Aşağı Akış Dolaşımsız DNA Uygulamaları için Standartlaştırılmış Bir Sıvı Biyopsi Preanalitik Protokolü

Özet

Sıvı biyopsi, onkoloji translasyonel çalışmalarına yaklaşımımızda devrim yarattı ve örnek toplama, kalite ve depolama, başarılı klinik uygulaması için çok önemli adımlardı. Burada, çoğu translasyonel araştırma laboratuvarında uygulanabilecek aşağı akış dolaşımsız DNA uygulamaları için standartlaştırılmış ve doğrulanmış bir protokolü açıklıyoruz.

Özet

Sıvı biyopsisi (LB) terimi, birincil ve / veya metastatik tümörden kaynaklanan kan ve diğer vücut sıvılarındaki proteinler, DNA, RNA, hücreler veya hücre dışı veziküller gibi molekülleri ifade eder. LB, translasyonel araştırmalarda bir dayanak noktası olarak ortaya çıkmış ve solid biyopsiye minimal invaziv bir alternatif sunarak klinik onkoloji uygulamasının bir parçası haline gelmeye başlamıştır. LB, kan gibi minimal invaziv bir numune ekstraksiyonu yoluyla bir tümörün gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Uygulamalar arasında erken kanser tespiti, hastalık progresyonunun tespiti için hasta takibi, minimal rezidüel hastalığın değerlendirilmesi ve moleküler progresyon ve direnç mekanizmasının potansiyel olarak tanımlanması yer almaktadır. Klinikte rapor edilebilen bu örneklerin güvenilir bir analizini elde etmek için, preanalitik prosedürler dikkatlice düşünülmeli ve kesinlikle takip edilmelidir. Örnek toplama, kalite ve depolama, aşağı akış uygulamalarında kullanışlılıklarını belirleyen önemli adımlardır. Burada, dolaşımda olmayan DNA'ya dayalı aşağı akış sıvı biyopsi analizi için plazma ve serum örneklerinin toplanması, işlenmesi ve depolanması için sıvı biyopsi çalışma modülümüzden standartlaştırılmış protokoller sunuyoruz. Burada sunulan protokoller standart ekipman gerektirir ve biyolojik prosedürlere odaklanan çoğu laboratuvarda uygulanacak kadar esnektir.

Giriş

"Sıvı biyopsi" terimi 2010 yılında¹ birincil tümörden kaynaklanan kan ve diğer vücut sıvılarında moleküllerin (örneğin, protein, deoksiribonükleik asit (DNA), ribonükleik asit (RNA)), hücrelerin veya hücre dışı veziküllerin (örneğin, eksozomlar) varlığı olarak tanımlanmıştır. Sıvı biyopsi örneklerinin kullanımı, translasyonel onkoloji araştırmalarında devrim yaratmıştır, çünkü belirli bir anda belirli bir bölgeyle sınırlı olan doku biyopsileri, tümör heterojenliği nedeniyle ilgili klonları kaçırabilir. Ek olarak, sıvı biyopsi, primer dokunun az olduğu veya erişilemediği tümör tiplerinde ilgili bir rol oynar, çünkü invaziv bir biyopsiden kaçınabilir, hastalar için maliyetleri ve riski azaltabilir. Ayrıca, tümörün moleküler özellikleri esas olarak tedavi baskısı nedeniyle sürekli olarak gelişmektedir ve sıvı biyopsi örnekleri, tümör klonal dinamiklerini, hastalığın başlangıç, tedavi, en iyi yanıt ve hatta daha önce olduğu gibi hastalığın farklı klinik ve terapötik zamanlarında uzunlamasına alınabildikleri için yakalayabilir. "Gerçek zamanlı sıvı biyopsisi" kavramı, tümördeki dinamik değişikliklerin gerçek zamanlı olarak izlenebileceği ve böylece bu hastalıkta hassas tıbba izin verilebileceği anlamına gelir. Sıvı biyopsi, kanserin taranması ve erken teşhisi, hastalığın gerçek zamanlı izlenmesi, minimal kalıntı hastalığın tespiti, tedavi direnci için mekanizmaların incelenmesi ve hastaların terapötik düzeyde^{sınıflandırılması} dahil olmak üzere klinikte çok sayıda potansiyel uygulamaya sahiptir. Hastalığın nüksünün ve progresyonunun erken saptanması birçok tümör tipinde karşılanmamış bir klinik ihtiyaçtır ve kanser hastalarının sağkalımını ve yaşam kalitesini arttırmada anahtar faktördür. Rutin görüntüleme yöntemleri ve çözünür tümör belirteçleri bu görev için gereken duyarlılık ve/veya özgüllükten yoksun olabilir. Bu nedenle, klinikte, dolaşımdaki serbest nükleik asitlere dayananlar gibi yeni prediktif belirteçlere acilen ihtiyaç duyulmaktadır.

Sıvı biyopsi çalışmaları için kullanılan örnek türleri kan, idrar, tükürük ve dışkı örneklerini içerir, ancak bunlarla sınırlı değildir. Diğer tümöre özgü örnekler hücre aspiratları, beyin omurilik sıvısı, plevral sıvı, kist ve asit sıvısı, balgam ve pankreas suyu² olabilir. Eski sıvılar, farklı tipte kanserden türetilmiş materyaller, dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC) veya eksozomlar ve hücresiz dolaşımdaki tümör DNA'sı (ctDNA) gibi fragmanlar içerebilir. Nükleik asitler hücre dışı veziküllerde (EV'ler) kapsüllenebilir veya hücre ölümü ve hasarı nedeniyle vücut sıvılarına salınabilir. Dolaşımdaki serbest DNA (cfDNA) esas olarak apoptotik veya nekrotik hücrelerden kan dolaşımına salınır ve tüm bireylerde bulunur, enflamatuar veya onkolojik hastalıklarda artmış seviyeler gösterir³. Eksozomlar, nükleik asitler, proteinler ve lipitler içeren hücreler tarafından salgılanan küçük hücre dışı veziküllerdir (~ 30-150 nm). Bu veziküller hücreler arası iletişim ağının bir parçasını oluşturur ve birçok vücut sıvısı türünde yaygın olarak bulunur². EV'lerin içindeki nükleik asitler, vücut sıvıları içindeki sert ortamdan korunur, böylece bu molekülleri sıvı biyopsi ortamında incelemek için daha sağlam bir yol sağlar.

Genel olarak, sıvı biyopsi örneklerinde dolaşımdaki nükleik asit seviyeleri çok düşüktür ve bu nedenle dijital PCR veya yeni nesil dizileme (NGS) gibi algılama için hassas yöntemlere ihtiyaç vardır. Numunenin preanalitik yönetimi, kan hücresi lizisini ve bozulmamış DNA'nın salınmasını önlemek için çok önemlidir, bu da cfDNA'nın genomik DNA ile kontaminasyonuna neden olur. Ayrıca, enzim bazlı analiz yöntemlerinin inhibitörlerinin varlığından kaçınmak için numuneler çıkarılırken dikkatli olunmalıdır.

Burada, dolaşımdaki nükleik asit analizleri de dahil olmak üzere sıvı biyopsi bazlı aşağı akış uygulamaları için çok önemli bir ilk adım olan plazma ve serum örneklerinin toplanması ve depolanması için standartlaştırılmış bir yöntem sunuyoruz.

Protokol

Kan örneklerinin çıkarılmasından önce katılımcı merkezlerden önceden etik onay alınmıştır. Serum ve plazma izolasyonu için aşağıdaki protokoller biyomedikal araştırmalar için etik ilkelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

NOT: Protokole başlamadan önce dikkat edilmesi gereken hususlar burada verilmiştir. İnsan örneklerinin biyomedikal araştırmalarda kullanımı için, ilgili bilgilendirilmiş onam ile önceden etik onay gereklidir. Kan örneklerini işlemek için sınıf II biyogüvenlik kabini gereklidir. Kan yoluyla bulaşan patojenlerin enfeksiyonunu önlemek için prosedür boyunca bir laboratuvar önlüğü, koruyucu eldiven ve gözlük giyilmelidir. Serum örneklerinin işlenmesi için en az 30 dakika gereklidir. Antikoagülansız tüplerde kan alındıktan sonra, pıhtı oluşumuna izin vermek için 30-45 dakika oda sıcaklığında (RT) tutun. Plazma hazırlanması için en az 40 dakika gereklidir ve numuneler, etilendiamin tetra-asetik asit (EDTA) tüpleri kullanılırken ekstraksiyon zamanından itibaren 4 saat içinde veya hücre stabilize edici toplama tüpleri veya spesifik hücresiz DNA toplama tüpleri kullanılıyorsa 24-48 saat içinde işlenmelidir. Bununla birlikte, bazı üreticilere göre, numuneler bu özel tüplerde 2 haftaya kadar stabildir. Plazma veya serum fraksiyonuna kırmızımsı bir görünüm kazandıracak olan hemolizi kontrol etmek önemlidir. Tartışmadaki hemolize örnekler için sorun giderme bölümüne bakın.

1. Sıvı biyopsi çalışmaları için serum hazırlığı

NOT: Bu adımı gerçekleştirmek için gereken toplam süre 30 dakikadır (Şekil 1).

1. Antikoagülan içermeyen tüplerde (kırmızı veya kırmızı/gri-siyah kapak) 4-10 mL kan çıkarın ve RT'de 30-45 dakika tutun. Bu numuneleri ekstraksiyon zamanından itibaren 4 saat içinde işleyin.
2. Numune ayıklama işleminin saatini ve tarihini ve konu kimliğini (ID) uygun şekilde tasarlanmış bir numune veritabanına kaydedin.
3. Bir laboratuvar önlüğü, koruyucu eldiven ve gözlük giyerek, RT'de (15 ° C-25 ° C) taze kan içeren tüpü, maksimum mola uygulanarak 1.600 (± 150) x g'de 10 dakika boyunca santrifüj edin.
4. Santrifüjlemeden sonra, tüpü santrifüjden dikkatlice çıkarın; serum süpernatantının üst fazı berrak ve sarımsı görünecektir (Şekil 2). Numunenin hemoliz belirtileri gösterip göstermediğini kontrol edin (Şekil 3) ve uygun olduğunda hemoliz varlığını kaydedin.
5. Sınıf II biyogüvenlik kabininde, serumu toplama tüplerine 250 μL alikot olarak aktarın.
   NOT: Alikotların hacmi, çalışma gereksinimlerine göre ayarlanmalıdır.
6. Serumu hemen -80 °C'de bir saklama kutusunda dik olarak dondurun ve numune saklama süresini kaydedin.
7. Numunelerin gerekli 4 saatlik zaman dilimi içinde işlendiğini doğrulayın.

2. Sıvı biyopsi çalışmaları için plazma hazırlığı

NOT: Bu adımı gerçekleştirmek için gereken toplam süre 40 dakikadır (Şekil 4).

1. Etilendiamin tetra-asetik asit (EDTA) içeren tüplerde 4-10 mL kan ekstrakte edin. Numuneleri ekstraksiyon zamanından itibaren 4 saat içinde işleyin.
2. Numune ayıklamanın saatini ve tarihini ve konu kimliğini uygun şekilde tasarlanmış bir örnek veritabanına kaydedin.
3. Bir laboratuvar önlüğü, koruyucu eldiven ve gözlük giyerek, EDTA tüpünü RT'de (15 ° C-25 ° C) 10 dakika boyunca 1.600 (± 150) x g'de santrifüj yapın ve maksimum mola uygulayın.
   NOT: Diğer toplama tüplerini kullanırken üreticinin talimatlarına bakın.
4. Santrifüjlemeden sonra, plazma süpernatantı berrak ve sarımsı görünecektir. Numunenin hemoliz belirtileri gösterip göstermediğini kontrol edin (Şekil 3) ve plazmayı (süpernatant) tek kullanımlık serolojik pipet (veya tek kullanımlık ampul pipeti veya filtre uçlu p1000 pipetler) kullanarak hücresel tabakayı rahatsız etmeden 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücre tabakasının üzerinde küçük bir artık plazma hacmi bırakın (yaklaşık 5 mm).
5. Hemoliz gözlenirse, daha ileri analizler için numuneyi atın. (Şekil 5). Hemolizi değerlendirmek için Tartışma'daki sorun giderme bölümüne bakın.
6. Plazmayı RT'de (15 °C-25 °C) 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde 3.000 (±150) x g'de 10-20 dakika boyunca santrifüj yapın. İlk santrifüjleme adımından taşınan artık sağlam kan hücrelerini çıkarmak için bu adımı uygulayın.
7. Santrifüjlemeden sonra, tüpü santrifüjden dikkatlice çıkarın ve tek kullanımlık bir serolojik pipet (veya tek kullanımlık ampul pipeti veya filtre uçlu p1000 pipetler) kullanarak 1-4 mL plazmayı 1-4 mL polipropilen kriyojenik şişelere aktarın. Plazmanın kan hücreleri ile kirlenmesini önlemek için tüpün dibinde artık plazma hacmi (yaklaşık 0.3 mL veya 7 mm yükseklikte) bırakılmalıdır (Şekil 5).
8. Plazmayı hemen saklama kutusunda -80 °C'de dik olarak dondurun ve numune depolama süresini kaydedin. Numunelerin gerekli 4 saatlik zaman dilimi içinde işlendiğini doğrulayın.
9. Bir P1000 ve filtrelenmiş uç kullanarak hücresel tabakayı (kabarık kaplama) toplayın ve 2 mL'lik bir tüpe aktarın. Hemen dondurun ve -80 °C'de saklayın.

Sonuçlar

Antikoagülan olmadan kan tüplerinin santrifüjlenmesinden sonra, üst faz soluk sarı renkte görünür ve serum fraksiyonuna karşılık gelir (Şekil 2). Bu fraksiyon dikkatlice çıkarılır ve sonraki analizler için aliquoted edilir.

Hemoliz, plazma veya serum fraksiyonunda mevcut olabilir ve üst faz, hemolizin varlığını ve derecesini gösteren kırmızımsı bir görünüme sahip olacaktır (Şekil 3).

Tartışmalar

Sıvı biyopsi, kanser yönetimi sırasında farklı zamanlarda çok sayıda potansiyel uygulamaya sahiptir. İlk olarak, tanıda, klinik olarak daha fazla araştırılabilecek potansiyel bir tümör lezyonunun varlığını düşündürecek tümör moleküler belirteçlerini tanımlamak. İkincisi, hastalığın gerçek zamanlı izlenmesi için tedavi sırasında, tedavi moleküler yanıtının değerlendirilmesi, klonal evrim ve hastalık nükslerinin veya tedavi direncinin erken tespiti. Son olarak, cerrahi tedaviden ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 120.086	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010010	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367525	These tubes can be used for plasma collection
15 mL polypropylene centrifuge tubes	BIOFIL	CFT411150	Any standard tubes/equipment can be used
3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	368965	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing	Corning	430662	Any standard tubes/equipment can be used
4 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367864	These tubes can be used for plasma collection
4200 TapeStation System	Agilent	G2991BA	Several quantification methods are available with a  specific application for cfDNA
5 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010005	Any standard tubes/equipment can be used
8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	366468	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor	Thermo Fisher Scientific	Sorvall ST 16  10688725	Any standard tubes/equipment can be used
Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials	Corning	431120	These boxes are needed when using 4 mL vials for storage
p1000 pipette tips	CORNING	4809	Any standard tubes/equipment can be used
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit	Qiagen	55114	Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.
Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL	Streck	218997	These tubes can be used for plasma collection
Temperature Freezer (-80 °C)	ESCO	2180104	Any standard tubes/equipment can be used