הכנת טבעת כלילית סטנדרטית של חולדה והקלטה בזמן אמת של שינויי מתח דינמיים לאורך קוטר כלי השיט

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את טכניקת המיוגרפיה של החוטים למדידת תגובתיות כלי הדם של העורק הכלילי של החולדה.

Abstract

כאירוע מפתח של מחלות מערכת הלב וכלי הדם, מחלת עורקים כליליים (CAD) נחשבה באופן נרחב כאשם העיקרי של טרשת עורקים, אוטם שריר הלב ותעוקת חזה פקטוריס, אשר מאיימים ברצינות על חייהם ובריאותם של אנשים בכל רחבי העולם. עם זאת, כיצד לרשום את המאפיינים הביומכניים הדינמיים של כלי דם מבודדים תמה מזמן אנשים. בינתיים, מיקום מדויק ובידוד של עורקים כליליים למדידת שינויים במתח הדינמי של כלי הדם במבחנה הפכו למגמה בפיתוח תרופות CAD. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הזיהוי המקרוסקופי ואת ההפרדה המיקרוסקופית של העורקים הכליליים של החולדה. פונקציית ההתכווצות וההתרחבות של טבעת העורקים הכליליים לאורך קוטר כלי השיט נוטרו באמצעות מערכת המולטי-מיוגרפיה שהוקמה. הפרוטוקולים הסטנדרטיים והמתוכנתים של מדידת מתח טבעת כלילית, מדגימה ועד לאיסוף נתונים, משפרים מאוד את יכולת החזרה של הנתונים הניסיוניים, מה שמבטיח את האותנטיות של רשומות מתח כלי הדם לאחר התערבות פיזיולוגית, פתולוגית וסמים.

Introduction

מחלת עורקים כליליים (CAD) זכתה להכרה נרחבת ומודאגת כמחלת לב וכלי דם טיפוסית ומייצגת, בהיותה סיבת המוות המובילה במדינות מפותחות ומתפתחות ^1,2. כנתיב אספקת דם וחמצן לתפקוד פיזיולוגי תקין של הלב, הדם המסתובב נכנס ומזין את הלב דרך שני עורקים כליליים עיקריים ורשת כלי דם על פני שריר הלב ^3,4. משקעי כולסטרול ושומן בעורקים הכליליים מנתקים את אספקת הדם של הלב ואת התגובה הדלקתית האלימה של מערכת כלי הדם, וגורמים לטרשת עורקים, תעוקת חזה יציבה, תעוקת חזה יציבה, אוטם שריר הלב או מוות לבבי פתאומי ^5,6. בתגובה להיצרות פתולוגית של העורקים הכליליים, פעימות לב פיזיולוגיות מואצות מפצות מספקות את אספקת הדם של הלב עצמו או איברים חיוניים של הגוף על ידי הגדלת התפוקה של החדר השמאלי⁷. אם היצרות כלילית ממושכת אינה הקלה בזמן, כלי דם חדשים נרחבים עשויים להתפתח באזורים מסוימים של הלב⁸. כיום, הטיפול הקליני ב- CAD מאמץ לעתים קרובות תרומבוליזה תרופתית או תרומבוליזה מכנית כירורגית ומעקף כלי דם ביוניים אקסוגניים עם תרופות תכופות ונכות כירורגית גדולה⁹. לכן, החקירה התפקודית של פעילות פיזיולוגית של עורקים כליליים היא עדיין פריצת דרך דחופה למחלות לב וכלי דם¹⁰.

אין אמצעים טכניים זמינים לזיהוי פעילות פיזיולוגית כלילית, למעט מערכות טלמטריה אלחוטיות, שיכולות לרשום באופן דינמי לחץ כלילי in vivo , מתח כלי דם, ריווי חמצן בדם וערכי pH¹¹. לכן, בהתחשב בסודיות ובמורכבות הטקסטורלית של העורקים הכליליים, זיהוי ובידוד מדויקים של עורקים כליליים הם ללא ספק הבחירות הטובות ביותר לחקר מנגנונים מרובים של CAD במבחנה⁴.

מערכת מולטי-מיוגרפיה סדרתית, במיוחד גלאי מתח מיקרו-וסקולרי של מיקרוגרף תיל (ראו טבלת חומרים), היא מכשיר סחיר בוגר מאוד לתיעוד שינויי מתח ברקמות במבחנה של צינורות קטנים של כלי דם, לימפה וסימפונות עם מאפיינים של דיוק גבוה ורישום דינמי רציף¹². המערכת האמורה שימשה באופן נרחב לתיעוד מאפייני מתח רקמות במבחנה של מבני חלל בקטרים של 60 מיקרומטר עד 10 מ"מ. תכונות החימום הרציף של הפלטפורמה של מיקרוגרף החוטים מקזזות במידה רבה את הגירוי של הסביבה החיצונית השלילית. בינתיים, הקלטים הקבועים של תערובת הגזים וערכי ה- pH מאפשרים לנו לקבל נתוני מתח וסקולריים מדויקים יותר במצב פיזיולוגי דומה¹³. עם זאת, בהתחשב במורכבות של לוקליזציה אנטומית של עורקים כליליים של חולדות (איור 1), הבידוד שלו היה מבלבל והגביל את חקר המנגנון של מחלות לב וכלי דם מגוונות ופיתוח תרופות. לכן, הפרוטוקול הנוכחי מציג את המיקום האנטומי ואת תהליך ההפרדה של העורק הכלילי של החולדה בפירוט, ואחריו מדידת מתח על הפלטפורמה של מיקרוגרף החוט¹⁴.

Protocol

פרוטוקול בעלי החיים נבדק ואושר על ידי ועדת הניהול מאוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (רשומה מס ' 2021-11). חולדות ספראג דאולי (SD) זכרות (260-300 גרם, בנות 8-10 שבועות) שימשו למחקר הנוכחי. החולדות הוחזקו בתא בעלי חיים והיו חופשיות לשתות ולאכול במהלך הניסוי.

1. הכנת פתרון

1. הכן תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS) על ידי המסת 118 mM של NaCl, 4.7 mM של K⁺, 2.5 mM של CaCl₂, 1.2 mM של KH₂PO₄, 1.2 mM של MgCl₂∙6H₂O, 25 mM של NaHCO₃, 11 mM של D-גלוקוז ו-5 mM של HEPES (ראה טבלת חומרים).
2. הכן תמיסת מלח K⁺ גבוהה על ידי המסת 58 mM של NaCl, 60 mM של K⁺, 2.5 mM של CaCl₂, 1.2 mM של KH₂PO4, 1.2 mM של MgCl₂∙6H₂O, 25 mM של NaHCO₃, 11 mM של D-גלוקוז, ו-5 mM של HEPES.
3. להרוות את שני הפתרונות הנ"ל ואת הבועה עם גז מעורב של 95% O₂ ו 5% CO₂. בינתיים, שמור על ערכי ה- pH של הפתרון בין 7.38 ל- 7.42 עם 2 mM NaOH.
   הערה: לקבלת מידע מפורט על הכנת פתרון, ראה הפניה¹⁵.

2. כריתת עורק כלילי של חולדה

1. להרדים את החולדה על ידי שאיפה של 2% איזופלורן. אשרו הרדמה עמוקה על ידי צביטה בבוהן, ובמידת הצורך, בצעו הרדמה נוספת. לאחר מכן פתח מיד את חלל בית החזה כדי לחשוף את הלב על שולחן הניתוחים הנייד בעקבות דו"ח¹² שפורסם בעבר.
2. לאחר ניתוק והסרת הלב, לנקז את שאריות הדם מכל חדרי הלב על ידי לחיצה קלה עם מלקחיים מפלסטיק רפואי. הניחו במהירות את הלב המעובד מראש בצלחת פטרי המכילה 95% O₂ + 5% CO₂ רווי PSS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, עם ערך pH של 7.40.
3. כדי לזהות במדויק את המיקום האנטומי של העורקים הכליליים, התאימו את תנוחת הלב המבודד מתחת למיקרוסקופ האור בהתאם לדיאגרמה הסכמטית (איור 2A).
   הערה: במבט חזיתי, העורק הימני והעורק הריאתי היו בצד שמאל למעלה ובימין העליון, בהתאמה.
   1. חתכו את חללי החדר השמאלי והימני לאורך המחיצה הבין-חדרית משורש העורק הריאתי באמצעות מספריים כירורגיים ופינצטה (איור 2B).
4. כדי לנתק את העורקים הכליליים השמאליים והימניים מרקמת שריר הלב, יש לנתח את החדר הימני תחת מיקרוסקופ אנטומי אופטי כדי לחשוף ביסודיות את ענף העורק הכלילי הימני. לאחר מכן זהה את מיקום העורק הכלילי השמאלי על-ידי סיבוב רקמת הלב 45° בכיוון השעון (איור 2D).
5. לאחר הסרת רקמת שריר הלב הדביקה שמסביב, יש להבחין במפורש בעורקים הכליליים השמאליים הפועמים (כ-5 מ"מ) והימניים (כ-5 מ"מ). הפרד את העורקים הכליליים באמצע באופן מיידי ולטבול לחלוטין ב- PSS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. רכשו טבעת עורקית של כ-2 מ"מ על ידי חיתוך אנכי של העורק המנותק עם מספריים אנטומיים כדי לתעד את מתח כלי הדם תחת גירויים שונים (איור 2E).

3. השעיה וקיבוע טבעת עורקית

הערה: לפרטים על שלב זה, ראה הפניה¹⁴.

1. הכינו שני חוטי נירוסטה בקוטר 2 ס"מ (ראו טבלת חומרים) והשרו מראש תמיסת PSS של 4 °C רוויה ב-95% O₂ + 5% CO₂. מעבירים את שני החוטים במקביל דרך הטבעת העורקית יחד עם כיוון הכלי תחת מיקרוסקופ אנטומי אופטי ועם חוטים באורך שווה החשופים בשני קצות חלל כלי הדם.
2. תקן את טבעת העורקים עם חוט הפלדה מלפנים ומאחור באמבטיה של מיקרוגרף החוטים המלא ב- PSS מבעבע עם 95% O₂ + 5% CO₂. סובב את ידית הבורג האופקית לקבלת מרווח קדמי ואחורי מתאים כך ששני החוטים יהיו אופקיים וטבעת העורקים תהיה במצב טבעי של רגיעה.
3. לאחר התקנת אמבט ה-DMT במנגנון התרמוסטטי, פתחו את תוכנת איסוף הנתונים (ראו טבלת חומרים) כדי לוודא שאות הנתיב המתאים נרשם. הגדר את הפרמטרים הבאים: כיול עינית (mm/div): 0.36; לחץ מטרה (kPa): 13.3; IC1/IC100: 0.9; זמן ממוצע מקוון: 2 שניות; זמן השהיה: 60 שניות. השלבים של קיבוע טבעת עורקית מוצגים באיור 3.

4. סטנדרטיזציה של מתח כלי הדם בטבעת עורקי החולדה

הערה: עבור דגימות חלל שונות, מתח ראשוני אופטימלי היה נחוץ לכלי שיט כדי לשמור על פעילות יוצאת דופן במבחנה. לפרטים ראו הפניה¹⁵.

1. השג את המתח ההתחלתי האופטימלי של טבעת העורקים על ידי הפעלת מתח סביר לאורך קוטר הכלי.
   הערה: בהתבסס על המחקר הקודם¹⁶, המתח המקסימלי המושרה על ידי אגוניסט הושג בערך k פקטור של 0.90 עם מתח המתיחה הראשוני של 1.16 ± 0.04 mN/mm (ערכי ייחוס עבור דגימות כלי שונות: ערך k, 0.90-0.95; מתח ראשוני, 1.16-1.52 mN/mm).
2. בשלב זה, הגדר את ערך המתח הווסקולרי המוצג לאפס. לאחר מכן, החל גירוי משיכה של 3 mN על טבעת העורקים על ידי סיבוב הציר הספירלי של האמבטיה.
3. לאחר דגירה במשך שעה אחת במאגר PSS רווי חמצן ב-37 מעלות צלזיוס, pH 7.40, קבע את ערך המתח ל-0 mN שוב בלוח בקרת המתח של מיקרוגרף החוטים. תהליך ההגדרה של המתח הראשוני של הטבעת העורקית מוצג באיור 4.

5. זיהוי תגובתיות של טבעת עורקים כליליים

1. בצע את הפעילות המכווצת של טבעת העורק הכלילי עם טכניקת המיוגרף של החוט¹⁴, ואמת בשלוש פעולות נפרדות על ידי גירוי עם 60 mM של תמיסת K⁺ במשך 10 דקות כל אחת.
2. לאחר כל גירוי, שטפו את האמבטיה ב-PSS רווי חמצן עד שצליל כלי הדם יחזור למצבו ההתחלתי.
   הערה: רק כאשר תנודת המתח של שלוש המדידות המקבילות הייתה פחות מ-10%, והמשרעת של כל כיווץ הייתה גדולה מ-1 mN/mm, ניתן היה להשתמש בטבעות עורקים מוסמכות ופעילות מאוד לניסויים נוספים. אימות הפעילות של הטבעת הכלילית של החולדה מוצג באיור 5.

6. טיפול לאחר ניתוח

1. לאחר הניתוח, המתים את בעלי החיים בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד.
   הערה: עבור המחקר הנוכחי, בעלי החיים הומתו על ידי שאיפת איזופלורן עודף.

תוצאות

עורקים כליליים של חולדה, הממוקמים במיקום אנטומי, מופצים ומוסתרים עמוק בתוך רקמת שריר הלב, לא זוהו בקלות. על-ידי השוואת העורקים הכליליים של בני אדם (איור 1A) וחולדות (איור 1B), הפרדה מהירה ומדויקת של העורקים הכליליים של חולדות נערכה בהתאם לתהליך הדגימה

Discussion

ההפרעה של מיקרו-סירקולציה כלילית, הכוללת מגוון רחב של חולים עם CAD, הוכרה בהדרגה ודאגה לבסיס לפרפוזיה נאותה של שריר הלב. בהתחשב בסיבוכים החמורים של מחלת לב כלילית פתאומית ומחלות לב וכלי דם, מניעה וטיפול תרופתיים בזמן חשובים ביותר עבור אדם קליני עם CAD¹⁷. באופן בלתי נמנע, הסודיות של...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apigenin	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	150731
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A501330
D-glucose	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610219
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100781
LabChart Professional version 8.3	ADInstruments, Australia	—
MgCl2·6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100288
Multi myograph system	Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark	620M
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100241
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100865
Steel wires	Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark	400447
U46619	Sigma, USA	D8174