Preparación estandarizada del anillo coronario de la rata y registro en tiempo real de los cambios dinámicos de tensión a lo largo del diámetro del vaso

Resumen

El presente protocolo describe la técnica de miógrafo de alambre para medir la reactividad vascular de la arteria coronaria de la rata.

Resumen

Como un evento clave de las enfermedades del sistema cardiovascular, la enfermedad de las arterias coronarias (EAC) ha sido ampliamente considerada como el principal culpable de la aterosclerosis, el infarto de miocardio y la angina de pecho, que amenazan seriamente la vida y la salud de las personas en todo el mundo. Sin embargo, cómo registrar las características biomecánicas dinámicas de los vasos sanguíneos aislados ha desconcertado a las personas durante mucho tiempo. Mientras tanto, el posicionamiento preciso y el aislamiento de las arterias coronarias para medir los cambios de tensión vascular dinámica in vitro se han convertido en una tendencia en el desarrollo de fármacos CAD. El presente protocolo describe la identificación macroscópica y la separación microscópica de las arterias coronarias de ratas. La función de contracción y dilatación del anillo de la arteria coronaria a lo largo del diámetro del vaso se monitoreó utilizando el sistema de miógrafo múltiple establecido. Los protocolos estandarizados y programados de medición de la tensión del anillo coronario, desde el muestreo hasta la adquisición de datos, mejoran enormemente la repetibilidad de los datos experimentales, lo que garantiza la autenticidad de los registros de tensión vascular después de la intervención fisiológica, patológica y farmacológica.

Introducción

La enfermedad arterial coronaria (EAC) ha sido ampliamente reconocida y preocupada como una enfermedad cardiovascular típica y representativa, siendo la principal causa de muerte tanto en los países desarrollados como en los países en desarrollo ^1,2. Como vía de suministro de sangre y oxígeno para la función fisiológica cardíaca normal, la sangre circulante entra y nutre el corazón a través de dos arterias coronarias principales y una red vascular sanguínea en la superficie del miocardio ^3,4. Los depósitos de colesterol y grasa en las arterias coronarias cortan el suministro de sangre del corazón y la respuesta inflamatoria violenta del sistema vascular, causando aterosclerosis, angina estable, angina inestable, infarto de miocardio o muerte súbita cardíaca ^5,6. En respuesta a la estenosis patológica de las arterias coronarias, los latidos cardíacos fisiológicos acelerados compensatorios satisfacen el suministro de sangre del corazón mismo o de los órganos vitales del cuerpo al aumentar la producción del ventrículo izquierdo⁷. Si la estenosis coronaria prolongada no se alivia a tiempo, se pueden desarrollar nuevos vasos sanguíneos extensos en ciertas áreas del corazón⁸. En la actualidad, el tratamiento clínico de la EAC suele adoptar la trombólisis farmacológica o la trombólisis mecánica quirúrgica y un bypass vascular biónico exógeno con medicación frecuente y gran discapacidad quirúrgica⁹. Por lo tanto, la investigación funcional de la actividad fisiológica de la arteria coronaria sigue siendo un avance urgente para las enfermedades cardiovasculares¹⁰.

No hay medios técnicos disponibles para detectar la actividad fisiológica coronaria, a excepción de los sistemas de telemetría inalámbricos, que pueden registrar dinámicamente la presión coronaria in vivo , la tensión vascular, la saturación de oxígeno en sangre y los valores de pH¹¹. Por lo tanto, teniendo en cuenta el secreto textural y la complejidad de las arterias coronarias, la identificación precisa y el aislamiento de las arterias coronarias son, sin duda, las mejores opciones para explorar múltiples mecanismos de CAD in vitro⁴.

Un sistema de miógrafo múltiple en serie, en particular un detector de tensión microvascular micrográfico de alambre (ver Tabla de Materiales), es un dispositivo comercializable muy maduro para registrar cambios de tensión tisular in vitro de pequeños tubos vasculares, linfáticos y bronquiales con las características de alta precisión y registro dinámico continuo¹². Dicho sistema se ha empleado ampliamente para registrar las características de tensión tisular in vitro de las estructuras de cavidad con diámetros de 60 μm a 10 mm. Las características de calentamiento continuo de la plataforma de la micrografía de alambre compensan en gran medida la estimulación del entorno externo adverso. Mientras tanto, las entradas constantes de la mezcla de gases y los valores de pH nos permiten obtener datos de tensión vascular más precisos en un estado fisiológico similar¹³. Sin embargo, teniendo en cuenta la complejidad de la localización anatómica de las arterias coronarias de ratas (Figura 1), su aislamiento ha sido desconcertante y limita la exploración del mecanismo de la enfermedad cardiovascular diversificada y el desarrollo de fármacos. Por lo tanto, el presente protocolo introduce en detalle la ubicación anatómica y el proceso de separación de la arteria coronaria de la rata, seguido de la medición de la tensión en la plataforma de la micrografía de alambre¹⁴.

Protocolo

El protocolo animal fue revisado y aprobado por el Comité de Gestión de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Registro No. 2021-11). Se utilizaron ratas macho Sprague Dawley (SD) (260-300 g, 8-10 semanas de edad) para el presente estudio. Las ratas se mantuvieron en una cámara de animales y fueron libres de beber y comer durante el experimento.

1. Preparación de la solución

1. Preparar solución salina fisiológica (PSS) disolviendo 118 mM de NaCl, 4,7 mM de K⁺, 2,5 mM de CaCl₂, 1,2 mM de KH₂PO₄, 1,2 mM de MgCl₂∙6H₂O, 25 mM de NaHCO₃, 11 mM de D-glucosa y 5 mM de HEPES (ver Tabla de Materiales).
2. Preparar solución salina con alto contenido de K⁺ disolviendo 58 mM de NaCl, 60 mM de K⁺, 2,5 mM de CaCl₂, 1,2 mM de KH₂PO4, 1,2 mM de MgCl₂∙6H₂O, 25 mM de NaHCO₃, 11 mM de D-glucosa y 5 mM de HEPES.
3. Saturar las dos soluciones anteriores y burbujear con un gas mixto de 95% O₂ y 5% CO₂. Mientras tanto, mantenga los valores de pH de la solución entre 7.38 y 7.42 con 2 mM NaOH.
   NOTA: Para obtener información detallada sobre la preparación de la solución, consulte la referencia¹⁵.

2. Disección de la arteria coronaria de la rata

1. Anestesiar a la rata por inhalación de isoflurano al 2%. Confirme la anestesia profunda mediante pellizco en el dedo del pie y, si es necesario, administre anestésicos adicionales. Luego abra inmediatamente la cavidad torácica para exponer el corazón en la mesa de operaciones portátil siguiendo un informe publicado previamente¹².
2. Después de disociar y extraer el corazón, drene la sangre residual de todas las cámaras del corazón apretando ligeramente con fórceps de plástico médico. Coloque rápidamente el corazón preprocesado en una placa de Petri que contenga 95% de O₂ + 5% de CO₂ Saturado PSS a 4 °C, con un valor de pH de 7.40.
3. Para identificar con precisión la posición anatómica de las arterias coronarias, ajuste la postura del corazón aislado bajo el microscopio de luz de acuerdo con el diagrama esquemático (Figura 2A).
   NOTA: En la vista frontal, la aurícula derecha y la arteria pulmonar estaban en la parte superior izquierda y la parte superior derecha, respectivamente.
   1. Cortar las cavidades ventriculares izquierda y derecha a lo largo del tabique interventricular desde la raíz de la arteria pulmonar con tijeras quirúrgicas y pinzas (Figura 2B).
4. Para disociar las arterias coronarias izquierda y derecha del tejido miocárdico, diseccione el ventrículo derecho bajo un microscopio anatómico óptico para exponer completamente la rama de la arteria coronaria derecha. Luego identifique la posición de la arteria coronaria izquierda girando el tejido cardíaco 45 ° en el sentido de las agujas del reloj (Figura 2D).
5. Después de extraer el tejido miocárdico pegajoso circundante, discierna explícitamente las arterias coronarias pulsantes izquierda (aproximadamente 5 mm) y derecha (aproximadamente 5 mm). Separe las arterias coronarias en el medio inmediatamente y sumérjase completamente en PSS a 4 ° C. Adquirir un anillo arterial de unos 2 mm cortando verticalmente la arteria desprendida con tijeras anatómicas para registrar la tensión vascular bajo diferentes estímulos (Figura 2E).

3. Suspensión y fijación del anillo arterial

NOTA: Para obtener detalles sobre este paso, consulte la referencia¹⁴.

1. Preparar dos alambres de acero inoxidable de 2 cm (ver Tabla de Materiales) y remojar previamente en solución PSS de 4 °C saturada con 95% O₂ + 5% CO₂. Pase ambos cables paralelamente a través del anillo arterial junto con la dirección del vaso bajo un microscopio anatómico óptico y con cables de igual longitud expuestos en ambos extremos de la cavidad vascular.
2. Fije el anillo arterial con el alambre de acero por delante y por detrás en el baño de la micrografía de alambre llena de PSS burbujeante con 95% O₂ + 5% CO₂. Gire la perilla del tornillo horizontal para un espaciado delantero y trasero adecuado de modo que los dos cables estén horizontales y el anillo arterial esté en un estado natural de relajación.
3. Después de instalar el baño DMT en el aparato termostático, abra el software de adquisición de datos (consulte la Tabla de materiales) para asegurarse de que se registró la señal de ruta correspondiente. Establezca los siguientes parámetros: calibración del ocular (mm/div): 0.36; presión objetivo (kPa): 13,3; IC1/IC100: 0,9; tiempo promedio en línea: 2 s; tiempo de retardo: 60 s. Los pasos de la fijación del anillo arterial se muestran en la Figura 3.

4. Estandarización de la tensión vascular en anillo arterial de rata

NOTA: Para diferentes muestras de cavidades, fue necesaria una tensión inicial óptima para que los vasos mantuvieran una actividad excepcional in vitro. Para más detalles, véase la referencia¹⁵.

1. Lograr la tensión inicial óptima del anillo arterial aplicando una tensión razonable a lo largo del diámetro del vaso.
   NOTA: Sobre la base del estudio anterior¹⁶, la tensión máxima inducida por agonistas se logró en el valor del factor k de 0,90 con la tensión de estiramiento inicial de 1,16 ± 0,04 mN/mm (valores de referencia para diferentes muestras de vasos: valor k, 0,90-0,95; tensión inicial, 1,16-1,52 mN/mm).
2. En este punto, establezca el valor de tensión vascular mostrado en cero. Después, aplique un estímulo de tracción de 3 mN al anillo arterial girando el eje espiral del baño.
3. Después de la incubación durante 1 h en tampón PSS saturado de oxígeno a 37 °C, pH 7.40, ajuste el valor de tensión a 0 mN nuevamente en el panel de control de tensión de la micrografía de alambre. El proceso de fraguado de la tensión inicial del anillo arterial se muestra en la Figura 4.

5. Detección de reactividad del anillo de la arteria coronaria

1. Realizar la actividad contráctil del anillo de la arteria coronaria con la técnica de miógrafo de alambre¹⁴, y validar en tres operaciones separadas estimulando con 60 mM de solución K⁺ durante 10 min cada una.
2. Después de cada estimulación, enjuague el baño con PSS saturado de oxígeno hasta que el tono vascular vuelva a su estado inicial.
   NOTA: Solo cuando la fluctuación de tensión de las tres mediciones paralelas fue inferior al 10%, y la amplitud de cada contracción fue mayor de 1 mN / mm, se pudieron utilizar anillos arteriales calificados y altamente activos para experimentos adicionales. La verificación de la actividad del anillo coronario de la rata se muestra en la Figura 5.

6. Tratamiento postquirúrgico

1. Después de la cirugía, sacrificar a los animales siguiendo protocolos aprobados institucionalmente.
   NOTA: Para el presente estudio, los animales fueron sacrificados mediante la inhalación de exceso de isoflurano.

Resultados

Las arterias coronarias de ratas distribuidas y ocultas anatómicamente en el tejido miocárdico no se reconocían fácilmente. Al comparar las arterias coronarias de humanos (Figura 1A) y ratas (Figura 1B), se realizó una separación rápida y precisa de las arterias coronarias de ratas de acuerdo con el proceso de muestreo en la Figura 2. Después de localizar con precisión la aurícula derecha, la arteria pulmonar y el ápice d...

Discusión

La alteración de la microcirculación coronaria, que involucra a una amplia gama de pacientes con EAC, se ha reconocido gradualmente y se ha preocupado por la base para una adecuada perfusión de miocardio. Teniendo en cuenta las complicaciones graves de la enfermedad coronaria repentina y la enfermedad cardiovascular, la prevención y el tratamiento oportunos de los medicamentos son extremadamente importantes para un individuo clínico con CAD¹⁷. Inevitablemente, el secreto de la anatomía de la...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apigenin	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	150731
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A501330
D-glucose	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610219
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100781
LabChart Professional version 8.3	ADInstruments, Australia	—
MgCl2·6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100288
Multi myograph system	Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark	620M
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100241
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100865
Steel wires	Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark	400447
U46619	Sigma, USA	D8174