Стандартизированная подготовка коронарного кольца крысы и запись в режиме реального времени динамических изменений напряжения вдоль диаметра сосуда

Резюме

В настоящем протоколе описана техника проводного миографа для измерения сосудистой реактивности коронарной артерии крысы.

Аннотация

Как ключевое событие заболеваний сердечно-сосудистой системы, ишемическая болезнь сердца (ИБС) широко рассматривается как главный виновник атеросклероза, инфаркта миокарда и стенокардии, которые серьезно угрожают жизни и здоровью людей во всем мире. Однако то, как записать динамические биомеханические характеристики изолированных кровеносных сосудов, давно озадачило людей. Между тем, точное позиционирование и изоляция коронарных артерий для измерения динамических изменений сосудистого напряжения in vitro стали тенденцией в разработке лекарств ИБС. Настоящий протокол описывает макроскопическую идентификацию и микроскопическое разделение коронарных артерий крыс. Функцию сокращения и расширения коронарного кольца вдоль диаметра сосуда контролировали с помощью установленной мультимиографической системы. Стандартизированные и запрограммированные протоколы измерения напряжения коронарных колец, от отбора проб до сбора данных, значительно улучшают повторяемость экспериментальных данных, что обеспечивает подлинность записей сосудистого напряжения после физиологического, патологического и медикаментозного вмешательства.

Введение

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) широко признана и обеспокоена как типичное и репрезентативное сердечно-сосудистое заболевание, являющееся основной причиной смерти как в развитых, так и в развивающихся странах ^1,2. В качестве пути снабжения кровью и кислородом для нормальной физиологической функции сердца циркулирующая кровь поступает и питает сердце через две основные коронарные артерии и кровеносную сосудистую сеть на поверхности миокарда ^3,4. Холестериновые и жировые отложения в коронарных артериях перекрывают кровоснабжение сердца и бурную воспалительную реакцию сосудистой системы, вызывая атеросклероз, стабильную стенокардию, нестабильную стенокардию, инфаркт миокарда или внезапную сердечную смерть ^5,6. В ответ на патологический стеноз коронарных артерий компенсаторно ускоренное физиологическое сердцебиение удовлетворяет кровоснабжение самого сердца или жизненно важных органов организма за счет увеличения выхода левого желудочка⁷. Если длительный коронарный стеноз вовремя не устранить, в определенных областях сердца могут развиться обширные новые кровеносные сосуды⁸. В настоящее время клиническое лечение ИБС часто принимает медикаментозный тромболизис или хирургический механический тромболизис и экзогенное бионическое сосудистое шунтирование с частыми лекарствами и большой хирургической инвалидностью⁹. Поэтому функциональное исследование физиологической активности коронарных артерий по-прежнему является актуальным прорывом при сердечно-сосудистых заболеваниях¹⁰.

Отсутствуют доступные технические средства для определения коронарной физиологической активности, за исключением беспроводных телеметрических систем, которые могут динамически регистрировать in vivo коронарное давление, сосудистое напряжение, насыщение крови кислородом и значения рН¹¹. Поэтому, учитывая текстурную тайну и сложность коронарных артерий, точная идентификация и изоляция коронарных артерий, несомненно, являются лучшим выбором для изучения нескольких механизмов ИБС in vitro⁴.

Серия мультимиографных систем, в частности проводной микрофотоскулярный детектор микрососудистого напряжения (см. Таблицу материалов), является очень зрелым рыночным устройством для регистрации изменений напряжения тканей in vitro малых сосудистых, лимфатических и бронхиальных трубок с характеристиками высокоточной и непрерывной динамической записи¹². Указанная система широко используется для регистрации характеристик натяжения тканей in vitro полостных структур диаметром от 60 мкм до 10 мм. Непрерывный нагрев особенностей платформы проволочной микрофотографии в значительной степени компенсирует стимуляцию неблагоприятной внешней среды. Между тем, постоянные входы газовой смеси и значения рН позволяют получить более точные данные о сосудистом напряжении в аналогичном физиологическом состоянии¹³. Однако, учитывая сложность анатомической локализации коронарных артерий крыс (рисунок 1), ее изоляция вызывает недоумение и ограничивает исследование механизма диверсифицированных сердечно-сосудистых заболеваний и разработку лекарств. Поэтому настоящий протокол подробно вводит анатомическое расположение и процесс разделения коронарной артерии крысы с последующим измерением напряжения на платформе проволочной микрофотографии¹⁴.

протокол

Протокол для животных был рассмотрен и одобрен Управляющим комитетом из Университета традиционной китайской медицины Чэнду (запись No 2021-11). Для настоящего исследования использовались самцы крыс Sprague Dawley (SD) (260-300 г, 8-10 недель). Крыс держали в камере для животных и могли свободно пить и есть во время эксперимента.

1. Приготовление раствора

1. Готовят физиологический солевой раствор (PSS), растворяя 118 мМ NaCl, 4,7 мМ K⁺, 2,5 мМ CaCl₂, 1,2 мМ KH₂PO₄, 1,2 мМ MgCl₂∙6H₂O, 25 мМ NaHCO₃, 11 мМ D-глюкозы и 5 мМ HEPES (см. Таблицу материалов).
2. Готовят раствор соли с высоким содержанием K⁺ , растворяя 58 мМ NaCl, 60 мМ K⁺, 2,5 мМ CaCl₂, 1,2 мМ KH₂PO4, 1,2 мМ MgCl₂∙6H₂O, 25 мМ NaHCO₃, 11 мМ D-глюкозы и 5 мМ HEPES.
3. Насытить два вышеуказанных раствора и пузырьком со смешанным газом 95%_O2 и 5% CO₂. Между тем, поддерживайте значения рН раствора между 7,38 и 7,42 с 2 мМ NaOH.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о приготовлении раствора, пожалуйста, смотрите ссылку¹⁵.

2. Рассечение коронарной артерии крысы

1. Обезболивают крысу путем вдыхания 2% изофлурана. Подтвердите глубокую анестезию щипкой пальцев ног и, при необходимости, введите дополнительные анестетики. Затем немедленно откройте грудную полость, чтобы обнажить сердце на переносном операционном столе после ранее опубликованного отчета¹².
2. После диссоциации и удаления сердца дренируют остаточную кровь из всех камер сердца, слегка сдавливая медицинскими пластическими щипцами. Быстро поместите предварительно обработанное сердце в чашку Петри, содержащую 95% O₂ + 5% CO₂ насыщенного PSS при 4 °C, имея значение рН 7,40.
3. Чтобы точно определить анатомическое положение коронарных артерий, скорректируйте положение изолированного сердца под световым микроскопом по принципиальной схеме (рисунок 2А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: На фронтальном снимке правая ушная раковина и легочная артерия находились в верхнем левом и правом верхнем углу соответственно.
   1. Срежьте левую и правую желудочковую полости вдоль межжелудочковой перегородки от корня легочной артерии хирургическими ножницами и пинцетом (рисунок 2В).
4. Чтобы отделить левую и правую коронарные артерии от ткани миокарда, рассекните правый желудочек под оптическим анатомическим микроскопом, чтобы тщательно обнажить правую ветвь коронарной артерии. Затем определите положение левой коронарной артерии, повернув сердечную ткань на 45° по часовой стрелке (рисунок 2D).
5. После удаления окружающей липкой ткани миокарда явно различают пульсирующие левую (около 5 мм) и правую (около 5 мм) коронарные артерии. Немедленно отделите коронарные артерии посередине и полностью погрузите в ПСС при 4 °C. Приобретите артериальное кольцо размером около 2 мм, вертикально разрезав отделившуюся артерию анатомическими ножницами для регистрации сосудистого напряжения при различных раздражителях (рисунок 2Е).

3. Суспензия и фиксация артериального кольца

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную информацию об этом шаге см. в ссылке¹⁴.

1. Подготовьте две проволоки из нержавеющей стали по 2 см (см. Таблицу материалов) и предварительно замочите в растворе PSS при температуре 4 °C, насыщенном 95% O₂ + 5% CO₂. Пропустите оба провода параллельно через артериальное кольцо вместе с направлением сосуда под оптическим анатомическим микроскопом и с проводами одинаковой длины, выставленными на обоих концах сосудистой полости.
2. Зафиксируйте артериальное кольцо стальной проволокой спереди и сзади в ванне из проволоки на микрофотографии, заполненной пузырящейся ПСС с 95% O₂ + 5% CO₂. Поверните горизонтальную винтовую ручку для соответствующего переднего и заднего расстояния так, чтобы два провода были горизонтальными, а артериальное кольцо находилось в естественном состоянии расслабления.
3. После установки ванны DMT на термостатический аппарат откройте программное обеспечение для сбора данных (см. Таблицу материалов), чтобы убедиться, что был записан соответствующий сигнал пути. Установите следующие параметры: калибровка окуляра (мм/дел): 0,36; целевое давление (кПа): 13,3; IC1/IC100: 0,9; время онлайн-усреднения: 2 с; время задержки: 60 с. Этапы фиксации артериального кольца показаны на рисунке 3.

4. Стандартизация сосудистого напряжения в артериальном кольце крыс

ПРИМЕЧАНИЕ: Для различных образцов полостей для поддержания исключительной активности in vitro сосудам требовалось оптимальное начальное натяжение. Более подробную информацию см. в ссылке¹⁵.

1. Достигните оптимального начального натяжения артериального кольца, применяя разумное напряжение по диаметру сосуда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На основе предыдущего исследования¹⁶ максимальное напряжение, вызванное агонистами, было достигнуто при значении коэффициента k 0,90 при начальном растяжении 1,16 ± 0,04 мН/мм (контрольные значения для различных образцов сосудов: значение k, 0,90-0,95; начальное напряжение, 1,16-1,52 мН/мм).
2. В этот момент установите отображаемое значение сосудистого напряжения равным нулю. После этого нанесите стимул 3 мН на артериальное кольцо, вращая спиральную ось ванны.
3. После инкубации в течение 1 ч в насыщенном кислородом PSS буфере при 37 °C, рН 7,40, снова установите значение натяжения 0 мН на панели управления натяжением проволочной микрофотографии. Процесс установки начального натяжения артериального кольца показан на рисунке 4.

5. Определение реактивности коронарного кольца

1. Выполняют сократительную активность коронарного кольца с помощью проводного миографа по методике^{14 и проверяют} в трех отдельных операциях, стимулируя 60 мМ раствора К⁺ в течение 10 мин каждая.
2. После каждой стимуляции промывайте ванну насыщенным кислородом ПСС до тех пор, пока тонус сосудов не вернется в исходное состояние.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Только когда флуктуация напряжения трех параллельных измерений составляла менее 10%, а амплитуда каждого сокращения превышала 1 мН/мм, для дальнейших экспериментов можно было использовать квалифицированные и высокоактивные артериальные кольца. Проверка активности коронарного кольца крысы показана на рисунке 5.

6. Послеоперационное лечение

1. После операции усыплите животных в соответствии с институционально утвержденными протоколами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования животные были усыплены путем вдыхания избытка изофлурана.

Результаты

Анатомически расположенные коронарные артерии крыс, распределенные и скрытые глубоко в ткани миокарда, были нелегко распознаны. Путем сравнения коронарных артерий человека (Рисунок 1А) и крыс (Рисунок 1В) было проведено быстрое и точное разделение корон?...

Обсуждение

Нарушение коронарной микроциркуляции, в котором участвует широкий круг пациентов с ИБС, было постепенно признано и касалось основы адекватной перфузии миокарда. Учитывая серьезные осложнения внезапной ишемической болезни сердца и сердечно-сосудистых заболеваний, своевременная меди...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apigenin	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	150731
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A501330
D-glucose	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610219
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100781
LabChart Professional version 8.3	ADInstruments, Australia	—
MgCl2·6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100288
Multi myograph system	Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark	620M
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100241
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100865
Steel wires	Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark	400447
U46619	Sigma, USA	D8174