Standardisierte Rattenkoronarringpräparation und Echtzeitaufzeichnung dynamischer Spannungsänderungen entlang des Gefäßdurchmessers

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Drahtmyographentechnik zur Messung der vaskulären Reaktivität der Koronararterie der Ratte.

Zusammenfassung

Als Schlüsselereignis von Erkrankungen des Herz-Kreislauf-Systems wurde die koronare Herzkrankheit (KHK) weithin als Hauptursache für Atherosklerose, Myokardinfarkt und Angina pectoris angesehen, die das Leben und die Gesundheit von Menschen auf der ganzen Welt ernsthaft bedrohen. Wie man jedoch die dynamischen biomechanischen Eigenschaften isolierter Blutgefäße aufzeichnet, hat die Menschen lange verwirrt. Inzwischen ist die präzise Positionierung und Isolierung von Koronararterien zur Messung dynamischer Veränderungen der vaskulären Spannung in vitro zu einem Trend in der Entwicklung von CAD-Medikamenten geworden. Das vorliegende Protokoll beschreibt die makroskopische Identifizierung und mikroskopische Trennung von Rattenkoronararterien. Die Kontraktions- und Dilatationsfunktion des Koronararterienrings entlang des Gefäßdurchmessers wurde mit dem etablierten Multimyographensystem überwacht. Die standardisierten und programmierten Protokolle der Koronarangspannungsmessung, von der Probenahme bis zur Datenerfassung, verbessern die Wiederholbarkeit der experimentellen Daten enorm, was die Authentizität der vaskulären Spannungsaufzeichnungen nach physiologischen, pathologischen und medikamentösen Eingriffen gewährleistet.

Einleitung

Die koronare Herzkrankheit (KHK) wurde weithin als typische und repräsentative Herz-Kreislauf-Erkrankung anerkannt und ist die häufigste Todesursache sowohl in Industrie- als auch in Entwicklungsländern ^1,2. Als Blut- und Sauerstoffversorgungsweg für eine normale kardiale physiologische Funktion gelangt zirkulierendes Blut durch zwei Hauptkoronararterien und ein Blutgefäßnetzwerk auf der Oberfläche des Myokards in das Herz und nährt es^{es 3,4}. Cholesterin und Fettablagerungen in den Koronararterien unterbrechen die Blutversorgung des Herzens und die heftige Entzündungsreaktion des Gefäßsystems, was zu Atherosklerose, stabiler Angina, instabiler Angina pectoris, Myokardinfarkt oder plötzlichem Herztod^{führt 5,6}. Als Reaktion auf eine pathologische Stenose der Koronararterien befriedigt der kompensatorisch beschleunigte physiologische Herzschlag die Blutversorgung des Herzens selbst oder der lebenswichtigen Organe des Körpers, indem er die Leistung des linken Ventrikels⁷ erhöht. Wenn eine längere Koronarstenose nicht rechtzeitig gelindert wird, können sich in bestimmten Bereichen des Herzens ausgedehnte neue Blutgefäße entwickeln⁸. Gegenwärtig umfasst die klinische Behandlung von CAD häufig medikamentöse Thrombolyse oder chirurgische mechanische Thrombolyse und einen exogenen bionischen Gefäßbypass mit häufigen Medikamenten und großer chirurgischer Behinderung⁹. Daher ist die funktionelle Untersuchung der physiologischen Aktivität der Koronararterien immer noch ein dringender Durchbruch für Herz-Kreislauf-Erkrankungen¹⁰.

Es gibt keine verfügbaren technischen Mittel zur Erkennung der koronaren physiologischen Aktivität, mit Ausnahme von drahtlosen Telemetriesystemen, die in vivo Koronardruck, Gefäßspannung, Blutsauerstoffsättigung und pH-Werte dynamisch aufzeichnen^{können 11}. Angesichts der strukturellen Geheimhaltung und Komplexität der Koronararterien sind daher die genaue Identifizierung und Isolierung der Koronararterien zweifellos die beste Wahl für die Erforschung mehrerer Mechanismen der CAD in vitro⁴.

Ein Serien-Multimyographensystem, insbesondere ein mikrovaskulärer Spannungsdetektor für Drahtmikroskopie (siehe Materialtabelle), ist ein sehr ausgereiftes marktfähiges Gerät zur Erfassung von In-vitro-Gewebespannungsänderungen kleiner Gefäß-, Lymph- und Bronchienröhren mit den Eigenschaften einer hochpräzisen und kontinuierlichen dynamischen Aufzeichnung¹². Das besagte System wurde umfassend eingesetzt, um In-vitro-Gewebespannungseigenschaften von Hohlraumstrukturen mit Durchmessern von 60 μm bis 10 mm zu erfassen. Die kontinuierlichen Erwärmungseigenschaften der Plattform der Drahtmikroskopie gleichen die Stimulation der nachteiligen äußeren Umgebung weitgehend aus. In der Zwischenzeit ermöglichen uns die konstanten Eingaben des Gasgemisches und die pH-Werte, genauere Gefäßspannungsdaten in einem ähnlichen physiologischen Zustand^{zu erhalten 13}. In Anbetracht der Komplexität der anatomischen Lokalisation von Koronararterien von Ratten (Abbildung 1) hat seine Isolierung jedoch die Erforschung diversifizierter kardiovaskulärer Erkrankungen und der Arzneimittelentwicklung durch den Mechanismus verwirrt und eingeschränkt. Daher stellt das vorliegende Protokoll die anatomische Lage und den Trennprozess der Koronararterie der Ratte im Detail vor, gefolgt von einer Spannungsmessung auf der Plattform der Drahtmikroskopie¹⁴.

Protokoll

Das Tierprotokoll wurde vom Management Committee der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine überprüft und genehmigt (Record No. 2021-11). Männliche Sprague Dawley (SD) Ratten (260-300 g, 8-10 Wochen alt) wurden für die vorliegende Studie verwendet. Die Ratten wurden in einer Tierkammer gehalten und konnten während des Experiments frei trinken und essen.

1. Lösungsvorbereitung

1. Es wird eine physiologische Salzlösung (PSS) hergestellt, indem 118 mM NaCl, 4,7 mM K+, 2,5 mM_CaCl2, 1,2 mM_KH2PO4, 1,2 mM MgCl₂∙6H 2O,₂₅mM _{NaHCO 3}^, 11 mM D-Glucose und 5 mM HEPES (siehe Materialtabelle) gelöst werden.
2. Es wird eine Salzlösung mit hohem K+-Gehalt hergestellt, indem 58 mM NaCl, 60 mM K⁺, 2,5 mM CaCl 2, 1,2 mM KH 2 PO4, 1,2 mM MgCl₂∙6H 2O, 25 mM _{NaHCO 3}^, 11 mMD-Glucose und 5 mM HEPES gelöst werden.
3. Die beiden oben genannten Lösungen werden gesättigt und mit einem Mischgas von 95_{% O2} und 5% CO₂ blasen. In der Zwischenzeit werden die pH-Werte der Lösung zwischen 7,38 und 7,42 mit 2 mM NaOH gehalten.
   HINWEIS: Detaillierte Informationen zur Lösungsvorbereitung finden Sie unter Referenz¹⁵.

2. Koronararteriendissektion der Ratte

1. Betäuben Sie die Ratte durch Inhalation von 2% Isofluran. Bestätigen Sie die Tiefenanästhesie durch Zehenkneifen und verabreichen Sie bei Bedarf zusätzliche Anästhetika. Öffnen Sie dann sofort die Brusthöhle, um das Herz auf dem tragbaren Operationstisch nach einem zuvor veröffentlichten Bericht¹² freizulegen.
2. Nachdem Sie das Herz dissoziiert und entfernt haben, lassen Sie das restliche Blut aus allen Herzkammern ab, indem Sie es leicht mit einer medizinischen Kunststoffzange zusammendrücken. Geben Sie das vorverarbeitete Herz schnell in eine Petrischale mit 95%_O2 + 5% CO₂ gesättigtem PSS bei 4 °C mit einem pH-Wert von 7,40.
3. Um die anatomische Position der Koronararterien genau zu identifizieren, passen Sie die Haltung des isolierten Herzens unter dem Lichtmikroskop gemäß dem schematischen Diagramm an (Abbildung 2A).
   HINWEIS: In der Frontalansicht befanden sich die rechte Ohrmuschel und die Lungenarterie oben links bzw. oben rechts.
   1. Schneiden Sie die linke und rechte Ventrikelhöhle entlang der interventrikulären Septum von der Wurzel der Lungenarterie mit chirurgischer Schere und Pinzette ab (Abbildung 2B).
4. Um die linke und rechte Koronararterien vom Myokardgewebe zu dissoziieren, sezieren Sie den rechten Ventrikel unter einem optischen anatomischen Mikroskop, um den rechten Koronararterienzweig gründlich freizulegen. Identifizieren Sie dann die Position der linken Koronararterie, indem Sie das Herzgewebe um 45° im Uhrzeigersinn drehen (Abbildung 2D).
5. Nachdem Sie das umgebende klebrige Myokardgewebe entfernt haben, erkennen Sie explizit die pulsierenden linken (ca. 5 mm) und rechten (ca. 5 mm) Koronararterien. Trennen Sie die Koronararterien in der Mitte sofort und tauchen Sie bei 4 °C vollständig in PSS ein. Erwerben Sie einen arteriellen Ring von etwa 2 mm, indem Sie die abgelöste Arterie mit einer anatomischen Schere vertikal schneiden, um die Gefäßspannung unter verschiedenen Reizen aufzuzeichnen (Abbildung 2E).

3. Aufhängung und Fixierung des arteriellen Rings

HINWEIS: Weitere Informationen zu diesem Schritt finden Sie unter Referenz¹⁴.

1. Bereiten Sie zwei 2 cm lange Edelstahldrähte vor (siehe Materialtabelle) und tränken Sie sie in einer 4 °C PSS-Lösung, die mit 95% O 2 + 5% CO₂ gesättigt ist. Führen Sie beide Drähte parallel durch den arteriellen Ring zusammen mit der Richtung des Gefäßes unter einem optischen anatomischen Mikroskop und mit Drähten gleicher Länge, die an beiden Enden der Gefäßhöhle freiliegen.
2. Befestigen Sie den arteriellen Ring mit dem Stahldraht vorne und hinten im Bad des Drahtes Mikrograph, gefüllt mit sprudelndem PSS mit 95% O 2 + 5% CO_2. Drehen Sie den horizontalen Schraubenknopf für einen angemessenen vorderen und hinteren Abstand, so dass die beiden Drähte horizontal sind und sich der arterielle Ring in einem natürlichen Entspannungszustand befindet.
3. Öffnen Sie nach der Installation des DMT-Bades am Thermostatgerät die Datenerfassungssoftware (siehe Materialtabelle), um sicherzustellen, dass das entsprechende Wegsignal aufgezeichnet wurde. Stellen Sie die folgenden Parameter ein: Okularkalibrierung (mm/div): 0,36; Zieldruck (kPa): 13,3; IC1/IC100: 0,9; Online-Mittelungszeit: 2 s; Verzögerungszeit: 60 S. Die Schritte der arteriellen Ringfixierung sind in Abbildung 3 dargestellt.

4. Standardisierung der Gefäßspannung im arteriellen Ring der Ratte

HINWEIS: Für verschiedene Hohlraumproben war eine optimale Anfangsspannung erforderlich, damit die Gefäße eine außergewöhnliche Aktivität in vitro aufrechterhalten konnten. Weitere Informationen finden Sie unter Referenz¹⁵.

1. Erreichen Sie die optimale Anfangsspannung des arteriellen Rings, indem Sie eine angemessene Spannung entlang des Durchmessers des Gefäßes anwenden.
   ANMERKUNG: Basierend auf der vorherigen Studie 16 wurde die maximale Agonisten-induzierte Spannung beim Faktor k Wert von 0,90 mit der Anfangsdehnungsspannung von 1,16 ± 0,04 mN/mm erreicht (Referenzwerte für verschiedene Gefäßproben: k-Wert, 0,90-0,95; Anfangsspannung, 1,16-1,52 mN/mm).
2. Setzen Sie an dieser Stelle den angezeigten Gefäßspannungswert auf Null. Danach wenden Sie einen 3 mN Zugreiz auf den arteriellen Ring an, indem Sie die Spiralachse des Bades drehen.
3. Nach der Inkubation für 1 h im sauerstoffgesättigten PSS-Puffer bei 37 °C, pH 7,40, stellen Sie den Spannungswert auf dem Zugkontrollfeld der Drahtmikroskopaufnahme erneut auf 0 mN ein. Der Abbindeprozess der Anfangsspannung des arteriellen Rings ist in Abbildung 4 dargestellt.

5. Reaktivitätserkennung des Koronararterienrings

1. Führen Sie die kontraktile Aktivität des Koronararterienrings mit der Drahtmyographentechnik 14 durch und validieren Sie in drei separaten Operationen, indem Sie mit 60 mM ^{K + -}Lösung für jeweils¹⁰ min stimulieren.
2. Nach jeder Stimulation spülen Sie das Bad mit sauerstoffgesättigtem PSS, bis der Gefäßtonus in seinen ursprünglichen Zustand zurückkehrt.
   HINWEIS: Nur wenn die Spannungsschwankung der drei parallelen Messungen weniger als 10% betrug und die Amplitude jeder Kontraktion größer als 1 mN/mm war, konnten qualifizierte und hochaktive arterielle Ringe für weitere Experimente verwendet werden. Die Aktivitätsüberprüfung des Rattenkoronarrings ist in Abbildung 5 dargestellt.

6. Postoperative Behandlung

1. Nach der Operation die Tiere nach institutionell genehmigten Protokollen einschläfern.
   ANMERKUNG: Für die vorliegende Studie wurden die Tiere durch Einatmen von überschüssigem Isofluran eingeschläfert.

Ergebnisse

Anatomisch positionierte, tief im Myokardgewebe verteilte und verborgene Koronararterien der Ratten waren nicht leicht zu erkennen. Durch den Vergleich der Koronararterien von Menschen (Abbildung 1A) und Ratten (Abbildung 1B) wurde eine schnelle und genaue Trennung der Koronararterien von Ratten gemäß dem Probenahmeverfahren in Abbildung 2 durchgeführt. Nach der präzisen Lokalisierung der rechten Ohrmuschel, der Lungenarterie un...

Diskussion

Die Störung der koronaren Mikrozirkulation, an der ein breites Spektrum von Patienten mit KHK beteiligt ist, wurde allmählich erkannt und betraf die Grundlage für eine adäquate Myokardperfusion. In Anbetracht der schwerwiegenden Komplikationen der plötzlichen koronaren Herzkrankheit und der Herz-Kreislauf-Erkrankung sind eine rechtzeitige medikamentöse Prävention und Behandlung für eine klinische Person mit CAD¹⁷ äußerst wichtig. Zwangsläufig haben die Geheimhaltung der Anatomie der Kor...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apigenin	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	150731
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A501330
D-glucose	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610219
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100781
LabChart Professional version 8.3	ADInstruments, Australia	—
MgCl2·6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100288
Multi myograph system	Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark	620M
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100241
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100865
Steel wires	Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark	400447
U46619	Sigma, USA	D8174