Vaskülarize Kompozit Allotransplantasyon için Ex Vivo Perfüzyon Bazlı Biyoreaktör Kullanılarak Sıçan Arka Bacaklarının Tedariği ve Desellülarizasyonu

Özet

Bu yazıda kompozit sıçan arka bacakları için cerrahi teknik ve desellülarizasyon süreci anlatılmaktadır. Desellülarizasyon, bir ex vivo makine perfüzyon sistemi aracılığıyla düşük konsantrasyonlu sodyum dodesil sülfat kullanılarak gerçekleştirilir.

Özet

Ciddi travmatik yaralanmaları ve doku kaybı olan hastalar karmaşık cerrahi rekonstrüksiyon gerektirir. Vaskülarize kompozit allotransplantasyon (VCA), kompozit bir alt birim olarak birden fazla dokunun transferi için gelişen bir rekonstrüktif yoldur. VCA'nın umut verici doğasına rağmen, uzun süreli immünsüpresif gereksinimler, maligniteler, son organ toksisitesi ve fırsatçı enfeksiyonlar riskinin artması nedeniyle önemli bir sınırlamadır. Asellüler kompozit iskelelerin doku mühendisliği, immünsüpresyon ihtiyacını azaltmada potansiyel bir alternatiftir. Burada, bir sıçan arka bacağının tedariki ve ardından sodyum dodesil sülfat (SDS) kullanılarak desellülarizasyonu açıklanmaktadır. Sunulan tedarik stratejisi ortak femoral artere dayanmaktadır. Bir makine perfüzyon bazlı biyoreaktör sistemi inşa edildi ve arka bacağın ex vivo desellülarizasyonu için kullanıldı. Başarılı perfüzyon desellülarizasyonu gerçekleştirildi ve arka bacak beyaz yarı saydam benzeri bir görünüm elde edildi. Arka bacak boyunca sağlam, perfüzyona uğramış, vasküler bir ağ gözlendi. Histolojik analizler, nükleer içeriğin çıkarıldığını ve tüm doku bölmelerinde doku mimarisinin korunduğunu gösterdi.

Giriş

VCA, karmaşık cerrahi rekonstrüksiyon gerektiren hastalar için yeni ortaya çıkan bir seçenektir. Travmatik yaralanmalar veya tümör rezeksiyonları, rekonstrüksiyonu zor olabilen hacimsel doku kaybına neden olur. VCA, deri, kemik, kas, sinirler ve damarlar gibi çoklu dokuların bir donörden bir alıcıya kompozit greft olarak nakledilmesini sağlar¹. Umut verici doğasına rağmen, VCA uzun süreli immünosüpresif rejimler nedeniyle sınırlıdır. Bu tür ilaçların yaşam boyu kullanımı, fırsatçı enfeksiyonlar, maligniteler ve son organ toksisitesi için artmış riske neden olur ^1,2,3. İmmünsüpresyon ihtiyacını azaltmaya ve / veya ortadan kaldırmaya yardımcı olmak için, VCA için desellülarizasyon yaklaşımlarını kullanan doku mühendisliği iskeleleri büyük umut vaat etmektedir.

Doku desellülarizasyonu, hücresel ve nükleer içeriği uzaklaştırırken hücre dışı matriks yapısının korunmasını gerektirir. Bu desellülarize iskele, hastaya özgü hücrelerle yeniden doldurulabilir⁴. Bununla birlikte, ECM kompozit doku ağının korunması ek bir zorluktur. Bunun nedeni, bir iskele içinde değişen doku yoğunluklarına, mimarilerine ve anatomik konumlarına sahip çoklu doku tiplerinin varlığıdır. Mevcut protokol, bir sıçan arka bacağı için cerrahi bir teknik ve bir desellülarizasyon yöntemi sunmaktadır. Bu, bu doku mühendisliği tekniğini kompozit dokulara uygulamak için bir kavram kanıtı modelidir. Bu aynı zamanda reselülilarizasyon yoluyla kompozit dokuları yeniden oluşturmak için sonraki çabaları da tetikleyebilir.

Protokol

Toronto Genel Hastanesi Araştırma Enstitüsü'nden elde edilen kadavra erkek Lewis sıçanları (300-430 g) tüm deneyler için kullanıldı. Tüm cerrahi prosedürler için, aseptik tekniği sürdürmek için steril aletler ve malzemeler kullanıldı ( bakınız Malzeme Tablosu). Tüm prosedürler, Toronto Genel Hastanesi Araştırma Enstitüsü, Üniversite Sağlık Ağı'ndaki (Toronto, ON, Kanada) Hayvan Bakım Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Toplam dört arka bacak hücresizleştirildi.

1. Ameliyat öncesi hazırlık

1. 50 mL% 5 heparinize salin hazırlayın. 50 mL'lik bir tuzlu su torbasından, 5 mL'lik bir şırınga kullanarak 2,5 mL'lik bir tuzlu su çözeltisi alın ve atın. 5 mL'lik bir şırınga kullanarak, tuzlu su torbasına 2,5 mL heparin ekleyin. İçeriğini karıştırmak için tuzlu su torbasını ters çevirin.
2. Kadavra bir sıçanı mavi bir pedin altına sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Arka bacak ve kasık bölgesini elektrikli tıraş makinesi kullanarak çevresel olarak tıraş edin ve saçları çıkarın.
3. Sıçanı cerrahi istasyona getirin ve arka bacak ve kasık bölgesine bir gazlı bez kullanarak Povidon iyot ovma çözeltisi uygulayın. Daha sonra, gazlı bez kullanarak ovma çözeltisini silmek için% 70 izopropil alkol uygulayın.
4. Mavi pedi adım 1.2'den atın ve yeni, steril eldivenlere geçin.

2. Sıçan arka bacak tedariki

1. Kasık bağı seviyesi boyunca bir # 10 cerrahi bıçak ve bir # 3 bıçak koşucusu kullanarak, yanaldan medial bir yöne doğru hareket ederek bir cilt kesisi yapın (Şekil 1A). Düzgün bir kesi sağlamak için çevreleyen cildi tutmak için Adson forseps kullanın.
2. Altta yatan yağ açığa çıktığında, yağdan dikkatlice diseksiyon yapmak için künt diseksiyon kullanın. Superior epigastrik damarları bulun.
3. Proksimal olarak diseksiyon yapmak ve altta yatan femoral siniri, arteri ve veni inguinal ligament seviyesinde ortaya çıkarmak için mikromakas kullanın.
4. Bir diseksiyon mikroskobu altında, femoral damarları tanımlayın ve arteriyel ağın çatallanma noktalarından yeterli uzunluk elde etmek için ince forseps kullanarak arteri ve veni proksimal olarak diseke edin (Şekil 1B).
5. Femoral arter ve veni ayrı ayrı 6-0 sütür kullanarak bağlayın.
6. Bağlı femur damarlarını bozmadan arka bacağın geri kalanı etrafında çevresel diseksiyon yapın.
7. Bir kemik kesici kullanarak femur kemiğini orta uzunlukta transekte edin.
8. Arka bacağı tamamen izole etmek için, mikromakas kullanarak ligatürlerin altındaki bağlı femur damarlarını transekte edin.
9. Diseksiyon mikroskobu altında 24 G anjiyokateter kullanarak femoral arteri kanüle edin. Kanülü dikkatlice yerleştirmek için ince forseps kullanın. Femoral venden net bir çıkış gözlenene kadar heparinize salin ile yıkayın.
10. Kanüllenmiş kabın etrafına bir dikiş ve kanülün etrafına distal olarak başka bir dikiş bağlayarak kanülü sabitleyin. Bifurkasyon noktalarının tıkanmasını önlemek için kanülün yakınına yerleştirildiğinden emin olun.
11. Tedarik edilen arka bacakları desellülarizasyona kadar fosfat tamponlu salin (PBS) içine batırın.

Şekil 1: Sıçan arka bacağı tedariği. (A) Kasık bağı seviyesinde deri kesisinin lateral olandan mediale doğru işaretlenmesi. (B) Kasık ligamentine doğru proksimal edilmiş femoral ven ve femoral arterin görünümü, noktalı çizgi ile gösterilir. Kısaltmalar: L = yanal; M = medial; FV = femoral ven; FA = femoral arter. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Çözeltilerin hazırlanması

1. 6 L'lik bir cam şişede, 5 L ultra saf damıtılmış suda 12.5 g SDS tozunu çözerek% 0.25 sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren 5 L'lik bir deterjan haznesi hazırlayın. Şişenin açıklığını kapatmak için parafilm ile örtün.
2. 1 L'lik bir cam kavanozda, 1 L ultra saf damıtılmış suda 2.5 g SDS'yi çözerek 1 L% 0.25 SDS çözeltisini ayrı ayrı hazırlayın. Tüm SDS çözülene kadar çözeltiyi manyetik bir karıştırıcı üzerinde karıştırmak için bir karıştırma çubuğu ekleyin.
3. % 1 Antibiyotik-Antimikotik (AA) çözelti ile 1 L 1x PBS yıkama çözeltisi hazırlayın. 1 L'lik bir şişeye 990 mL 1x PBS çözeltisi ve 10 mL AA çözeltisi ekleyin.
4. Ayrı olarak, 500 mL'lik bir cam kavanozda, 495 mL 1x PBS çözeltisi ve 5 mL AA kullanarak tekrar 1x PBS +% 1 AA çözeltisi hazırlayın.
5. 200 mL% 1 perasetik asit (PAA) / % 4 etanol (EtOH) çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltiyi bir duman başlığı altında hazırlayın.

4. Biyoreaktör ve perfüzyon devresi yapımı

NOT: Listelenen adımlar boyunca biyoreaktör ve perfüzyon devresinin konfigürasyonu için Şekil 2'ye bakınız.

1. 500 mL'lik bir haznede (plastik kap), Şekil 2'deki etiketli yerlerde üç delik (1/4 inç) delin: Port A giriş hattıdır, Port B ikmal hattıdır ve Port C çıkış hattıdır. Fazla plastiği çıkarın ve atın. Odaya% 70 etanol püskürtün ve silin.
2. 5 cm uzunluğunda üç silikon tüp kesin ve odanın her bir portuna yarıya kadar yerleştirin. Odanın içine bakan A Limanı'nın açıklığına bir erkek Luer konektörü ve odanın dışındaki tüpün diğer ucuna bir dişi Luer konektörü bağlayın.
3. B ve C Bağlantı Noktalarında bir dişi Luer konektörünü, haznenin dışına bakan boruların uçlarına bağlayın.
4. Plastik kap için hava geçirmez bir kapakta, kapağın yüzeyinde bir delik açın.
5. 3 cm'lik bir silikon tüp kesin ve kapağın deliğine yerleştirin. Şekil 2'de gösterildiği gibi, tüpün yaklaşık 2 cm'sinin kapaktan dışarı yerleştirildiğinden emin olun.
6. Hem odayı hem de kapağı boru ile sterilize edin.
7. Makas kullanarak iki adet 30 cm'lik silikon tüp kesin. Her tüpün bir ucundaki 1/8 inçlik konektöre 1/16 inç bağlayın.
8. Ayrı olarak, makas kullanarak iki adet 12 cm'lik silikon tüp kesin. Her iki borunun bir ucundaki 1/8 inçlik konektöre 1/16 inç bağlayın. Bir tüpün diğer ucuna bir erkek Luer konektörü ve diğer tüpe bir dişi Luer konektörü bağlayın.
9. Tüm boru malzemesini adım 4.7 ve adım 4.8'den sterilize edin. Sterilizasyona iki adet 3 kademeli pompa borusu (1,85 mm) ekleyin.
10. Desellülarizasyon kurulumu için üç adet 3 stopcock, bir şırınga filtresi, iki adet 1 mL serolojik pipet ve bir adet 10 mL şırınga hazırlayın. Filtreyi 1 mL serolojik pipetlerden çıkarın.

Resim 2: Biyoreaktör ve perfüzyon devresi yapımının hazırlanması. Perfüzyon devresinin (A) peristaltik pompa ve (B) hem giriş hem de çıkış hatları için karşılık gelen kasetleri içeren aparatı. (C, D) 12 cm ve 30 cm'lik silikon borular da ilgili konektörlerle birlikte gösterilmektedir. (E) Peristaltik pompa borusu (1,85 mm). (F) giriş, (G) ikmal portu ve (H) çıkış için etiketli portlara sahip biyoreaktör odası. (I) Havalandırma portu ile gösterilen biyoreaktör kapağı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. Sıçan arka bacaklarının desellülarizasyonu

1. Sterilize edilmiş hazneyi yerleştirin ve vidayı giriş, çıkış ve ikmal hatlarındaki üç adet tek kullanımlık 3 stopcock'a yerleştirin. Sızıntıyı önlemek için ikmal portunun stopcock'unun kalan iki portunda kapatıldığından emin olun.
2. Adım 4.8'de yapılan tüpleri giriş ve çıkış hatlarındaki tıpalara takın.
3. Peristaltik boruları yukarıdaki adımda tüplere bağlayın. Kaseti peristaltik boruya sabitleyin ve peristaltik pompaya yerleştirin. Kasetleri henüz boru ile sabitlemeyin.
4. Bir tüpü adım 4.7'den çıkış hattının peristaltik borusunun sonuna yukarıdaki adımdan bağlayın. Diğer uca 1 mL'lik bir serolojik pipet bağlayın. Atık haznesi şişesinde serolojik bir pipetle tutturulmuş ucu askıya alın.
5. Giriş satırı için adım 4.7'yi yineleyin. Serolojik pipete bağlı tüpün ucunu deterjan haznesine askıya alın. Deterjan haznesi şişesinin açıklığını derhal parafilm ile kapatın. Desellülarizasyon devresine genel bir bakış için Şekil 3A,B'ye bakınız.
6. 1 L cam kavanozdan (adım 3.2) yarı yolda biyoreaktör odasına %0,25 SDS ekleyin.
7. Adson forseps kullanarak tedarik edilen arka bacağı alın ve biyoreaktör odasına dikkatlice askıya alın.
8. Arka bacağın kanüllenmiş kısmını giriş çizgisine yönlendirmek için iki çift Adson forseps kullanın. Kanülü bir çift forseps ile tutarken, giriş çizgisini kanüle bükmek ve sabitlemek için diğer forseps çiftini kullanın. Silinmeyi önlemek için kanülün çekilmediğinden veya bükülmediğinden emin olun.
9. Sabitlendikten sonra, gerektiğinde uzuvları tamamen suya batırmak için 1 L cam kavanozdan% 0,25 daha fazla% SDS ekleyin. Tutarlı çıkışın korunmasını sağlamak için çıkış portunun da biyoreaktör rezervuarına batırıldığından emin olun (Şekil 3C).
10. Adım 4.4 ve adım 4.5'e atıfta bulunarak biyoreaktör odasının kapağındaki havalandırma portuna tek kullanımlık bir şırınga filtresi takın.
11. Biyoreaktörün kapağını sabitleyin ve odanın her taraftan kapatıldığından emin olun (Şekil 3B).
12. Havayı borudan çıkarmak ve perfüzyon devresini hazırlamak için, giriş hattındaki 3 stopcock'u kullanarak deterjanı deterjan haznesinden çekmek için yeni, tek kullanımlık 10 mL şırınga kullanın.
13. Çekildikten sonra, çıkış hattındaki 3 stopcock'a yerleştirmek için aynı sıvıyı kullanın. Boru boyunca hem giriş hem de çıkış hatlarında deterjan bulunduğundan emin olun.
14. Kasetleri aşağı bastırın ve boruyla peristaltik pompaya sabitleyin. Güç düğmesini kullanarak peristaltik pompayı açın.
    1. Peristaltik pompa ekranında, ilk kanalın perfüzyon hızını ayarlamak için ok tuşunu kullanarak ikinci sekmeye geçin. Teslimat şekli olarak giriş debisi ve perfüzyon hızını 1 mL / dak olarak ayarlayın. Aparat kurulumuna göre akış yönünün doğru olduğundan emin olun. İkinci kanal için bu işlemi tekrarlayın.
    2. Giriş hattından iletilen ve/veya çıkış hattından alınan sıvı miktarının ikisi arasında tutarlı bir hızda aktığından emin olmak için peristaltik pompayı kalibre edin. Boru kimliğinin 1,85 mm'ye ayarlandığından emin olun.
15. Tuş takımındaki güç düğmesine basarak hem giriş hem de çıkış hatları için 1 mL/dak'da makine perfüzyonu yoluyla hücre desellülarizasyonuna başlayın. Akışın hem giriş hem de çıkış hatlarında tutarlı ve sürekli olduğundan emin olun ve izleyin.
16. Desellülarizasyona devam edin ve günlük olarak izleyin. Biyoreaktör rezervuarını gerektiğinde ikmal portundan doldurmak için 1 L% 0.25 SDS'yi (adım 3.2) kullanın. Sıçan arka bacaklarının desellülarizasyonunu gösteren, 5. günde ortaya çıkacak olan dokunun beyaz, yarı saydam bir görünümünü arayın.

Şekil 3: Sıçan arka bacağının perfüzyon desellülarizasyon biyoreaktör devresine genel bakış. (A) Biyoreaktör perfüzyon devresinin şematik gösterimi. Mavi oklar deterjan ve atık akışının yönünü gösterir. (B) Sıçan arka bacağını içeren biyoreaktörlü desellülarizasyon devresine genel bakış. SDS rezervuarı (sol şişe) peristaltik pompaya ve biyoreaktörün giriş borusuna yol açar. Çıkış, peristaltik pompa aracılığıyla atık rezervuarına (sağ şişe) bağlanır. (C) (I) Kanüllenmiş femoral artere bağlı giriş borusu ile sıçan arka bacağı içeren biyoreaktör. (II) Perfüze deterjan için köşede bulunan ikmal portu. (III) Süspansiyon haznesinde asılı duran çıkış borusu. Kısaltma: SDS = sodyum dodesil sülfat. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. Desellülarizasyon sonrası yıkama ve sterilizasyon

1. Desellülarizasyonun onaylanmasını takiben, deterjan haznesini 1x PBS +% 1 AA haznesi ile değiştirin. Şişenin açıklığını parafilm ile kapatın. 1x PBS +% 1 AA perfüzyonuna 1 mL / dak'da başlayın ve 2 gün boyunca devam edin.
2. 1x PBS + %1 AA rezervuarını 200 mL'lik %0,1 PAA/%4 EtOH rezervuarı ile değiştirin ve 2 saat boyunca 1 mL/dk'da perfüzyona başlayın.
3. İki çift steril Adson forseps kullanarak arka bacağı giriş hattından ayırın, bir çift forseps giriş çizgisini bükmek için diğeri kanülü tutar. Dekülasyonu önlemek için kanülün çekilmediğinden emin olun.
4. Uzuvları, daha fazla kullanana kadar 4 ° C'de 1x PBS +% 1 AA içeren 500 mL'lik bir cam kavanozda saklayın.

Sonuçlar

Tedarik protokolü, sonraki perfüzyon adımları için ortak femoral arterlerin izole edilmesi ve kanülasyonunda başarılı olmuştur. Şekil 1A,B'deki temsili diseksiyon görüntüleri, bifurkasyon noktalarından yeterli mesafede femur damarlarının insizyon yerini ve maruziyetini göstermektedir. Şekil 2, biyoreaktör ve perfüzyon devresini hazırlamak için gerekli olan aparatı göstermektedir. Desellülarizasyonun bitiş noktası, do...

Tartışmalar

Sıçan arka bacakları VCA 5'te deneysel modeller olarak^{kullanışlıdır}. Asellüler iskelelerin doku mühendisliği, VCA ile ilişkili uzun süreli immünsüpresyon rejimlerinin eksikliklerini ele almada ilk adımı temsil eder. Kompozit greftlerin kullanımı, her biri benzersiz fonksiyonel, immünojenik ve yapısal özelliklere sahip çoklu dokuların varlığı göz önüne alındığında ek bir zorluk oluşturmaktadır. Mevcut protokol, asellüler kompozit sıçan arka bacaklarının elde ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL	Baxter Corporation	JB1308M
1 mL Disposable Serological Pipets	VWR	75816-102
10 cc Disposable Syringes			Obtained from Research Institution
3-way Stopcock			Obtained from Research Institution
5cc Disposable Syringes			Obtained from Research Institution
70% Isopropyl Alcohol			Obtained from Research Institution
Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm	VWR	CA28143-310
Adson Forceps, Straight	Fine Science Tools	11006-12
Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”)	VWR	38112
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL	Multicell	450-115-EL
Bone Cutter	Fine Science Tools	12029-12
Connectors for  1/16" to 1/8" Tubes	McMasterCarr	5117K52
Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID	McMasterCarr	51525K328
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fine Forceps with Micro-Blunted Tips	Fine Science Tools	11253-20
Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL	LEO Pharma Inc.	006174-09
Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID	McMasterCarr	51525K322
Micro Needle Holder	WLorenz	04-4125
Microscissors	WLorenz	SP-4506
Peracetic Acid	Sigma Aldrich	269336-100ML
Peristaltic Pump, 3-Channel	Cole Parmer	RK-78001-68
Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL	Wisent	311-425-CL
Povidone Surgical Scrub Solution			Obtained from Research Institution
Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL	Cole Parmer	RK-96450-40
Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone	Cole Parmer	RK-96410-16
Scalpel Blade - #10	Fine Science Tools	10010-00
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg	Bioshop	SDS003.1
Surgical Suture #6-0	Covidien	VS889