Preparazione standardizzata dell'anello coronarico di ratto e registrazione in tempo reale delle variazioni di tensione dinamica lungo il diametro del vaso

Riepilogo

Il presente protocollo descrive la tecnica del miografo a filo per misurare la reattività vascolare dell'arteria coronaria del ratto.

Abstract

Come evento chiave delle malattie del sistema cardiovascolare, la malattia coronarica (CAD) è stata ampiamente considerata come il principale colpevole di aterosclerosi, infarto miocardico e angina pectoris, che minacciano seriamente la vita e la salute delle persone in tutto il mondo. Tuttavia, come registrare le caratteristiche biomeccaniche dinamiche dei vasi sanguigni isolati ha a lungo sconcertato le persone. Nel frattempo, il posizionamento preciso e l'isolamento delle arterie coronarie per misurare i cambiamenti di tensione vascolare dinamica in vitro sono diventati una tendenza nello sviluppo di farmaci CAD. Il presente protocollo descrive l'identificazione macroscopica e la separazione microscopica delle arterie coronarie di ratto. La funzione di contrazione e dilatazione dell'anello coronarico lungo il diametro del vaso è stata monitorata utilizzando il sistema multi miografo stabilito. I protocolli standardizzati e programmati di misurazione della tensione dell'anello coronarico, dal campionamento all'acquisizione dei dati, migliorano enormemente la ripetibilità dei dati sperimentali, garantendo l'autenticità dei record di tensione vascolare dopo interventi fisiologici, patologici e farmacologici.

Introduzione

La malattia coronarica (CAD) è stata ampiamente riconosciuta e preoccupata come una malattia cardiovascolare tipica e rappresentativa, essendo la principale causa di morte sia nei paesi sviluppati che in quelli in via di sviluppo ^1,2. Come via di afflusso di sangue e ossigeno per la normale funzione fisiologica cardiaca, il sangue circolante entra e nutre il cuore attraverso due arterie coronarie principali e una rete vascolare del sangue sulla superficie del miocardio ^3,4. I depositi di colesterolo e grasso nelle arterie coronarie interrompono l'afflusso di sangue del cuore e la violenta risposta infiammatoria del sistema vascolare, causando aterosclerosi, angina stabile, angina instabile, infarto miocardico o morte cardiaca improvvisa ^5,6. In risposta alla stenosi patologica delle arterie coronarie, il battito cardiaco fisiologico accelerato compensatorio soddisfa l'afflusso di sangue del cuore stesso o degli organi vitali del corpo aumentando la produzione del ventricolo sinistro⁷. Se la stenosi coronarica prolungata non viene alleviata in tempo, in alcune aree del cuore^possono svilupparsi nuovi vasi sanguigni estesi. Allo stato attuale, il trattamento clinico della CAD adotta spesso trombolisi farmacologica o trombolisi meccanica chirurgica e un bypass vascolare bionico esogeno con farmaci frequenti e grande disabilità chirurgica⁹. Pertanto, l'indagine funzionale dell'attività fisiologica dell'arteria coronaria è ancora una svolta urgente per le malattie cardiovascolari¹⁰.

Non ci sono mezzi tecnici disponibili per rilevare l'attività fisiologica coronarica, ad eccezione dei sistemi di telemetria wireless, che possono registrare dinamicamente la pressione coronarica in vivo , la tensione vascolare, la saturazione di ossigeno nel sangue e i valori di pH¹¹. Pertanto, considerando la segretezza e la complessità delle arterie coronarie, l'identificazione accurata e l'isolamento delle arterie coronarie sono senza dubbio le scelte migliori per esplorare molteplici meccanismi di CAD in vitro⁴.

Un sistema multimilografo di serie, in particolare un rilevatore di tensione microvascolare a micrografia a filo (vedi Tabella dei materiali), è un dispositivo commerciabile molto maturo per la registrazione in vitro di cambiamenti di tensione tissutale di piccoli tubi vascolari, linfatici e bronchiali con le caratteristiche di alta precisione e registrazione dinamica continua¹². Il suddetto sistema è stato ampiamente utilizzato per registrare in vitro le caratteristiche di tensione tissutale di strutture di cavità con diametri da 60 μm a 10 mm. Le caratteristiche di riscaldamento continuo della piattaforma della micrografia a filo compensano in gran parte la stimolazione dell'ambiente esterno avverso. Nel frattempo, gli input costanti della miscela di gas e i valori di pH ci consentono di ottenere dati più accurati sulla tensione vascolare in uno stato fisiologico simile¹³. Tuttavia, considerando la complessità della localizzazione anatomica delle arterie coronarie di ratto (Figura 1), il suo isolamento ha lasciato perplessi e limitato l'esplorazione del meccanismo di malattie cardiovascolari diversificate e lo sviluppo di farmaci. Pertanto, il presente protocollo introduce in dettaglio la posizione anatomica e il processo di separazione dell'arteria coronaria del ratto, seguito dalla misurazione della tensione sulla piattaforma della micrografia^{a filo 14}.

Protocollo

Il protocollo animale è stato rivisto e approvato dal Comitato di gestione dell'Università di medicina tradizionale cinese di Chengdu (record n. 2021-11). Per il presente studio sono stati utilizzati ratti maschi di Sprague Dawley (SD) (260-300 g, 8-10 settimane di età). I ratti erano tenuti in una camera per animali ed erano liberi di bere e mangiare durante l'esperimento.

1. Preparazione della soluzione

1. Preparare la soluzione salina fisiologica (PSS) sciogliendo 118 mM di NaCl, 4,7 mM di K⁺, 2,5 mM di CaCl₂, 1,2 mM di KH₂PO₄, 1,2 mM di MgCl₂∙6H₂O, 25 mM di NaHCO₃, 11 mM di D-glucosio e 5 mM di HEPES (vedi Tabella dei materiali).
2. Preparare una soluzione salina ad alto K⁺ sciogliendo 58 mM di NaCl, 60 mM di K⁺, 2,5 mM di CaCl₂, 1,2 mM di KH₂PO4, 1,2 mM di MgCl₂∙6H₂O, 25 mM di NaHCO₃, 11 mM di D-glucosio e 5 mM di HEPES.
3. Saturare le due soluzioni di cui sopra e bollare con un gas misto di 95% O₂ e 5% CO₂. Nel frattempo, mantenere i valori di pH della soluzione tra 7,38 e 7,42 con 2 mM NaOH.
   NOTA: per informazioni dettagliate sulla preparazione della soluzione, vedere il riferimento¹⁵.

2. Dissezione dell'arteria coronaria del ratto

1. Anestetizzare il ratto per inalazione di isoflurano al 2%. Confermare l'anestesia profonda con un pizzico di punta e, se necessario, somministrare anestetici aggiuntivi. Quindi aprire immediatamente la cavità toracica per esporre il cuore sul tavolo operatorio portatile a seguito di un rapporto^{precedentemente pubblicato 12}.
2. Dopo aver dissociato e rimosso il cuore, drenare il sangue residuo da tutte le camere cardiache spremendo leggermente con una pinza di plastica medica. Posizionare rapidamente il cuore pre-elaborato in una capsula di Petri contenente 95% O₂ + 5% DI PSS saturo di CO₂ a 4 °C, con un valore di pH di 7,40.
3. Per identificare con precisione la posizione anatomica delle arterie coronarie, regolare la postura del cuore isolato al microscopio ottico secondo il diagramma schematico (Figura 2A).
   NOTA: Nella vista frontale, il padiglione auricolare destro e l'arteria polmonare erano rispettivamente in alto a sinistra e in alto a destra.
   1. Tagliare le cavità ventricolari sinistra e destra lungo il setto interventricolare dalla radice dell'arteria polmonare con forbici chirurgiche e pinzette (Figura 2B).
4. Per dissociare le arterie coronarie sinistra e destra dal tessuto miocardico, sezionare il ventricolo destro sotto un microscopio anatomico ottico per esporre a fondo il ramo dell'arteria coronaria destra. Quindi identificare la posizione dell'arteria coronaria sinistra ruotando il tessuto cardiaco di 45 ° in senso orario (Figura 2D).
5. Dopo aver rimosso il tessuto miocardico appiccicoso circostante, discernere esplicitamente le arterie coronarie sinistra (circa 5 mm) e destra (circa 5 mm) pulsanti. Separare immediatamente le arterie coronarie nel mezzo e immergere completamente nella PSS a 4 °C. Acquisire un anello arterioso di circa 2 mm tagliando verticalmente l'arteria staccata con forbici anatomiche per registrare la tensione vascolare sotto diversi stimoli (Figura 2E).

3. Sospensione e fissazione dell'anello arterioso

NOTA: per i dettagli su questo passaggio, vedere il riferimento¹⁴.

1. Preparare due fili di acciaio inossidabile da 2 cm (vedi Tabella dei materiali) e pre-immergere in soluzione PSS a 4 °C satura di 95% O₂ + 5% DI CO₂. Passare entrambi i fili parallelamente attraverso l'anello arterioso insieme alla direzione del vaso sotto un microscopio anatomico ottico e con fili di uguale lunghezza esposti ad entrambe le estremità della cavità vascolare.
2. Fissare l'anello arterioso con il filo d'acciaio davanti e dietro nella vasca da bagno della micrografia a filo riempita con PSS gorgogliante con 95% O₂ + 5% CO₂. Ruotare la manopola a vite orizzontale per una spaziatura anteriore e posteriore appropriata in modo che i due fili siano orizzontali e l'anello arterioso sia in uno stato naturale di rilassamento.
3. Dopo aver installato il bagno DMT sull'apparato termostatico, aprire il software di acquisizione dati (vedere Tabella dei materiali) per assicurarsi che il segnale del percorso corrispondente sia stato registrato. Impostare i seguenti parametri: calibrazione oculare (mm/div): 0,36; pressione target (kPa): 13.3; IC1/IC100: 0,9; tempo medio online: 2 s; tempo di ritardo: 60 s. Le fasi di fissazione dell'anello arterioso sono mostrate nella Figura 3.

4. Standardizzazione della tensione vascolare nell'anello arterioso del ratto

NOTA: Per diversi campioni di cavità, era necessaria una tensione iniziale ottimale per i vasi per mantenere un'attività eccezionale in vitro. Per i dettagli, si veda il riferimento¹⁵.

1. Ottenere la tensione iniziale ottimale dell'anello arterioso applicando una tensione ragionevole lungo il diametro del vaso.
   NOTA: Sulla base del precedente studio¹⁶, la tensione massima indotta da agonisti è stata raggiunta al valore del fattore k di 0,90 con la tensione iniziale di allungamento di 1,16 ± 0,04 mN/mm (valori di riferimento per diversi campioni di vasi: valore k, 0,90-0,95; tensione iniziale, 1,16-1,52 mN/mm).
2. A questo punto, impostare il valore di tensione vascolare visualizzato su zero. Successivamente, applicare uno stimolo di trazione di 3 mN all'anello arterioso ruotando l'asse a spirale del bagno.
3. Dopo l'incubazione per 1 ora in tampone PSS saturo di ossigeno a 37 °C, pH 7,40, impostare nuovamente il valore di tensione su 0 mN sul pannello di controllo della tensione della micrografia a filo. Il processo di impostazione della tensione iniziale dell'anello arterioso è mostrato nella Figura 4.

5. Rilevamento della reattività dell'anello coronarico

1. Eseguire l'attività contrattile dell'anello coronarico con la tecnica del miografo a filo¹⁴ e convalidare in tre operazioni separate stimolando con 60 mM di soluzione K ⁺ per 10 minuti ciascuna.
2. Dopo ogni stimolazione, lavare il bagno con PSS saturo di ossigeno fino a quando il tono vascolare ritorna al suo stato iniziale.
   NOTA: Solo quando la fluttuazione di tensione delle tre misurazioni parallele era inferiore al 10% e l'ampiezza di ciascuna contrazione era superiore a 1 mN/mm, anelli arteriosi qualificati e altamente attivi potevano essere utilizzati per ulteriori esperimenti. La verifica dell'attività dell'anello coronarico del ratto è mostrata nella Figura 5.

6. Trattamento post-chirurgico

1. Dopo l'intervento chirurgico, eutanasizzare gli animali seguendo protocolli approvati istituzionalmente.
   NOTA: Per il presente studio, gli animali sono stati sottoposti a eutanasia inalando isoflurano in eccesso.

Risultati

Le arterie coronarie di ratto anatomicamente posizionate e nascoste in profondità nel tessuto miocardico non sono state facilmente riconosciute. Confrontando le arterie coronarie degli esseri umani (Figura 1A) e dei ratti (Figura 1B), è stata condotta una separazione rapida e accurata delle arterie coronarie di ratto secondo il processo di campionamento in Figura 2. Dopo aver localizzato con precisione il padiglione auricolare des...

Discussione

Il disturbo della microcircolazione coronarica, che coinvolge una vasta gamma di pazienti con CAD, è stato gradualmente riconosciuto e ha riguardato le basi per un'adeguata perfusione del miocardio. Considerando le gravi complicanze della malattia coronarica improvvisa e delle malattie cardiovascolari, la prevenzione e il trattamento tempestivi dei farmaci sono estremamente importanti per un individuo clinico con CAD¹⁷. Inevitabilmente, la segretezza dell'anatomia coronarica e la complessità del...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apigenin	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	150731
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A501330
D-glucose	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610219
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100781
LabChart Professional version 8.3	ADInstruments, Australia	—
MgCl2·6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100288
Multi myograph system	Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark	620M
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100241
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100865
Steel wires	Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark	400447
U46619	Sigma, USA	D8174