רכש ודה-סלוליזציה של חולדות אחוריות באמצעות ביוריאקטור מבוסס ex vivo perfusion עבור allotransplantation מרוכב וסקולרי

Summary

אנו מתארים את הטכניקה הכירורגית ואת תהליך הדה-סלוליזציה של חולדות מרוכבות. דה-סלוליזציה מתבצעת באמצעות נתרן דודציל סולפט בריכוז נמוך באמצעות מערכת פרפוזיה של מכונת ex vivo.

Abstract

חולים עם פציעות טראומטיות קשות ואובדן רקמות זקוקים לשחזור כירורגי מורכב. אלוטרנספלנטציה מרוכבת וסקולרית (VCA) היא דרך שחזור מתפתחת להעברת רקמות מרובות כתת-יחידה מרוכבת. למרות האופי המבטיח של VCA, הדרישות ארוכות הטווח של דיכוי חיסוני הן מגבלה משמעותית בשל הסיכון המוגבר לממאירויות, רעילות איברי קצה וזיהומים אופורטוניסטיים. הנדסת רקמות של פיגומים מרוכבים תאיים היא חלופה פוטנציאלית בהפחתת הצורך בדיכוי חיסוני. כאן מתוארת ההצטיידות של חולדה אחורית ודה-צלולריזציה שלה לאחר מכן באמצעות נתרן דודציל סולפט (SDS). אסטרטגיית הרכש המוצגת מבוססת על עורק הירך המשותף. נבנתה מערכת ביו-ריאקטור מבוססת זלוף מכונה ושימשה לדה-סלוליזציה של ה-ex vivo של ה-hindlimb. בוצעה דה-סלוליזציה מוצלחת של הזליפה, וכתוצאה מכך נוצר מראה לבן שקוף דמוי האחורי. נצפתה רשת כלי דם שלמה, ניתנת להעברה, לאורך כל החלק האחורי. ניתוחים היסטולוגיים הראו את הסרת התכולה הגרעינית ואת שימור ארכיטקטורת הרקמות בכל תאי הרקמות.

Introduction

VCA הוא אופציה מתפתחת עבור חולים הזקוקים לשחזור כירורגי מורכב. פציעות טראומטיות או כריתות גידול גורמות לאובדן רקמה נפחית שקשה לשחזר. VCA מציע השתלה של רקמות מרובות כגון העור, העצם, השרירים, העצבים וכלי הדם כשתל מורכב מתורם למקבל¹. למרות אופיו המבטיח, VCA מוגבל בשל משטרים מדכאי חיסון ארוכי טווח. שימוש בתרופות כאלה לכל החיים גורם לסיכון מוגבר לזיהומים אופורטוניסטיים, ממאירויות ורעילות איברים סופית ^1,2,3. כדי לעזור להפחית ו/או לבטל את הצורך בדיכוי חיסוני, פיגומים מהונדסים רקמות המשתמשים בגישות דה-סלוליזציה עבור VCA מראים הבטחה גדולה.

דה-סלוליזציה של רקמות כרוכה בשמירה על מבנה המטריצה החוץ-תאית תוך הסרת התכולה התאית והגרעינית. פיגום מתכלה זה יכול להיות מאוכלס מחדש עם תאים ספציפיים לחולה⁴. עם זאת, שימור רשת ECM של רקמות מרוכבות הוא אתגר נוסף. זאת בשל נוכחותם של סוגי רקמות מרובים עם צפיפויות רקמה שונות, ארכיטקטורות ומיקומים אנטומיים בתוך פיגום. הפרוטוקול הנוכחי מציע טכניקה כירורגית ושיטת דה-סלוליזציה עבור חולדה אחורית. זהו מודל הוכחת היתכנות ליישום טכניקה זו של הנדסת רקמות על רקמות מרוכבות. זה יכול גם להניע את המאמצים הבאים לחדש רקמות מרוכבות באמצעות recellularization.

Protocol

חולדות לואיס זכרים קדבריים (300-430 גרם) שהתקבלו ממכון המחקר של בית החולים הכללי בטורונטו שימשו לכל הניסויים. עבור כל ההליכים הכירורגיים, מכשירים סטריליים ואספקה שימשו לשמירה על טכניקה אספטית (ראה טבלת החומרים). כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות הוועדה לטיפול בבעלי חיים במכון המחקר של בית החולים הכללי בטורונטו, רשת הבריאות האוניברסיטאית (טורונטו, ON, קנדה). בסך הכל ארבעה אחוריים הוסרו.

1. הכנה טרום כירורגית

1. הכן 50 מ"ל של 5% מלוחים heparinized. מתוך שקית מלח של 50 מ"ל, יש להוציא 2.5 מ"ל של תמיסת מלח באמצעות מזרק של 5 מ"ל ולהשליך אותה. באמצעות מזרק 5 מ"ל, להוסיף 2.5 מ"ל של הפרין לשקית המלוח. הפוך את שקית המלח כדי לערבב את תכולתה.
2. הניחו חולדה קדבורית בתנוחת שכיבה מתחת לכרית כחולה. יש לגלח את החלק האחורי ואת אזור המפשעה בהיקף באמצעות מכונת גילוח חשמלית ולהסיר שיער.
3. הביאו את החולדה לתחנת הניתוחים ומרחו תמיסת פילינג יוד של Povidone באמצעות גזה על אזור המפשעה האחורית. לאחר מכן, להחיל 70% אלכוהול איזופרופיל כדי לנגב את תמיסת קרצוף באמצעות גזה.
4. יש להשליך את הפד הכחול משלב 1.2 ולהחליף לכפפות חדשות וסטריליות.

2. רכישת חולדה אחורית

1. בצע חתך בעור באמצעות להב כירורגי #10 ורץ להב #3 לאורך רמת הרצועה המפשעתית, תוך מעבר מכיוון רוחבי לכיוון מדיאלי (איור 1A). השתמש במלקחיים של Adson כדי להחזיק את העור שמסביב כדי להבטיח חתך חלק.
2. כאשר השומן שמתחת נחשף, יש להשתמש בדיסקציה קהה כדי לנתח בזהירות את השומן. אתר את כלי הדם האפיגסטריים העליונים.
3. השתמש במיקרו-מספריים כדי לנתח באופן פרוקסימלי ולחשוף את עצב הירך, העורק והווריד הבסיסיים ברמת הרצועה המפשעתית.
4. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, זהה את כלי הירך ונתח את העורק והווריד באופן פרוקסימלי באמצעות מלקחיים עדינים כדי להשיג אורך מספיק מנקודות הביפורקציה של רשת העורקים (איור 1B).
5. Ligate את עורק הירך ואת הווריד בנפרד באמצעות 6-0 תפרים.
6. לבצע דיסקציה היקפית סביב שארית החלק האחורי מבלי להפריע לכלי הירך הקשורים.
7. להעביר את עצם הירך באורך בינוני באמצעות חותך עצם.
8. כדי לבודד באופן מלא את החלק האחורי, העבירו את כלי הירך המחוברים מתחת לליגטורות באמצעות מיקרו-מספריים.
9. ניתן לנטרל את עורק הירך באמצעות אנגיוקטטר 24 גרם מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה. השתמשו במלקחיים עדינים כדי להכניס את הצינורית בזהירות. לשטוף עם מלוחים heparinized עד זרימה ברורה הוא ציין מן וריד הירך.
10. אבטחו את הצינורית על ידי קשירת תפר אחד סביב כלי הצינורית ותפר נוסף באופן דיסטלי סביב הצינורית עצמה. ודא שהצינורית ממוקמת באופן פרוקסימלי כדי למנוע חסימה של נקודות הביפורקציה.
11. טבלו את הגפיים האחוריות הנרכשות בתמיסת מלח עם אגירת פוספטים (PBS) עד לדה-סלולריזציה.

איור 1: רכישה של חולדה אחורית. (A) סימון חתך העור ברמת הרצועה המפשעתית מלרוחב לאמצעי. (B) מבט על וריד הירך ועורק הירך, אשר נותחו באופן פרוקסימלי לכיוון הרצועה המפשעתית, המסומנים על ידי הקו המקווקו. קיצורים: L = לרוחב; M = מדיאלי; FV = וריד הירך; FA = עורק הירך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

3. הכנת פתרונות

1. בבקבוק זכוכית בנפח 6 ליטר, הכינו מאגר דטרגנטים בנפח 5 ליטר המכיל 0.25% נתרן דודציל סולפט (SDS) על ידי המסת 12.5 גרם אבקת SDS ב-5 ליטר מים מזוקקים במיוחד. מכסים את פתח הבקבוקון בפרפילם כדי לאטום אותו.
2. בצנצנת זכוכית בנפח 1 ליטר, הכינו בנפרד 1 ליטר של תמיסת SDS של 0.25% על ידי המסת 2.5 גרם של SDS בליטר אחד של מים מזוקקים במיוחד. הוסיפו מוט ערבוב כדי לערבב את התמיסה על מערבל מגנטי עד שכל ה-SDS מומס.
3. הכינו 1 ליטר של תמיסת PBS אחת עם תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית (AA) של 1%. בבקבוק 1 ליטר, הוסף 990 מ"ל של תמיסת PBS אחת ו-10 מ"ל של AA.
4. בנפרד, בצנצנת זכוכית של 500 מ"ל, הכינו שוב תמיסת PBS + 1% AA אחת באמצעות 495 מ"ל של תמיסת PBS אחת ו-5 מ"ל של AA.
5. הכינו 200 מ"ל של 1% חומצה פראצטית (PAA)/4% אתנול (EtOH) פתרון. הכן פתרון זה מתחת למכסה אדים.

4. ביוריאקטור ובניית מעגלי פרפוזיה

הערה: עיין באיור 2 עבור התצורה של הביוריאקטור ומעגל הזליפה לאורך השלבים המפורטים.

1. בתא של 500 מ"ל (מיכל פלסטיק), קדחו שלושה חורים (1/4 אינץ') במקומות המסומנים באיור 2: יציאה A היא קו הכניסה, יציאה B היא קו החידוש, ויציאה C היא קו היציאה. הסר והשלך פלסטיק עודף. רססו ונגבו את התא ב-70% אתנול.
2. חותכים שלושה צינורות סיליקון באורך 5 ס"מ ומכניסים אחד באמצע הדרך לכל יציאה של התא. חבר מחבר Luer זכר בפתח יציאה A הפונה לחלק הפנימי של התא ומחבר Luer נקבה בקצה השני של הצינור מחוץ לתא.
3. חבר מחבר Luer נקבה ביציאה B וביציאה C בקצות הצינורות הפונים אל מחוץ לתא.
4. במכסה אטום לאוויר למיכל הפלסטיק, קדחו חור אחד על פני המכסה.
5. חותכים צינור סיליקון בקוטר 3 ס"מ ומכניסים אותו לחור המכסה. ודאו שכ-2 ס"מ מהצינור ממוקמים מחוץ למכסה, כפי שמוצג באיור 2.
6. יש לעקר הן את התא והן את המכסה בעזרת הצינורות.
7. חותכים שני צינורות סיליקון בקוטר 30 ס"מ בעזרת מספריים. חבר 1/16 אינץ' למחבר של 1/8 אינץ' בקצה אחד של כל צינור.
8. בנפרד, חותכים שני צינורות סיליקון בקוטר 12 ס"מ באמצעות מספריים. חבר 1/16 אינץ' למחבר של 1/8 אינץ' בקצה אחד של שני הצינורות. חבר מחבר Luer זכר בקצה השני של צינור אחד ומחבר Luer נקבה לצינור השני.
9. יש לחטא את כל חומר הצינורות משלב 4.7 ושלב 4.8. כלול שני צינורות משאבה 3-stop (1.85 מ"מ) בעיקור.
10. הכינו שלושה מזרקים תלת-כיווניים, מסנן מזרק אחד, שני פיפטות סרולוגיות של 1 מ"ל ומזרק אחד של 10 מ"ל למערך הדה-סלוליזציה. הסר את המסנן מהפיפטות הסרולוגיות של 1 מ"ל.

איור 2: הכנת ביו-ריאקטור ובניית מעגלי פרפוזיה. המנגנון המוצג של מעגל הזליפה כולל (A) משאבה פריסטלטית ו-(B) קלטות מתאימות הן לקווי הכניסה והן לקווי היציאה. (ג, ד) צינורות סיליקון של 12 ס"מ ו -30 ס"מ מוצגים גם עם מחברים בהתאמה. (E) צינורות למשאבה פריסטלטית (1.85 מ"מ). תא ביוריאקטור עם יציאות מסומנות עבור (F) זרימה, (G) יציאה מתחדשת, ו-(H) יציאה. (I) מכסה ביוריאקטור מוצג עם יציאת אוורור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

5. דה-סלוליזציה של חולדות אחוריות

1. הנח את התא המעוקר והבורג על שלושה פקקי חד-כיווניים תלת-כיווניים בכניסה, בשקע ובקווי החידוש. ודא שפתח העצירה של יציאת החידוש מוגבל לשתי היציאות הנותרות שלו כדי למנוע דליפה.
2. חבר את הצינורות המיוצרים בשלב 4.8 לעצירות בקווי הכניסה והיציאה.
3. חבר צינורות פריסטלטיים לצינורות בשלב למעלה. מהדקים את הקלטת על הצינורות הפריסטלטיים ומניחים אותה על המשאבה הפריסטלטית. אין לאבטח את הקסטות עם צינורות במקום עדיין.
4. חבר צינור אחד משלב 4.7 לסוף הצינורות הפריסטלטיים של קו היציאה מהשלב שמעל. חבר פיפטה סרולוגית של 1 מ"ל בקצה השני. להשעות את הקצה מחובר עם פיפטה סרולוגית בבקבוק מאגר הפסולת.
5. חזור על שלב 4.7 עבור קו הכניסה. להשעות את קצה הצינור המחובר לפיפטה הסרולוגית לתוך מאגר חומרי הניקוי. אטמו מיד את פתיחת בקבוק מאגר חומרי הניקוי עם פרפילם. ראו איור 3A,B לסקירה כללית של מעגל הדה-סלוליזציה.
6. הוסיפו 0.25% SDS מצנצנת הזכוכית בנפח 1 ליטר (שלב 3.2) לתא הביוריאקטור בגובה מחצית הדרך.
7. קח את החלק האחורי שנרכש באמצעות מלקחיים של אדסון והשעה אותו לתוך תא הביוריאקטור בזהירות.
8. השתמש בשני זוגות של מלקחיים מסוג Adson כדי להנחות את החלק המשומר של החלק האחורי אל קו הכניסה. בעת החזקת הצינורית בזוג מלקחיים אחד, השתמש בזוג המלקחיים השני כדי לסובב ולהדק את קו הכניסה לצינורית. ודאו שהצינורית אינה נמשכת או מעוותת כדי למנוע פירוק.
9. לאחר האבטחה, הוסיפו עוד 0.25% SDS מצנצנת הזכוכית בנפח 1 ליטר כדי להטביע את הגפה במלואה, לפי הצורך. ודא שיציאת היציאה שקועה גם היא במאגר הביוריאקטור כדי להבטיח שמירה על זרימה עקבית (איור 3C).
10. חבר מסנן מזרק חד פעמי ליציאת האוורור במכסה של תא הביוריאקטור, בהתייחסו לשלב 4.4 ושלב 4.5.
11. הדקו את המכסה של הביוריאקטור וודאו שהתא אטום מכל הצדדים (איור 3B).
12. כדי להוציא אוויר מצינורות ולהכין את מעגל הזליפה, השתמש במזרק חדש וחד-פעמי של 10 מ"ל כדי לשאוב חומר ניקוי ממאגר חומרי הניקוי באמצעות הפקק התלת-כיווני בקו הכניסה.
13. לאחר המשיכה, השתמש באותו נוזל כדי להחדיר לתוך stopcock 3-way בקו היציאה. ודאו שיש חומר ניקוי לאורך כל הצינורות הן בקווי הכניסה והן בקווי היציאה.
14. לחץ למטה והדק את הקסטות עם הצינורות לתוך המשאבה הפריסטלטית. הפעל את המשאבה הפריסטלטית באמצעות לחצן ההפעלה.
    1. במסך המשאבה הפריסטלטית, המשך לכרטיסייה השנייה באמצעות מקש החץ כדי להגדיר את קצב הזלוף עבור הערוץ הראשון. קצב זרימת קלט כמצב המסירה והגדר את קצב הזלוף על 1 מ"ל/דקה. ודא שכיוון הזרימה נכון בהתאם למערך המכשירים. חזור על הפעולה עבור הערוץ השני.
    2. כייל את המשאבה הפריסטלטית כדי להבטיח שכמות הנוזלים המועברת דרך קו הכניסה ו/או הנלקחת מקו היציאה זורמת בקצב עקבי בין השניים. ודא שמזהה הצינורות מוגדר ל-1.85 מ"מ.
15. התחל דה-סלוליזציה באמצעות זליגת מכונה במהירות של 1 מ"ל/דקה הן עבור קווי הכניסה והן עבור קווי היציאה על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה בלוח המקשים. נטר וודא שהזרימה עקבית ומתמשכת הן בקווי הכניסה והן בקווי היציאה.
16. יש להמשיך בדה-סלולריזציה ולנטר מדי יום. השתמש ב-1 ליטר של 0.25% SDS (שלב 3.2) כדי לחדש את מאגר הביוריאקטור דרך יציאת החידוש, לפי הצורך. חפשו מראה לבן ושקוף של הרקמה, אשר יופיע עד יום 5, המציין decellularization של החולדה האחורית.

איור 3: סקירה כללית של מעגל ביוריאקטור של פרפוזיה דה-סלולאריזציה של חולדה. (A) ייצוג סכמטי של מעגל פרפוזיה ביוריאקטור. חיצים כחולים מציינים את כיוון זרימת חומרי הניקוי והפסולת. (B) סקירה כללית של מעגל הדה-סלוליזציה עם ביוריאקטור המכיל חולדה אחורית. מאגר SDS (בקבוקון שמאלי) מוביל לתוך המשאבה הפריסטלטית ולתוך צינורות הכניסה של הביוריאקטור. הזרימה מחוברת למאגר הפסולת (בקבוקון ימני) דרך המשאבה הפריסטלטית. (C) (I) ביוריאקטור המכיל אחורי חולדה עם צינורות כניסה המחוברים לעורק הירך המשומר. (II) חידוש יציאה הממוקמת בפינה עבור חומר ניקוי perfused. (III) צינורות זרימה תלויים במאגר תלוי. קיצור: SDS = נתרן דודציל סולפט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

6. כביסה ועיקור לאחר דה-סלוליזציה

1. לאחר אישור הדה-סלולריזציה, החלף את מאגר חומרי הניקוי במאגר 1x PBS + 1% AA. חותמים את פתיחת הבקבוקון עם פרפילם. יש להתחיל 1x PBS + 1% זליגת AA במהירות של 1 מ"ל/דקה ולהמשיך במשך יומיים.
2. החלף את מאגר 1x PBS + 1% AA עם 200 מ"ל של 0.1% PAA / 4% מאגר EtOH והתחל זלוף ב 1 מ"ל / דקה במשך 2 שעות.
3. נתקו את החלק האחורי מקו הכניסה באמצעות שני זוגות של מלקחי אדסון סטריליים, כאשר זוג מלקחיים אחד מסובב את קו הכניסה והשני מחזיק את הצינורית. ודא כי הצינורית אינה נמשכת כדי למנוע decannulation.
4. יש לאחסן את הגפה בצנצנת זכוכית בגודל 500 מ"ל המכילה 1x PBS + 1% AA ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

תוצאות

פרוטוקול הרכש הצליח לבודד ולשמר את עורקי הירך המשותפים לשלבי הזלוף הבאים. תמונות הנתיחה המייצגות באיור 1A,B מראות את מיקום החתך והחשיפה של כלי הירך עם מרחק מספיק מנקודות הביפורקציה. איור 2 מראה את המנגנון הדרוש להכנת הביו-ריאקטור ומעגל הזליפה. נקוד?...

Discussion

עכברושים אחוריים שימושיים כמודלים ניסיוניים ב-VCA⁵. הנדסת רקמות של פיגומים תאיים מייצגת את הצעד הראשון בטיפול בחסרונות של משטרי דיכוי חיסוני ארוכי טווח הקשורים ל-VCA. השימוש בשתלים מרוכבים מהווה אתגר נוסף בהתחשב בנוכחותן של רקמות מרובות, שלכל אחת מהן תכונות תפקודיות, אימונוגניו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL	Baxter Corporation	JB1308M
1 mL Disposable Serological Pipets	VWR	75816-102
10 cc Disposable Syringes			Obtained from Research Institution
3-way Stopcock			Obtained from Research Institution
5cc Disposable Syringes			Obtained from Research Institution
70% Isopropyl Alcohol			Obtained from Research Institution
Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm	VWR	CA28143-310
Adson Forceps, Straight	Fine Science Tools	11006-12
Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”)	VWR	38112
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL	Multicell	450-115-EL
Bone Cutter	Fine Science Tools	12029-12
Connectors for  1/16" to 1/8" Tubes	McMasterCarr	5117K52
Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID	McMasterCarr	51525K328
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fine Forceps with Micro-Blunted Tips	Fine Science Tools	11253-20
Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL	LEO Pharma Inc.	006174-09
Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID	McMasterCarr	51525K322
Micro Needle Holder	WLorenz	04-4125
Microscissors	WLorenz	SP-4506
Peracetic Acid	Sigma Aldrich	269336-100ML
Peristaltic Pump, 3-Channel	Cole Parmer	RK-78001-68
Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL	Wisent	311-425-CL
Povidone Surgical Scrub Solution			Obtained from Research Institution
Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL	Cole Parmer	RK-96450-40
Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone	Cole Parmer	RK-96410-16
Scalpel Blade - #10	Fine Science Tools	10010-00
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg	Bioshop	SDS003.1
Surgical Suture #6-0	Covidien	VS889