بروتوكول ما قبل التحليل المسبق للخزعة السائلة الموحدة لتطبيقات الحمض النووي الخالية من التداول في المراحل النهائية

Summary

لقد أحدثت الخزعة السائلة ثورة في نهجنا في الدراسات الانتقالية لعلم الأورام ، حيث يعد جمع العينات وجودتها وتخزينها خطوات حاسمة لتطبيقها السريري الناجح. هنا نصف بروتوكولا موحدا ومعتمدا لتطبيقات الحمض النووي الخالية من التداول في المراحل النهائية والتي يمكن تطبيقها في معظم مختبرات الأبحاث الانتقالية.

Abstract

يشير مصطلح الخزعة السائلة (LB) إلى جزيئات مثل البروتينات أو الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو الخلايا أو الحويصلات خارج الخلية في الدم وسوائل الجسم الأخرى التي تنشأ من الورم الأساسي و / أو النقيلي. برز LB كدعامة أساسية في البحوث الانتقالية وبدأ يصبح جزءا من ممارسة الأورام السريرية ، مما يوفر بديلا طفيف التوغل للخزعة الصلبة. يسمح LB بمراقبة الورم في الوقت الفعلي عن طريق استخراج عينة طفيفة التوغل ، مثل الدم. وتشمل التطبيقات الكشف المبكر عن السرطان، ومتابعة المرضى للكشف عن تطور المرض، وتقييم الحد الأدنى من الأمراض المتبقية، والتحديد المحتمل للتطور الجزيئي وآلية المقاومة. من أجل تحقيق تحليل موثوق به لهذه العينات التي يمكن الإبلاغ عنها في العيادة ، يجب النظر بعناية في إجراءات ما قبل التحليل واتباعها بدقة. يعد جمع العينات وجودتها وتخزينها خطوات حاسمة تحدد فائدتها في التطبيقات النهائية. هنا ، نقدم بروتوكولات موحدة من وحدة عمل الخزعة السائلة الخاصة بنا لجمع ومعالجة وتخزين عينات البلازما والمصل لتحليل الخزعة السائلة في المصب بناء على الحمض النووي الخالي من التداول. تتطلب البروتوكولات المعروضة هنا معدات قياسية ومرنة بما يكفي لتطبيقها في معظم المختبرات التي تركز على الإجراءات البيولوجية.

Introduction

تم تعريف مصطلح "الخزعة السائلة" في عام 2010¹ على أنه وجود جزيئات (مثل البروتين أو الحمض النووي الريبي النووي (DNA) أو الحمض النووي الريبي (RNA)) أو الخلايا أو الحويصلات خارج الخلية (على سبيل المثال ، الإكسوسومات) في الدم وسوائل الجسم الأخرى التي تنشأ من الورم الأساسي. أحدث استخدام عينات الخزعة السائلة ثورة في أبحاث الأورام الانتقالية حيث أن خزعات الأنسجة ، التي تقتصر على منطقة معينة في لحظة معينة ، قد تفوت النسخ المستنسخة ذات الصلة بسبب عدم تجانس الورم. بالإضافة إلى ذلك ، تلعب الخزعة السائلة دورا ذا صلة في أنواع الأورام حيث تكون الأنسجة الأولية نادرة أو لا يمكن الوصول إليها ، لأنها قد تتجنب الخزعة الغازية ، مما يقلل من التكاليف والمخاطر على المرضى. علاوة على ذلك ، تتطور الخصائص الجزيئية للورم باستمرار ويرجع ذلك أساسا إلى ضغط العلاج ، ويمكن لعينات الخزعة السائلة التقاط الديناميكيات النسيلية للورم حيث يمكن أخذها طوليا ، في أوقات سريرية وعلاجية مختلفة من المرض مثل خط الأساس ، على العلاج ، أفضل استجابة ، وعند تطور المرض أو حتى قبل ذلك. مفهوم "الخزعة السائلة في الوقت الحقيقي" يعني أنه يمكن مراقبة التغيرات الديناميكية في الورم في الوقت الفعلي ، مما يسمح بالطب الدقيق في هذا المرض. الخزعة السائلة لها العديد من التطبيقات المحتملة في العيادة ، بما في ذلك الفحص والكشف المبكر عن السرطان ، والمراقبة في الوقت الفعلي للمرض ، والكشف عن الحد الأدنى من الأمراض المتبقية ، ودراسة آليات مقاومة العلاج ، والتقسيم الطبقي للمرضى على المستوى العلاجي¹. يعد الكشف المبكر عن تكرار المرض وتطوره حاجة سريرية غير ملباة في العديد من أنواع الأورام وهو عامل رئيسي في زيادة بقاء مرضى السرطان على قيد الحياة ونوعية حياتهم. قد تفتقر طرق التصوير الروتينية وعلامات الورم القابلة للذوبان إلى الحساسية و / أو الخصوصية المطلوبة لهذه المهمة. وبالتالي ، هناك حاجة ماسة إلى علامات تنبؤية جديدة في العيادة ، مثل تلك القائمة على تعميم الأحماض النووية الحرة.

تشمل أنواع العينات المستخدمة في دراسات الخزعة السائلة على سبيل المثال لا الحصر عينات الدم والبول واللعاب والبراز. يمكن أن تكون العينات الأخرى الخاصة بالورم عبارة عن شفطات الخلايا والسائل الدماغي الشوكي والسائل الجنبي والكيس وسائل الاستسقاء والبلغم وعصير البنكرياس². قد تحتوي السوائل السابقة على أنواع مختلفة من المواد المشتقة من السرطان ، أو الخلايا السرطانية المتداولة (CTC) ، أو شظايا مثل الإكسوسومات والحمض النووي للورم المتداول الخالي من الخلايا (ctDNA). قد يتم تغليف الأحماض النووية في حويصلات خارج الخلية (EVs) أو إطلاقها في سوائل الجسم بسبب موت الخلايا وتلفها. يتم إطلاق الحمض النووي الحر المنتشر (cfDNA) بشكل رئيسي في مجرى الدم من الخلايا الماصة أو الميتة وهو موجود في جميع الأفراد ، مما يدل على زيادة المستويات في الأمراض الالتهابية أو الأورام³. Exosomes هي حويصلات صغيرة خارج الخلية (~ 30-150 نانومتر) تفرزها الخلايا التي تحتوي على الأحماض النووية والبروتينات والدهون. تشكل هذه الحويصلات جزءا من شبكة الاتصالات بين الخلايا وتوجد عادة في العديد من أنواع سوائل الجسم². الأحماض النووية المغلقة داخل المركبات الكهربائية محمية من البيئة القاسية داخل سوائل الجسم، وبالتالي توفير طريقة أكثر قوة لدراسة هذه الجزيئات في إعداد الخزعة السائلة.

وعموما، فإن مستويات الأحماض النووية المتداولة في عينات الخزعة السائلة منخفضة جدا، وبالتالي هناك حاجة إلى طرق حساسة للكشف، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي أو تسلسل الجيل التالي (NGS). تعد الإدارة قبل التحليلية للعينة أمرا بالغ الأهمية لمنع تحلل خلايا الدم وإطلاق الحمض النووي السليم ، مما يتسبب في تلوث cfDNA بالحمض النووي الجينومي. علاوة على ذلك ، يجب توخي الحذر عند استخراج العينات لتجنب وجود مثبطات لطرق التحليل القائمة على الإنزيم.

نقدم هنا طريقة موحدة لجمع وتخزين عينات البلازما والمصل ، وهي خطوة أولى حاسمة للتطبيقات النهائية القائمة على الخزعة السائلة ، بما في ذلك تحليلات الحمض النووي المتداولة.

Protocol

تم الحصول على موافقة أخلاقية مسبقة من المراكز المشاركة قبل استخراج عينات الدم. تم تنفيذ البروتوكولات التالية لعزل المصل والبلازما وفقا للمبادئ الأخلاقية للبحوث الطبية الحيوية.

ملاحظة: يتم توفير الاعتبارات السابقة قبل بدء البروتوكول هنا. مطلوب موافقة أخلاقية مسبقة لاستخدام العينات البشرية في البحوث الطبية الحيوية ، مع الموافقة المستنيرة المقابلة. مطلوب خزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية للتعامل مع عينات الدم. يجب ارتداء معطف المختبر والقفازات الواقية والنظارات طوال العملية لتجنب العدوى بمسببات الأمراض المنقولة بالدم. مطلوب ما لا يقل عن 30 دقيقة لمعالجة عينات المصل. بعد استخراج الدم في أنابيب بدون مضادات التخثر ، حافظ على درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30-45 دقيقة للسماح بتكوين الجلطة. مطلوب ما لا يقل عن 40 دقيقة لإعداد البلازما ، ويجب معالجة العينات في غضون 4 ساعات من وقت الاستخراج عند استخدام أنابيب حمض الإيثيلين ديامين رباعي حمض الخليك (EDTA) أو في غضون 24-48 ساعة إذا كنت تستخدم أنابيب تجميع تثبيت الخلايا أو أنابيب محددة لجمع الحمض النووي خالية من الخلايا. ومع ذلك ، وفقا لبعض الشركات المصنعة ، فإن العينات مستقرة لمدة تصل إلى 2 أسابيع في هذه الأنابيب المتخصصة. من المهم التحقق من انحلال الدم ، مما سيعطي البلازما أو جزء المصل مظهرا محمرا. راجع قسم استكشاف الأخطاء وإصلاحها للحصول على عينات انحلال في المناقشة.

1. إعداد المصل لدراسات الخزعة السائلة

ملاحظة: إجمالي الوقت المطلوب لتنفيذ هذه الخطوة هو 30 دقيقة (الشكل 1).

1. استخراج 4-10 مل من الدم في أنابيب لا تحتوي على مضادات التخثر (غطاء أحمر أو أحمر / رمادي أسود) والحفاظ عليها في RT لمدة 30-45 دقيقة. معالجة هذه العينات في غضون 4 ساعات من وقت الاستخراج.
2. سجل وقت وتاريخ استخراج العينة وتحديد الموضوع (ID) في قاعدة بيانات عينة مصممة بشكل مناسب.
3. ارتداء معطف المختبر والقفازات الواقية والنظارات، وجهاز الطرد المركزي للأنبوب الذي يحتوي على دم جديد في RT (15 درجة مئوية -25 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق عند 1600 (± 150) × غرام، مع تطبيق الحد الأقصى للكسر.
4. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الأنبوب بعناية من جهاز الطرد المركزي ؛ ستظهر المرحلة العليا من supernatant المصل واضحة وصفراء (الشكل 2). تحقق مما إذا كانت العينة تظهر علامات انحلال الدم (الشكل 3) وسجل وجود انحلال الدم عند الاقتضاء.
5. في خزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية ، انقل المصل إلى أنابيب التجميع على شكل 250 ميكرولتر أليكوتس.
   ملاحظة: يجب تعديل حجم الأليكوتس وفقا لمتطلبات الدراسة.
6. قم بتجميد المصل على الفور في وضع مستقيم في صندوق تخزين عند -80 درجة مئوية وسجل وقت تخزين العينة.
7. تحقق من معالجة العينات خلال الإطار الزمني المطلوب البالغ 4 ساعات.

2. تحضير البلازما لدراسات الخزعة السائلة

ملاحظة: إجمالي الوقت المطلوب لتنفيذ هذه الخطوة هو 40 دقيقة (الشكل 4).

1. استخراج 4-10 مل من الدم في أنابيب تحتوي على الإيثيلين ديامين رباعي حمض الخليك (EDTA). معالجة العيناتفي غضون 4 ساعات من وقت الاستخراج.
2. سجل وقت وتاريخ استخراج العينة ومعرف الموضوع في قاعدة بيانات نموذجية مصممة بشكل مناسب.
3. يرتدي معطف المختبر والقفازات الواقية والنظارات ، جهاز الطرد المركزي لأنبوب EDTA في RT (15 درجة مئوية - 25 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق عند 1600 (± 150) × g ، مع تطبيق الحد الأقصى للكسر.
   ملاحظة: ارجع إلى إرشادات الشركة المصنعة عند استخدام أنابيب تجميع أخرى.
4. بعد الطرد المركزي ، سيظهر السوبرنات البلازما واضحا ومصفرا. تحقق مما إذا كانت العينة تظهر علامات انحلال الدم (الشكل 3) ونقل البلازما (supernatant) إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل دون إزعاج الطبقة الخلوية باستخدام ماصة مصلية يمكن التخلص منها (أو ماصة لمبة يمكن التخلص منها أو ماصات p1000 مع طرف مرشح). اترك كمية صغيرة متبقية من البلازما فوق طبقة الخلية (حوالي 5 مم).
5. إذا لوحظ انحلال الدم، تخلص من العينة لإجراء مزيد من التحليلات. (الشكل 5). راجع قسم استكشاف الأخطاء وإصلاحها في المناقشة لتقييم انحلال الدم.
6. قم بطرد البلازما في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل في RT (15 درجة مئوية -25 درجة مئوية) لمدة 10-20 دقيقة عند 3000 (±150) × جم. قم بتنفيذ هذه الخطوة لإزالة أي خلايا دم سليمة متبقية تم نقلها من خطوة الطرد المركزي الأولى.
7. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الأنبوب بعناية من جهاز الطرد المركزي ونقل 1-4 مل من البلازما إلى 1-4 مل من قوارير البولي بروبيلين المبردة باستخدام ماصة مصلية يمكن التخلص منها (أو ماصة لمبة يمكن التخلص منها أو ماصات p1000 مع طرف مرشح). يجب ترك الحجم المتبقي من البلازما (حوالي 0.3 مل أو 7 مم) في الجزء السفلي من الأنبوب لتجنب تلويث البلازما بخلايا الدم (الشكل 5).
8. قم بتجميد البلازما على الفور في وضع مستقيم في صندوق التخزين عند -80 درجة مئوية وسجل وقت تخزين العينة. تحقق من معالجة العينات خلال الإطار الزمني المطلوب البالغ 4 ساعات.
9. جمع الطبقة الخلوية (معطف بافي) باستخدام P1000 وطرف مصفى ونقلها إلى أنبوب 2 مل. تجمد على الفور وتخزينها في -80 درجة مئوية.

النتائج

بعد الطرد المركزي لأنابيب الدم بدون مضادات التخثر ، تظهر المرحلة العليا باللون الأصفر الباهت وتتوافق مع جزء المصل (الشكل 2). تتم إزالة هذا الكسر بعناية واقتباسه للتحليل اللاحق.

قد يكون انحلال الدم موجودا إما في جزء البلازما أو المصل ، وسيكون للمرحلة العليا م?...

Discussion

الخزعة السائلة لها العديد من التطبيقات المحتملة في أوقات مختلفة أثناء إدارة السرطان. أولا ، عند التشخيص لتحديد العلامات الجزيئية للورم التي من شأنها أن تشير إلى وجود آفة ورم محتملة يمكن التحقيق فيها سريريا. ثانيا ، أثناء العلاج للمراقبة في الوقت الفعلي للمرض ، وتقييم الاستجابة الجزيئية ل...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 120.086	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010010	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367525	These tubes can be used for plasma collection
15 mL polypropylene centrifuge tubes	BIOFIL	CFT411150	Any standard tubes/equipment can be used
3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	368965	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing	Corning	430662	Any standard tubes/equipment can be used
4 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367864	These tubes can be used for plasma collection
4200 TapeStation System	Agilent	G2991BA	Several quantification methods are available with a  specific application for cfDNA
5 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010005	Any standard tubes/equipment can be used
8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	366468	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor	Thermo Fisher Scientific	Sorvall ST 16  10688725	Any standard tubes/equipment can be used
Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials	Corning	431120	These boxes are needed when using 4 mL vials for storage
p1000 pipette tips	CORNING	4809	Any standard tubes/equipment can be used
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit	Qiagen	55114	Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.
Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL	Streck	218997	These tubes can be used for plasma collection
Temperature Freezer (-80 °C)	ESCO	2180104	Any standard tubes/equipment can be used