血管化複合同種移植のための 生体外 灌流ベースのバイオリアクターを用いたラット後肢の調達と脱細胞化

要約

複合ラット後肢の手術手技と脱細胞化プロセスについて説明します。脱細胞化は、 ex vivo マシン灌流システムを介して低濃度ドデシル硫酸ナトリウムを使用して行われます。

要約

重度の外傷および組織喪失を有する患者は、複雑な外科的再建を必要とする。血管新生複合同種移植(VCA)は、複数の組織を複合サブユニットとして移植するための進化する再建手段です。VCAの有望な性質にもかかわらず、長期的な免疫抑制要件は、悪性腫瘍、末端臓器毒性、および日和見感染のリスクが高いため、重大な制限です。無細胞複合足場の組織工学は、免疫抑制の必要性を減らすための潜在的な代替手段です。本明細書では、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を用いたラット後肢の調達およびその後の脱細胞化について説明する。提示された調達戦略は、総大腿動脈に基づいています。機械灌流ベースのバイオリアクターシステムを構築し、後肢の 生体外 脱細胞化に使用しました。灌流脱細胞化に成功し、後肢の白色半透明様の外観をもたらした。後肢全体に無傷の灌流可能な血管網が観察された。組織学的分析は、核内容物の除去とすべての組織コンパートメントにわたる組織構造の保存を示しました。

概要

VCAは、複雑な外科的再建を必要とする患者にとって新たな選択肢です。外傷または腫瘍切除は、再建が困難な体積組織の喪失をもたらします。VCAは、皮膚、骨、筋肉、神経、血管などの複数の組織を、ドナーからレシピエントへの複合移植片として移植します¹。その有望な性質にもかかわらず、VCAは長期の免疫抑制レジメンのために制限されています。このような薬物の生涯使用は、日和見感染症、悪性腫瘍、および末端臓器毒性のリスクの増加をもたらします^1,2,3。免疫抑制の必要性を軽減および/または排除するために、VCAの脱細胞化アプローチを使用した組織工学的足場は大きな期待を示しています。

組織の脱細胞化は、細胞および核の内容物を除去しながら、細胞外マトリックス構造を保持することを伴います。この脱細胞化足場は、患者特異的細胞⁴で再増殖することができる。ただし、複合組織のECMネットワークを維持することは、追加の課題です。これは、足場内の組織密度、構造、および解剖学的位置が異なる複数の組織タイプが存在するためです。本プロトコールは、ラット後肢に対する外科的手法および脱細胞化方法を提供する。これは、この組織工学技術を複合組織に適用するための概念実証モデルです。これはまた、再細胞化によって複合組織を再生するためのその後の努力を促すことができる。

プロトコル

トロント総合病院研究所から得られた死体雄ルイスラット(300〜430g)を全ての実験に使用した。すべての外科手術では、無菌技術を維持するために滅菌器具と消耗品が使用されました( 材料の表を参照)。すべての手順は、トロント総合病院研究所、大学保健ネットワーク(カナダ、オンタリオ州トロント)の動物ケア委員会のガイドラインに従って実行されました。合計4つの後肢が脱細胞化されました。

1.手術前の準備

1. 50 mLの5%ヘパリン化生理食塩水を調製します。50 mLの生理食塩水バッグから、5 mLシリンジを使用して2.5 mLの生理食塩水を取り出し、廃棄します。5 mLシリンジを使用して、生理食塩水バッグに2.5 mLのヘパリンを追加します。生理食塩水バッグをひっくり返して内容物を混ぜます。
2. 死体ラットを青いパッドの下の仰臥位に置きます。電気シェーバーを使用して後肢と鼠径部を円周方向に剃り、脱毛します。
3. ラットを手術ステーションに持ち込み、ガーゼを使用してポビドンヨードスクラブ溶液を後肢と鼠径部に塗布します。続いて、70%イソプロピルアルコールを塗布し、ガーゼを使用してスクラブ溶液を拭き取ります。
4. 手順1.2の青いパッドを廃棄し、新しい滅菌手袋に交換します。

2. ラット後肢の調達

1. 鼠径靭帯レベルに沿って#10外科用ブレードと#3ブレードランナーを使用して、外側から内側に向かって皮膚を切開します(図1A)。アドソン鉗子を使用して周囲の皮膚を保持し、滑らかな切開を確保します。
2. 下にある脂肪が露出したら、鈍い解剖を使用して脂肪を注意深く解剖します。上腹部血管を見つけます。
3. マイクロハサミを使用して近位に解剖し、下にある大腿神経、動脈、静脈を鼠径靭帯レベルで露出させます。
4. 解剖顕微鏡下で、大腿血管を特定し、細い鉗子を使用して動脈と静脈を近位に解剖し、動脈網の分岐点から十分な長さを取得します(図1B)。
5. 6-0縫合糸を使用して大腿動脈と静脈を別々に結睭します。
6. 結紮された大腿骨血管を破壊することなく、後肢の残りの部分の周囲を円周方向に解剖します。
7. ボーンカッターを使用して大腿骨を中央の長さに切断します。
8. 後肢を完全に隔離するには、マイクロハサミを使用して結紮した大腿骨血管を結紮糸の下に交差させます。
9. 解剖顕微鏡下で24G血管カテーテルを使用して大腿動脈をカニュレ挿入します。細かい鉗子を使用して、カニューレを慎重に挿入します。大腿静脈から明らかな流出が観察されるまで、ヘパリン化生理食塩水でフラッシュします。
10. カニューレ自体の周りに1本の縫合糸を結び、カニューレ自体の周りに遠位に別の縫合糸を結ぶことによって、カニューレを固定します。分岐点が塞がれないように、カニューレが近位に配置されていることを確認してください。
11. 調達した後肢をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に脱細胞化するまで沈めます。

図1:ラット後肢の調達。(A)外側から内側までの鼠径靭帯レベルでの皮膚切開のマーキング。(B)鼠径靭帯に向かって近位に解剖された大腿静脈と大腿動脈のビュー、点線で示した。略語:L =側面;M =内側;FV =大腿静脈;FA =大腿動脈。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3.溶液の調製

1. 6 Lのガラスフラスコに、12.5 gのSDS粉末を5 Lの超高純度蒸留水に溶解することにより、0.25%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の5 L洗剤リザーバーを準備します。フラスコの開口部をパラフィルムで覆い、密閉します。
2. 1Lのガラス瓶に、2.5gのSDSを1Lの超高純度蒸留水に溶解することにより、1Lの0.25%SDS溶液を別途調製する。攪拌子を追加して、すべてのSDSが溶解するまでマグネチックスターラーで溶液を混合します。
3. 1%抗生物質抗真菌薬(AA)溶液を含む1 Lの1x PBS洗浄溶液を調製します。1 L フラスコに、990 mL の 1x PBS 溶液と 10 mL の AA 液を加えます。
4. 別途、500 mLのガラス瓶で、495 mLの1x PBS溶液と5 mLのAA溶液を使用して、1x PBS + 1%AA溶液を再度調製します。
5. 200 mLの1%過酢酸(PAA)/4%エタノール(EtOH)溶液を調製します。ドラフトの下でこの溶液を調製してください。

4. バイオリアクターと灌流回路の構築

注意: リストされた手順全体のバイオリアクターと灌流回路の構成については、 図2 を参照してください。

1. 500 mLチャンバー(プラスチック容器)で、 図2のラベルの付いた位置に3つの穴(1/4インチ)を開けます。ポートAは入口ライン、ポートBは補充ライン、ポートCは出口ラインです。余分なプラスチックを取り除いて廃棄します。チャンバーに70%エタノールをスプレーして拭きます。
2. 長さ5cmのシリコンチューブを3本切り、チャンバーの各ポートに半分まで挿入します。チャンバーの内側に面したポートAの開口部にあるオスのルアーコネクタと、チャンバーの外側のチューブのもう一方の端にあるメスのルアーコネクタを接続します。
3. チャンバーの外側を向いたチューブの端にあるポートBとポートCにメスのルアーコネクタを接続します。
4. プラスチック容器の気密蓋に、蓋の表面に1つの穴を開けます。
5. 3 cmのシリコンチューブを切り取り、蓋の穴に挿入します。 図 2 に示すように、チューブの約 2 cm が蓋から外れていることを確認します。
6. チャンバーと蓋の両方をチューブで滅菌します。
7. はさみを使用して2つの30 cmシリコンチューブを切ります。各チューブの一方の端にある1/16インチを1/8インチのコネクタに接続します。
8. 別に、はさみを使用して2つの12 cmシリコンチューブを切ります。両方のチューブの一方の端にある1/16インチを1/8インチのコネクタに接続します。一方のチューブのもう一方の端にオスのルアーコネクタを接続し、もう一方のチューブにメスのルアーコネクタを接続します。
9. ステップ4.7とステップ4.8のすべてのチューブ材料を滅菌します。滅菌には2つの3ストップポンプチューブ(1.85 mm)を含めます。
10. 脱細胞化のセットアップ用に、3方向活栓3本、シリンジフィルター1本、1 mL血清学的ピペット2本、10 mLシリンジ1本を準備します。1 mL 血清学的ピペットからフィルターを取り外します。

図2:バイオリアクターと灌流回路構築の準備。 入口ラインと出口ラインの両方のための(A)蠕動ポンプおよび(B)対応するカセットを含む灌流回路の示す装置。(C, D)12cmと30cmのシリコンチューブもそれぞれのコネクタとともに示されています。(E)蠕動ポンプ用チューブ(1.85mm)。(F)流入、(G)補充ポート、および(H)流出のためのラベル付きポートを備えたバイオリアクターチャンバー。(I)換気口のあるバイオリアクターの蓋。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5.ラット後肢の脱細胞化

1. 滅菌チャンバーを置き、入口、出口、および補充ラインにある3つの使い捨て3ウェイ活栓にねじ込みます。漏れを防ぐために、補充ポートの活栓が残りの2つのポートでキャップされていることを確認してください。
2. 手順4.8で作成したチューブを、入口ラインと出口ラインの活栓に取り付けます。
3. 上記の手順で蠕動チューブをチューブに接続します。カセットを蠕動チューブに固定し、蠕動ポンプに置きます。まだチューブを所定の位置に固定した状態でカセットを固定しないでください。
4. ステップ4.7の1本のチューブを、上記のステップの出口ラインの蠕動チューブの端に接続します。もう一方の端に1 mLの血清学的ピペットを接続します。血清学的ピペットで取り付けられた端部を廃棄物貯蔵フラスコに吊り下げる。
5. 流入口ラインに対して手順 4.7 を繰り返します。血清学的ピペットに取り付けられたチューブの端を洗剤リザーバーに吊り下げます。洗剤リザーバーフラスコの開口部を直ちにパラフィルムで密封する。脱細胞化回路の概要については、図3A,Bを参照してください。
6. 0.25 Lガラスジャー(ステップ3.2)から中間レベルのバイオリアクターチャンバーに1%SDSを追加します。
7. アドソン鉗子を使用して調達した後肢を取り、バイオリアクターチャンバーに慎重に吊り下げます。
8. 2対のアドソン鉗子を使用して、後肢のカニューレ部分を入口ラインに導きます。1対の鉗子でカニューレを保持しながら、もう一方の鉗子を使用して、入口ラインをねじってカニューレに固定します。脱カニューレを防ぐために、カニューレが引っ張られたりねじれたりしていないことを確認してください。
9. 固定したら、必要に応じて、0.25 Lのガラス瓶から1%SDSを追加して、手足を完全に沈めます。出口ポートもバイオリアクターリザーバーに沈んでいることを確認して、一貫した流出が維持されるようにします(図3C)。
10. シングルユースシリンジフィルターをバイオリアクターチャンバーの蓋の換気ポートに取り付けます(ステップ4.4およびステップ4.5を参照)。
11. バイオリアクターの蓋を固定し、チャンバーがすべての側面から密閉されていることを確認します(図3B)。
12. チューブから空気を除去し、灌流回路をプライミングするには、新しい使い捨て10 mLシリンジを使用して、入口ラインの3方向活栓を使用して洗剤リザーバーから洗剤を引き出します。
13. 描画したら、同じ液体を使用して、出口ラインの3方向活栓に挿入します。入口ラインと出口ラインの両方のチューブ全体に洗剤が存在することを確認してください。
14. チューブ付きのカセットを押し下げて蠕動ポンプに固定します。電源ボタンを使用して蠕動ポンプをオンにします。
    1. 蠕動ポンプ画面で、矢印キーを使用して2番目のタブに進み、最初のチャネルの灌流率を設定します。送達モードとして流量を入力し、灌流速度を1mL/minに設定します。装置のセットアップに従って、流れの方向が正しいことを確認してください。2番目のチャンネルについても繰り返します。
    2. 蠕動ポンプを校正して、入口ラインを介して供給される流体および/または出口ラインから取り出される流体の量が、2つの間で一定の速度で流れることを確認します。 チューブ内径 が 1.85 mm に設定されていることを確認します。
15. キーパッド の電源 ボタンを押して、入口ラインと出口ラインの両方で1 mL/minの機械灌流を介して脱細胞化を開始します。入口ラインと出口ラインの両方で流れが一貫して進行中であることを監視および確認します。
16. 脱細胞化を継続し、毎日監視します。.必要に応じて、1 Lの0.25%SDS(ステップ3.2)を使用して、補充ポートからバイオリアクターリザーバーを補充します。ラット後肢の脱細胞化を示す、5日目までに現れる組織の白い半透明の外観を探します。

図3: ラット後肢の灌流脱細胞化バイオリアクター回路の概要 。 (a)バイオリアクター灌流回路の概略図。青い矢印は、洗剤と廃棄物の流れの方向を示しています。(B)ラット後肢を含むバイオリアクターを備えた脱細胞化回路の概要。SDSリザーバー(左フラスコ)は、蠕動ポンプとバイオリアクターの入口チューブにつながります。流出は、蠕動ポンプを介して廃棄物貯留層(右フラスコ)に接続されています。(C)(I)カニューレ付き大腿動脈に接続された導入チューブを有するラット後肢を含むバイオリアクター。(II)洗剤を灌流するためのコーナーにある補充ポート。(III)懸濁液貯留層に吊り下げられた流出チューブ。略称:SDS =ドデシル硫酸ナトリウム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6.脱細胞化後の洗浄と滅菌

1. 脱細胞化の確認後、洗剤リザーバーを1x PBS + 1%AAリザーバーと交換します。フラスコの開口部をパラフィルムで密封する。1 mL /分で1x PBS + 1%AA灌流を開始し、2日間続けます。
2. 1x PBS + 1% AAリザーバーを200 mLの0.1%PAA / 4%EtOHリザーバーと交換し、1 mL / minで2時間灌流を開始します。
3. 2対の滅菌アドソン鉗子を使用して後肢を入口ラインから切り離し、1対の鉗子で入口ラインをねじり、もう1対でカニューレを保持します。脱カニューレを防ぐためにカニューレが引っ張られていないことを確認してください。
4. さらに使用するまで、1x PBS + 1%AAを含む500 mLガラス瓶に手足を4°Cで保管します。

結果

調達プロトコルは、その後の灌流ステップのために総大腿動脈を分離およびカニューレすることに成功しました。図1A,Bの代表的な解剖像は、分岐点から十分な距離を置いた大腿血管の切開位置と露出を示しています。図2は、バイオリアクターおよび灌流回路を調製するために必要な装置を示す。脱細胞化のエンドポイントは、組織の...

ディスカッション

ラットの後肢はVCA⁵の実験モデルとして有用である。無細胞足場の組織工学は、VCAに関連する長期免疫抑制レジメンの欠点に対処するための最初のステップを表しています。複合グラフトの使用は、それぞれが独自の機能的、免疫原性、および構造的特性を持つ複数の組織が存在することを考えると、追加の課題をもたらします。本プロトコールは、ラット後肢の無細胞複合...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL	Baxter Corporation	JB1308M
1 mL Disposable Serological Pipets	VWR	75816-102
10 cc Disposable Syringes			Obtained from Research Institution
3-way Stopcock			Obtained from Research Institution
5cc Disposable Syringes			Obtained from Research Institution
70% Isopropyl Alcohol			Obtained from Research Institution
Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm	VWR	CA28143-310
Adson Forceps, Straight	Fine Science Tools	11006-12
Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”)	VWR	38112
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL	Multicell	450-115-EL
Bone Cutter	Fine Science Tools	12029-12
Connectors for  1/16" to 1/8" Tubes	McMasterCarr	5117K52
Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID	McMasterCarr	51525K328
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fine Forceps with Micro-Blunted Tips	Fine Science Tools	11253-20
Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL	LEO Pharma Inc.	006174-09
Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID	McMasterCarr	51525K322
Micro Needle Holder	WLorenz	04-4125
Microscissors	WLorenz	SP-4506
Peracetic Acid	Sigma Aldrich	269336-100ML
Peristaltic Pump, 3-Channel	Cole Parmer	RK-78001-68
Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL	Wisent	311-425-CL
Povidone Surgical Scrub Solution			Obtained from Research Institution
Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL	Cole Parmer	RK-96450-40
Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone	Cole Parmer	RK-96410-16
Scalpel Blade - #10	Fine Science Tools	10010-00
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg	Bioshop	SDS003.1
Surgical Suture #6-0	Covidien	VS889