إعداد حلقة الشريان التاجي الموحدة للفئران والتسجيل في الوقت الفعلي لتغيرات التوتر الديناميكي على طول قطر الوعاء

Summary

يصف هذا البروتوكول تقنية التصوير العضلي السلكي لقياس التفاعل الوعائي للشريان التاجي للفئران.

Abstract

كحدث رئيسي لأمراض الجهاز القلبي الوعائي ، تم اعتبار مرض الشريان التاجي (CAD) على نطاق واسع الجاني الرئيسي لتصلب الشرايين واحتشاء عضلة القلب والذبحة الصدرية ، والتي تهدد بشكل خطير حياة وصحة الناس في جميع أنحاء العالم. ومع ذلك ، فإن كيفية تسجيل الخصائص الميكانيكية الحيوية الديناميكية للأوعية الدموية المعزولة قد حيرت الناس منذ فترة طويلة. وفي الوقت نفسه ، أصبح تحديد المواقع الدقيقة وعزل الشرايين التاجية لقياس تغيرات التوتر الوعائي الديناميكي في المختبر اتجاها في تطوير دواء CAD. يصف هذا البروتوكول التحديد العياني والفصل المجهري للشرايين التاجية للفئران. تمت مراقبة وظيفة الانكماش والتمدد لحلقة الشريان التاجي على طول قطر الوعاء باستخدام نظام myograph المتعدد المعمول به. تعمل البروتوكولات الموحدة والمبرمجة لقياس توتر الحلقة التاجية ، من أخذ العينات إلى الحصول على البيانات ، على تحسين قابلية تكرار البيانات التجريبية بشكل كبير ، مما يضمن صحة سجلات التوتر الوعائي بعد التدخل الفسيولوجي والمرضي والدواءي.

Introduction

تم الاعتراف بمرض الشريان التاجي (CAD) على نطاق واسع والقلق كمرض قلبي وعائي نموذجي وتمثيلي ، كونه السبب الرئيسي للوفاة في كل من البلدان المتقدمة والنامية ^1,2. كطريق لإمداد الدم والأكسجين للوظيفة الفسيولوجية الطبيعية للقلب ، يدخل الدم المتداول ويغذي القلب من خلال شريانين تاجيين رئيسيين وشبكة وعائية دموية على سطح عضلة القلب ^3,4. تقطع رواسب الكوليسترول والدهون في الشرايين التاجية إمدادات الدم في القلب والاستجابة الالتهابية العنيفة لنظام الأوعية الدموية ، مما يسبب تصلب الشرايين أو الذبحة الصدرية المستقرة أو الذبحة الصدرية غير المستقرة أو احتشاء عضلة القلب أو الموت القلبي المفاجئ ^5,6. استجابة للتضيق المرضي للشرايين التاجية ، فإن ضربات القلب الفسيولوجية التعويضية المتسارعة ترضي إمدادات الدم من القلب نفسه أو الأعضاء الحيوية في الجسم عن طريق زيادة إنتاج البطين الأيسر⁷. إذا لم يتم تخفيف تضيق الشريان التاجي لفترات طويلة في الوقت المناسب ، فقد تتطور أوعية دموية جديدة واسعة النطاق في مناطق معينة من القلب⁸. في الوقت الحاضر ، غالبا ما يعتمد العلاج السريري ل CAD انحلال الجلطات الدوائي أو انحلال الجلطات الميكانيكية الجراحية وتجاوز الأوعية الدموية الإلكترونية الخارجية مع الأدوية المتكررة والإعاقة الجراحية الكبيرة⁹. لذلك ، لا يزال التحقيق الوظيفي للنشاط الفسيولوجي للشريان التاجي اختراقا عاجلا لأمراض القلب والأوعية الدموية¹⁰.

لا توجد وسائل تقنية متاحة للكشف عن النشاط الفسيولوجي التاجي ، باستثناء أنظمة القياس عن بعد اللاسلكية ، والتي يمكنها التسجيل ديناميكيا في ضغط الشريان التاجي في الجسم الحي ، والتوتر الوعائي ، وتشبع الأكسجين في الدم ، وقيم الأس الهيدروجيني¹¹. لذلك ، بالنظر إلى السرية والتعقيد النسيجية للشرايين التاجية ، فإن التحديد الدقيق للشرايين التاجية وعزلها هما بلا شك أفضل الخيارات لاستكشاف آليات متعددة من CAD في المختبر⁴.

نظام myograph متعدد السلسلة ، ولا سيما كاشف التوتر الوعائي الدقيق السلكي المجهري (انظر جدول المواد) ، هو جهاز ناضج للغاية قابل للتسويق لتسجيل تغيرات توتر الأنسجة في المختبر للأنابيب الوعائية واللمفاوية والشعب الهوائية الصغيرة مع خصائص عالية الدقة وتسجيل ديناميكي مستمر¹². تم استخدام النظام المذكور على نطاق واسع لتسجيل خصائص توتر الأنسجة في المختبر لهياكل التجويف التي يتراوح قطرها من 60 ميكرومتر إلى 10 مم. تعوض ميزات التسخين المستمر لمنصة المجهر السلكي إلى حد كبير تحفيز البيئة الخارجية المعاكسة. وفي الوقت نفسه ، تسمح لنا المدخلات الثابتة لخليط الغاز وقيم الأس الهيدروجيني بالحصول على بيانات توتر الأوعية الدموية الأكثر دقة في حالة فسيولوجية مماثلة¹³. ومع ذلك ، بالنظر إلى تعقيد التوطين التشريحي للشرايين التاجية للفئران (الشكل 1) ، فإن عزلتها كانت محيرة وتحد من استكشاف الآلية لأمراض القلب والأوعية الدموية المتنوعة وتطوير الأدوية. لذلك ، يقدم هذا البروتوكول الموقع التشريحي وعملية الفصل للشريان التاجي للفئران بالتفصيل ، يليه قياس التوتر على منصة التصوير المجهري السلكي¹⁴.

Protocol

تمت مراجعة البروتوكول الحيواني والموافقة عليه من قبل لجنة الإدارة من جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (السجل رقم 2021-11). تم استخدام ذكور الفئران Sprague Dawley (SD) (260-300 جم ، 8-10 أسابيع) لهذه الدراسة. تم الاحتفاظ بالفئران في غرفة حيوانية وكانت حرة في الشرب وتناول الطعام أثناء التجربة.

1. إعداد الحل

1. تحضير محلول الملح الفسيولوجي (PSS) عن طريق إذابة 118 ملليمتر من كلوريد الصوديوم ، 4.7 مللي متر من K ⁺ ، 2.5 ملم من CaCl 2 ، 1.2 mM من KH 2 PO₄ ، 1.2 mM من MgCl 2 ∙6H ₂ O ، 25 mM منNaHCO₃ ، 11 mM من D-glucose ، و 5 mM من HEPES (انظر جدول المواد).
2. تحضير محلول ملح K + عالي عن طريق إذابة 58 mM من كلوريد الصوديوم ، و 60 mM من K ⁺ ، و 2.5 mM من CaCl 2 ، و 1.2 mM من KH 2 PO4 ، و 1.2 mM من MgCl 2 ∙6H ₂ O ، و 25 mM من NaHCO₃ ، و 11 mM من D-glucose ، و 5 mM من HEPES.
3. تشبع المحاللين أعلاه والفقاعة بغاز مختلط بنسبة 95٪ O 2 و 5٪ CO₂. وفي الوقت نفسه ، حافظ على قيم الأس الهيدروجيني للمحلول بين 7.38 و 7.42 مع 2 mM NaOH.
   ملاحظة: للحصول على معلومات مفصلة حول إعداد الحل، يرجى الاطلاع على المرجع¹⁵.

2. تشريح الشريان التاجي الفئران

1. تخدير الفئران عن طريق استنشاق 2 ٪ من الأيزوفلوران. تأكد من التخدير العميق عن طريق قرصة إصبع القدم ، وإذا لزم الأمر ، قم بإعطاء مخدرات إضافية. ثم افتح التجويف الصدري على الفور لفضح القلب على طاولة العمليات المحمولة بعد تقرير نشر سابقا¹².
2. بعد فصل القلب وإزالته ، قم بتصريف الدم المتبقي من جميع غرف القلب عن طريق الضغط بشكل معتدل باستخدام ملقط بلاستيكي طبي. ضع القلب المعالج مسبقا بسرعة في طبق بتري يحتوي على 95٪ O 2 + 5٪ CO₂ PSS المشبع عند 4 درجات مئوية ، مع قيمة درجة الحموضة 7.40.
3. لتحديد الموقع التشريحي للشرايين التاجية بدقة ، اضبط وضع القلب المعزول تحت المجهر الضوئي وفقا للرسم البياني التخطيطي (الشكل 2A).
   ملاحظة: في المنظر الأمامي، كان الأذين الأيمن والشريان الرئوي في أعلى اليسار وأعلى اليمين، على التوالي.
   1. قطع تجاويف البطين الأيسر والأيمن على طول الحاجز بين البطينين من جذر الشريان الرئوي باستخدام مقص جراحي وملاقط (الشكل 2B).
4. لفصل الشرايين التاجية اليسرى واليمنى عن أنسجة عضلة القلب، قم بتشريح البطين الأيمن تحت المجهر التشريحي البصري لفضح فرع الشريان التاجي الأيمن بدقة. ثم حدد موضع الشريان التاجي الأيسر عن طريق تدوير أنسجة القلب 45 درجة في اتجاه عقارب الساعة (الشكل 2D).
5. بعد إزالة أنسجة عضلة القلب اللزجة المحيطة ، قم بتمييز الشرايين التاجية النابضة (حوالي 5 مم) واليمنى (حوالي 5 مم). افصل الشرايين التاجية في الوسط على الفور وانغمس تماما في PSS عند 4 درجات مئوية. الحصول على حلقة شريانية من حوالي 2 مم عن طريق قطع الشريان المنفصل عموديا بمقص تشريحي لتسجيل توتر الأوعية الدموية تحت محفزات مختلفة (الشكل 2E).

3. تعليق وتثبيت الحلقة الشريانية

ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول هذه الخطوة، يرجى الاطلاع على المرجع¹⁴.

1. قم بإعداد سلكين من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 2 سم (انظر جدول المواد) وانقع مسبقا في محلول PSS 4 درجات مئوية مشبع بنسبة 95٪ O 2 + 5٪ CO₂. مرر كلا السلكين بالتوازي عبر الحلقة الشريانية جنبا إلى جنب مع اتجاه الوعاء تحت المجهر التشريحي البصري ومع أسلاك متساوية الطول مكشوفة في طرفي تجويف الأوعية الدموية.
2. قم بإصلاح الحلقة الشريانية باستخدام الأسلاك الفولاذية الأمامية والخلفية في حمام المجهر السلكي المليء ب PSS الفقاعي مع 95٪ O 2 + 5٪ CO₂. قم بتدوير المقبض اللولبي الأفقي للحصول على تباعد أمامي وخلفي مناسب بحيث يكون السلكان أفقيين وتكون الحلقة الشريانية في حالة طبيعية من الاسترخاء.
3. بعد تثبيت حمام DMT على جهاز الترموستاتي ، افتح برنامج الحصول على البيانات (انظر جدول المواد) لضمان تسجيل إشارة المسار المقابلة. تعيين المعلمات التالية: معايرة العدسة (مم / div): 0.36 ؛ الضغط المستهدف (كيلو باسكال): 13.3 ؛ IC1/IC100: 0.9; متوسط الوقت عبر الإنترنت: 2 ثانية ؛ وقت التأخير: 60 ثانية. يتم عرض خطوات تثبيت الحلقة الشريانية في الشكل 3.

4. توحيد التوتر الوعائي في حلقة الشريان الفئران

ملاحظة: بالنسبة لعينات التجويف المختلفة ، كان التوتر الأولي الأمثل ضروريا للأوعية للحفاظ على نشاط استثنائي في المختبر. لمزيد من التفاصيل، يرجى الاطلاع على المرجع¹⁵.

1. تحقيق التوتر الأولي الأمثل للحلقة الشريانية عن طريق تطبيق توتر معقول على طول قطر الوعاء.
   ملاحظة: استنادا إلى الدراسة السابقة 16 ، تم تحقيق أقصى قدر من التوتر الناجم عن ناهض عند قيمة العامل k البالغة 0.90 مع توتر التمدد الأولي البالغ 1.16 ± 0.04 mN/mm (القيم المرجعية لعينات الأوعية المختلفة: قيمة k ، 0.90-0.95 ؛ التوتر الأولي ، 1.16-1.52 mN / mm).
2. عند هذه النقطة، اضبط قيمة توتر الأوعية الدموية المعروضة على الصفر. بعد ذلك ، ضع محفز سحب 3 mN على الحلقة الشريانية عن طريق تدوير المحور الحلزوني للحمام.
3. بعد الحضانة لمدة 1 ساعة في مخزن PSS المخزن المؤقت المشبع بالأكسجين عند 37 درجة مئوية ، الرقم الهيدروجيني 7.40 ، اضبط قيمة التوتر على 0 mN مرة أخرى على لوحة التحكم في التوتر في التصوير المجهري السلكي. يوضح الشكل 4 عملية إعداد التوتر الأولي للحلقة الشريانية.

5. الكشف التفاعلي عن حلقة الشريان التاجي

1. قم بإجراء النشاط الانقباضي لحلقة الشريان التاجي باستخدام تقنية myograph السلكية 14 ، وتحقق من صحتها في ثلاث عمليات منفصلة عن طريق التحفيز باستخدام 60 mM من محلول K ⁺ لمدة¹⁰ دقائق لكل منهما.
2. بعد كل تحفيز ، اغسل الحمام ب PSS المشبع بالأكسجين حتى تعود نغمة الأوعية الدموية إلى حالتها الأولية.
   ملاحظة: فقط عندما يكون تذبذب التوتر في القياسات الثلاثة المتوازية أقل من 10٪ ، وكانت سعة كل انكماش أكبر من 1 mN / mm ، يمكن استخدام حلقات شريانية مؤهلة ونشطة للغاية لمزيد من التجارب. يظهر التحقق من نشاط الحلقة التاجية للفئران في الشكل 5.

6. العلاج بعد الجراحة

1. بعد الجراحة ، القتل الرحيم للحيوانات باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا.
   ملاحظة: بالنسبة لهذه الدراسة ، تم قتل الحيوانات الرحيم عن طريق استنشاق الأيزوفلوران الزائد.

النتائج

في الموقع التشريحي ، لم يكن من السهل التعرف على شرايين الفئران التاجية الموزعة والمخفية في عمق أنسجة عضلة القلب. من خلال مقارنة الشرايين التاجية للبشر (الشكل 1A) والفئران (الشكل 1B) ، تم إجراء فصل سريع ودقيق للشرايين التاجية للفئران وفقا لعملية أخذ العينات في ...

Discussion

تم التعرف تدريجيا على اضطراب دوران الأوعية الدقيقة التاجية ، والذي ينطوي على مجموعة واسعة من المرضى الذين يعانون من CAD ، ويتعلق الأمر بأساس تروية عضلة القلب الكافية. بالنظر إلى المضاعفات الخطيرة لأمراض القلب التاجية المفاجئة وأمراض القلب والأوعية الدموية ، فإن الوقاية من الأدوية وعلاجها...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apigenin	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	150731
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A501330
D-glucose	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610219
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100781
LabChart Professional version 8.3	ADInstruments, Australia	—
MgCl2·6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100288
Multi myograph system	Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark	620M
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100241
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100865
Steel wires	Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark	400447
U46619	Sigma, USA	D8174