Approvvigionamento e decellularizzazione degli arti posteriori di ratto utilizzando un bioreattore ex vivo basato sulla perfusione per allotrapianto composito vascolarizzato

Riepilogo

Descriviamo la tecnica chirurgica e il processo di decellularizzazione per gli arti posteriori compositi di ratto. La decellularizzazione viene condotta utilizzando dodecilsolfato di sodio a bassa concentrazione attraverso un sistema di perfusione ex vivo .

Abstract

I pazienti con gravi lesioni traumatiche e perdita di tessuto richiedono una ricostruzione chirurgica complessa. L'allotrapianto composito vascolarizzato (VCA) è una via ricostruttiva in evoluzione per il trasferimento di più tessuti come subunità composita. Nonostante la natura promettente della VCA, i requisiti immunosoppressivi a lungo termine sono una limitazione significativa a causa dell'aumentato rischio di tumori maligni, tossicità da organi terminali e infezioni opportunistiche. L'ingegneria tissutale degli scaffold compositi acellulari è una potenziale alternativa per ridurre la necessità di immunosoppressione. Qui viene descritto l'approvvigionamento di un arto posteriore di ratto e la sua successiva decellularizzazione mediante dodecilsolfato di sodio (SDS). La strategia di approvvigionamento presentata si basa sull'arteria femorale comune. Un sistema di bioreattore basato sulla perfusione meccanica è stato costruito e utilizzato per la decellularizzazione ex vivo dell'arto posteriore. È stata eseguita con successo la decellularizzazione della perfusione, con conseguente aspetto bianco traslucido dell'arto posteriore. È stata osservata una rete vascolare intatta, perfusibile in tutto l'arto posteriore. Le analisi istologiche hanno mostrato la rimozione del contenuto nucleare e la conservazione dell'architettura tissutale in tutti i compartimenti tissutali.

Introduzione

La VCA è un'opzione emergente per i pazienti che richiedono una ricostruzione chirurgica complessa. Lesioni traumatiche o resezioni tumorali provocano una perdita volumetrica di tessuto che può essere difficile da ricostruire. VCA offre il trapianto di più tessuti come pelle, ossa, muscoli, nervi e vasi come innesto composito da un donatore a un ricevente¹. Nonostante la sua natura promettente, VCA è limitato a causa di regimi immunosoppressivi a lungo termine. L'uso permanente di tali farmaci comporta un aumento del rischio di infezioni opportunistiche, tumori maligni e tossicità per organi terminali ^1,2,3. Per contribuire a ridurre e / o eliminare la necessità di immunosoppressione, gli scaffold di ingegneria tissutale che utilizzano approcci di decellularizzazione per VCA mostrano grandi promesse.

La decellularizzazione dei tessuti comporta il mantenimento della struttura della matrice extracellulare mentre rimuove il contenuto cellulare e nucleare. Questa impalcatura decellularizzata può essere ripopolata con cellule paziente-specifiche⁴. Tuttavia, preservare la rete ECM di tessuti compositi è un'ulteriore sfida. Ciò è dovuto alla presenza di più tipi di tessuto con diverse densità di tessuto, architetture e posizioni anatomiche all'interno di un'impalcatura. Il presente protocollo offre una tecnica chirurgica e un metodo di decellularizzazione per un arto posteriore di ratto. Questo è un modello proof-of-concept per l'applicazione di questa tecnica di ingegneria tissutale ai tessuti compositi. Ciò può anche richiedere sforzi successivi per rigenerare i tessuti compositi attraverso la ricellularizzazione.

Protocollo

Per tutti gli esperimenti sono stati utilizzati ratti di Lewis maschi cadaverici (300-430 g) ottenuti dal Toronto General Hospital Research Institute. Per tutte le procedure chirurgiche, sono stati utilizzati strumenti e forniture sterili per mantenere la tecnica asettica (vedere la tabella dei materiali). Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida del Comitato per la cura degli animali presso il Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network (Toronto, ON, Canada). Un totale di quattro arti posteriori sono stati decellularizzati.

1. Preparazione prechirurgica

1. Preparare 50 ml di soluzione salina eparinizzata al 5%. Da una sacca salina da 50 ml, estrarre 2,5 mL di soluzione salina usando una siringa da 5 mL ed eliminare. Utilizzando una siringa da 5 ml, aggiungere 2,5 ml di eparina alla sacca salina. Capovolgere il sacchetto salino per mescolarne il contenuto.
2. Metti un ratto cadaverico in posizione supina sotto un pad blu. Rasare circonferenzialmente l'arto posteriore e l'area inguinale utilizzando un rasoio elettrico e rimuovere i peli.
3. Portare il ratto alla stazione chirurgica e applicare la soluzione di scrub allo iodio Povidone usando una garza sull'arto posteriore e sulla zona inguinale. Successivamente, applicare alcol isopropilico al 70% per rimuovere la soluzione di scrub usando una garza.
4. Scartare il tampone blu dal punto 1.2 e passare a nuovi guanti sterili.

2. Approvvigionamento dell'arto posteriore del ratto

1. Fare un'incisione cutanea usando una lama chirurgica #10 e un blade runner #3 lungo il livello del legamento inguinale, passando da una direzione laterale a una mediale (Figura 1A). Utilizzare una pinza Adson per trattenere la pelle circostante per garantire un'incisione liscia.
2. Quando il grasso sottostante è esposto, utilizzare la dissezione smussata per sezionare attentamente il grasso. Localizzare i vasi epigastrici superiori.
3. Utilizzare microforbici per sezionare prossimalmente ed esporre il nervo femorale sottostante, l'arteria e la vena a livello del legamento inguinale.
4. Al microscopio a dissezione, identificare i vasi femorali e sezionare l'arteria e la vena prossimalmente usando una pinza fine per ottenere una lunghezza sufficiente dai punti di biforcazione della rete arteriosa (Figura 1B).
5. Ligare l'arteria femorale e la vena separatamente usando punti di sutura 6-0.
6. Condurre la dissezione circonferenziale intorno al resto dell'arto posteriore senza interrompere i vasi femorali legati.
7. Transetto l'osso femorale a metà lunghezza usando un tagliaossa.
8. Per isolare completamente l'arto posteriore, transettare i vasi femorali legati sotto le legature usando microforbici.
9. Cannulare l'arteria femorale usando un angiocatetere da 24 G al microscopio a dissezione. Utilizzare una pinza fine per inserire la cannula con attenzione. Sciacquare con soluzione salina eparinizzata fino a quando non si osserva un chiaro deflusso dalla vena femorale.
10. Fissare la cannula legando una sutura attorno al recipiente cannulato e un'altra sutura distalmente attorno alla cannula stessa. Assicurarsi che la cannula sia posizionata in prossimità per evitare di bloccare i punti di biforcazione.
11. Immergere gli arti posteriori procurati in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) fino alla decellularizzazione.

Figura 1: Approvvigionamento dell'arto posteriore del ratto. (A) Marcatura dell'incisione cutanea a livello del legamento inguinale da laterale a mediale. (B) Vista della vena femorale e dell'arteria femorale, che sono state sezionate prossimalmente verso il legamento inguinale, indicato dalla linea tratteggiata. Abbreviazioni: L = laterale; M = mediale; FV = vena femorale; FA = arteria femorale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

3. Preparazione delle soluzioni

1. In un matraccio di vetro da 6 L, preparare un serbatoio di detergente da 5 L di sodio dodecilsolfato (SDS) allo 0,25% sciogliendo 12,5 g di polvere SDS in 5 L di acqua distillata ultrapura. Coprire l'apertura del pallone con parafilm per sigillarlo.
2. In un barattolo di vetro da 1 L, preparare separatamente 1 L di soluzione SDS allo 0,25% sciogliendo 2,5 g di SDS in 1 L di acqua distillata ultrapura. Aggiungere una barra di agitazione per mescolare la soluzione su un agitatore magnetico fino a quando tutta la SDS è sciolta.
3. Preparare 1 L di 1x soluzione di lavaggio PBS con soluzione antibiotico-antimicotica (AA) all'1%. In un matraccio da 1 L, aggiungere 990 mL di soluzione 1x PBS e 10 mL di AA.
4. Separatamente, in un barattolo di vetro da 500 ml, preparare nuovamente 1x PBS + 1% di soluzione AA utilizzando 495 mL di 1x soluzione PBS e 5 mL di AA.
5. Preparare 200 ml di soluzione di acido peracetico (PAA) all'1% / etanolo al 4% (EtOH). Preparare questa soluzione sotto una cappa aspirante.

4. Costruzione di bioreattori e circuiti di perfusione

NOTA: Fare riferimento alla Figura 2 per la configurazione del bioreattore e del circuito di perfusione durante i passaggi elencati.

1. In una camera da 500 mL (contenitore di plastica), praticare tre fori (1/4 di pollice) nelle posizioni indicate nella Figura 2: La porta A è la linea di ingresso, la porta B è la linea di rifornimento e la porta C è la linea di uscita. Rimuovere e gettare la plastica in eccesso. Spruzzare e pulire la camera con etanolo al 70%.
2. Tagliare tre tubi di silicone lunghi 5 cm e inserirne uno a metà in ciascuna porta della camera. Collegare un connettore Luer maschio sull'apertura della porta A rivolta verso l'interno della camera e un connettore Luer femmina sull'altra estremità del tubo all'esterno della camera.
3. Collegare un connettore Luer femmina alle porte B e C alle estremità dei tubi rivolti verso l'esterno della camera.
4. In un coperchio ermetico per il contenitore di plastica, praticare un foro sulla superficie del coperchio.
5. Tagliare un tubo di silicone di 3 cm e inserirlo nel foro del coperchio. Assicurarsi che circa 2 cm del tubo si trovino fuori dal coperchio, come mostrato nella Figura 2.
6. Sterilizzare sia la camera che il coperchio con il tubo.
7. Tagliare due tubi di silicone da 30 cm usando le forbici. Collegare un connettore da 1/16 di pollice a un connettore da 1/8" su un'estremità di ciascun tubo.
8. Separatamente, tagliare due tubi di silicone da 12 cm usando le forbici. Collegare un connettore da 1/16 di pollice a un connettore da 1/8" su un'estremità di entrambi i tubi. Collegare un connettore Luer maschio all'altra estremità di un tubo e un connettore Luer femmina all'altro tubo.
9. Sterilizzare tutto il materiale del tubo dal punto 4.7 e dal punto 4.8. Includere due tubi pompa a 3 arresti (1,85 mm) nella sterilizzazione.
10. Preparare tre rubinetti di arresto a 3 vie, un filtro a siringa, due pipette sierologiche da 1 mL e una siringa da 10 ml per la configurazione della decellularizzazione. Rimuovere il filtro dalle pipette sierologiche da 1 ml.

Figura 2: Preparazione del bioreattore e costruzione del circuito di perfusione. Apparecchiatura mostrata del circuito di perfusione, compresa (A) pompa peristaltica e (B) cassette corrispondenti per entrambe le linee di ingresso e di uscita. (C, D) I tubi in silicone da 12 cm e 30 cm sono mostrati anche con i rispettivi connettori. (E) Tubi per pompa peristaltica (1,85 mm). Camera del bioreattore con porte etichettate per (F) afflusso, (G) porta di rifornimento e (H) deflusso. (I) Coperchio del bioreattore mostrato con porta di ventilazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

5. Decellularizzazione degli arti posteriori di ratto

1. Posizionare la camera sterilizzata e avvitare tre rubinetti di arresto monouso a 3 vie sulle linee di ingresso, uscita e rifornimento. Assicurarsi che il rubinetto di arresto per la porta di rifornimento sia chiuso alle due porte rimanenti per evitare perdite.
2. Fissare i tubi realizzati al punto 4.8 ai rubinetti di arresto in corrispondenza delle linee di ingresso e di uscita.
3. Collegare i tubi peristaltici ai tubi nel passaggio precedente. Fissare la cassetta sul tubo peristaltico e posizionarla sulla pompa peristaltica. Non fissare ancora le cassette con i tubi in posizione.
4. Collegare un tubo dal punto 4.7 all'estremità del tubo peristaltico della linea di uscita dal passaggio precedente. Collegare una pipetta sierologica da 1 mL all'altra estremità. Sospendere l'estremità fissata con una pipetta sierologica nel pallone del serbatoio dei rifiuti.
5. Ripetere il passaggio 4.7 per la linea di ingresso. Sospendere l'estremità del tubo attaccato alla pipetta sierologica nel serbatoio del detergente. Sigillare immediatamente l'apertura del pallone del serbatoio del detergente con parafilm. Vedere la Figura 3A,B per una panoramica del circuito di decellularizzazione.
6. Aggiungere lo 0,25% di SDS dal barattolo di vetro da 1 litro (fase 3.2) nella camera del bioreattore a metà strada.
7. Prendere l'arto posteriore procurato usando una pinza Adson e sospenderlo con cura nella camera del bioreattore.
8. Utilizzare due paia di pinze Adson per guidare la parte cannulata dell'arto posteriore verso la linea di ingresso. Mentre si tiene la cannula con un paio di pinze, utilizzare l'altro paio di pinze per ruotare e fissare la linea di ingresso alla cannula. Assicurarsi che la cannula non sia tirata o attorcigliata per evitare la decannulazione.
9. Una volta fissato, aggiungere più SDS allo 0,25% dal barattolo di vetro da 1 L per immergere completamente l'arto, se necessario. Assicurarsi che anche la porta di uscita sia immersa nel serbatoio del bioreattore per garantire che venga mantenuto un deflusso costante (Figura 3C).
10. Collegare un filtro a siringa monouso alla porta di ventilazione sul coperchio della camera del bioreattore, facendo riferimento ai punti 4.4 e 4.5.
11. Fissare il coperchio del bioreattore e assicurarsi che la camera sia sigillata da tutti i lati (Figura 3B).
12. Per rimuovere l'aria dai tubi e innescare il circuito di perfusione, utilizzare una nuova siringa monouso da 10 ml per prelevare il detergente dal serbatoio del detergente utilizzando il rubinetto di arresto a 3 vie sulla linea di ingresso.
13. Una volta disegnato, utilizzare lo stesso fluido da inserire nel rubinetto di arresto a 3 vie sulla linea di uscita. Assicurarsi che sia presente del detergente in tutto il tubo sia nelle linee di ingresso che in uscita.
14. Premere verso il basso e fissare le cassette con il tubo nella pompa peristaltica. Accendere la pompa peristaltica utilizzando il pulsante di accensione.
    1. Nella schermata della pompa peristaltica, passare alla seconda scheda utilizzando il tasto freccia per impostare la velocità di perfusione per il primo canale. Portata in ingresso come modalità di erogazione e impostare la velocità di perfusione a 1 mL/min. Assicurarsi che la direzione del flusso sia corretta in base alla configurazione dell'apparecchio. Ripetere l'operazione per il secondo canale.
    2. Calibrare la pompa peristaltica per garantire che la quantità di fluido erogato attraverso la linea di ingresso e/o prelevato dalla linea di uscita scorra a una velocità costante tra i due. Assicurarsi che l'ID del tubo sia impostato su 1,85 mm.
15. Iniziare la decellularizzazione tramite perfusione della macchina a 1 mL/min per entrambe le linee di ingresso e uscita premendo il pulsante di accensione sulla tastiera. Monitorare e assicurarsi che il flusso sia coerente e continuo sia nelle linee di ingresso che in uscita.
16. Continuare la decellularizzazione e monitorare quotidianamente. Utilizzare 1 L di SDS allo 0,25% (fase 3.2) per ricostituire il serbatoio del bioreattore attraverso la porta di rifornimento, se necessario. Cerca un aspetto bianco e traslucido del tessuto, che apparirà entro il giorno 5, indicando la decellularizzazione degli arti posteriori del ratto.

Figura 3: Panoramica del circuito del bioreattore di decellularizzazione della perfusione dell'arto posteriore del ratto . (A) Rappresentazione schematica del circuito di perfusione del bioreattore. Le frecce blu indicano la direzione del detersivo e del flusso dei rifiuti. (B) Panoramica del circuito di decellularizzazione con bioreattore contenente l'arto posteriore di ratto. Il serbatoio SDS (pallone sinistro) conduce nella pompa peristaltica e nel tubo di ingresso del bioreattore. Il deflusso è collegato al serbatoio di scarico (pallone destro) attraverso la pompa peristaltica. (C) (I) Bioreattore contenente l'arto posteriore di ratto con tubo di ingresso collegato all'arteria femorale cannulata. (II) Porta di rifornimento situata nell'angolo per la perfusione del detergente. (III) Tubi di deflusso sospesi nel serbatoio di sospensione. Abbreviazione: SDS = sodio dodecilsolfato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

6. Lavaggio e sterilizzazione post-decellularizzazione

1. Dopo la conferma della decellularizzazione, sostituire il serbatoio del detergente con il serbatoio 1x PBS + 1% AA. Sigillare l'apertura del matraccio con parafilm. Iniziare 1x PBS + 1% di perfusione AA a 1 mL/min e continuare per 2 giorni.
2. Sostituire il serbatoio 1x PBS + 1% AA con 200 mL di serbatoio 0,1% PAA/4% EtOH e iniziare la perfusione a 1 mL/min per 2 ore.
3. Scollegare l'arto posteriore dalla linea di ingresso usando due paia di pinze sterili di Adson, con un paio di pinze per torcere la linea di ingresso e l'altra che tiene la cannula. Assicurarsi che la cannula non venga tirata per evitare la decannulazione.
4. Conservare l'arto in un barattolo di vetro da 500 ml contenente 1x PBS + 1% AA a 4 °C fino a ulteriore utilizzo.

Risultati

Il protocollo di approvvigionamento ha avuto successo nell'isolare e incannulare le arterie femorali comuni per le successive fasi di perfusione. Le immagini rappresentative della dissezione nella Figura 1A,B mostrano la posizione dell'incisione e l'esposizione dei vasi femorali con una distanza sufficiente dai punti di biforcazione. La figura 2 mostra l'apparecchiatura necessaria per preparare il bioreattore e il circuito di perfusione. L'endp...

Discussione

Gli arti posteriori dei ratti sono utili come modelli sperimentali in VCA⁵. L'ingegneria tissutale degli scaffold acellulari rappresenta il primo passo per affrontare le carenze dei regimi di immunosoppressione a lungo termine associati alla VCA. L'uso di innesti compositi rappresenta un'ulteriore sfida data la presenza di più tessuti, ognuno con proprietà funzionali, immunogeniche e strutturali uniche. Il presente protocollo mostra un metodo efficace per ottenere arti posteriori compositi acell...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL	Baxter Corporation	JB1308M
1 mL Disposable Serological Pipets	VWR	75816-102
10 cc Disposable Syringes			Obtained from Research Institution
3-way Stopcock			Obtained from Research Institution
5cc Disposable Syringes			Obtained from Research Institution
70% Isopropyl Alcohol			Obtained from Research Institution
Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm	VWR	CA28143-310
Adson Forceps, Straight	Fine Science Tools	11006-12
Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”)	VWR	38112
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL	Multicell	450-115-EL
Bone Cutter	Fine Science Tools	12029-12
Connectors for  1/16" to 1/8" Tubes	McMasterCarr	5117K52
Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID	McMasterCarr	51525K328
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fine Forceps with Micro-Blunted Tips	Fine Science Tools	11253-20
Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL	LEO Pharma Inc.	006174-09
Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID	McMasterCarr	51525K322
Micro Needle Holder	WLorenz	04-4125
Microscissors	WLorenz	SP-4506
Peracetic Acid	Sigma Aldrich	269336-100ML
Peristaltic Pump, 3-Channel	Cole Parmer	RK-78001-68
Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL	Wisent	311-425-CL
Povidone Surgical Scrub Solution			Obtained from Research Institution
Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL	Cole Parmer	RK-96450-40
Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone	Cole Parmer	RK-96410-16
Scalpel Blade - #10	Fine Science Tools	10010-00
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg	Bioshop	SDS003.1
Surgical Suture #6-0	Covidien	VS889