation. La figure 2 montre l’appareil nécessaire à la préparation du bioréacteur et du circuit de perfusio...

Discussion

Les membres postérieurs du rat sont utiles comme modèles expérimentaux dans VCA⁵. L’ingénierie tissulaire des échafaudages acellulaires représente la première étape pour remédier aux lacunes des schémas d’immunosuppression à long terme associés à l’ACV. L’utilisation de greffons composites pose un défi supplémentaire compte tenu de la présence de plusieurs tissus, chacun ayant des propriétés fonctionnelles, immunogènes et structurelles uniques. Le présent protocole mont...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL	Baxter Corporation	JB1308M
1 mL Disposable Serological Pipets	VWR	75816-102
10 cc Disposable Syringes			Obtained from Research Institution
3-way Stopcock			Obtained from Research Institution
5cc Disposable Syringes			Obtained from Research Institution
70% Isopropyl Alcohol			Obtained from Research Institution
Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm	VWR	CA28143-310
Adson Forceps, Straight	Fine Science Tools	11006-12
Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”)	VWR	38112
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL	Multicell	450-115-EL
Bone Cutter	Fine Science Tools	12029-12
Connectors for  1/16" to 1/8" Tubes	McMasterCarr	5117K52
Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID	McMasterCarr	51525K328
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fine Forceps with Micro-Blunted Tips	Fine Science Tools	11253-20
Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL	LEO Pharma Inc.	006174-09
Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID	McMasterCarr	51525K322
Micro Needle Holder	WLorenz	04-4125
Microscissors	WLorenz	SP-4506
Peracetic Acid	Sigma Aldrich	269336-100ML
Peristaltic Pump, 3-Channel	Cole Parmer	RK-78001-68
Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL	Wisent	311-425-CL
Povidone Surgical Scrub Solution			Obtained from Research Institution
Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL	Cole Parmer	RK-96450-40
Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone	Cole Parmer	RK-96410-16
Scalpel Blade - #10	Fine Science Tools	10010-00
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg	Bioshop	SDS003.1
Surgical Suture #6-0	Covidien	VS889