Un protocole préanalytique normalisé de biopsie liquide pour les applications d’ADN libre circulant en aval

Résumé

La biopsie liquide a révolutionné notre approche des études translationnelles en oncologie, la collecte, la qualité et le stockage des échantillons étant des étapes cruciales pour son application clinique réussie. Nous décrivons ici un protocole standardisé et validé pour les applications d’ADN libre circulant en aval qui peut être appliqué dans la plupart des laboratoires de recherche translationnelle.

Résumé

Le terme biopsie liquide (LB) fait référence à des molécules telles que les protéines, l’ADN, l’ARN, les cellules ou les vésicules extracellulaires dans le sang et d’autres fluides corporels qui proviennent de la tumeur primaire et / ou métastatique. LB est devenu un pilier de la recherche translationnelle et a commencé à faire partie de la pratique clinique en oncologie, offrant une alternative mini-invasive à la biopsie solide. Le LB permet la surveillance en temps réel d’une tumeur via une extraction d’échantillon mini-invasive, comme le sang. Les applications comprennent la détection précoce du cancer, le suivi des patients pour la détection de la progression de la maladie, l’évaluation de la maladie résiduelle minimale et l’identification potentielle de la progression moléculaire et du mécanisme de résistance. Afin d’obtenir une analyse fiable de ces échantillons qui peut être rapportée en clinique, les procédures préanalytiques doivent être soigneusement examinées et strictement suivies. La collecte, la qualité et le stockage des échantillons sont des étapes cruciales qui déterminent leur utilité dans les applications en aval. Nous présentons ici des protocoles standardisés de notre module de travail de biopsie liquide pour la collecte, le traitement et le stockage d’échantillons de plasma et de sérum pour l’analyse de biopsie liquide en aval basée sur de l’ADN sans circulation. Les protocoles présentés ici nécessitent un équipement standard et sont suffisamment flexibles pour être appliqués dans la plupart des laboratoires axés sur les procédures biologiques.

Introduction

Le terme « biopsie liquide » a été défini en 2010¹ comme la présence de molécules (p. ex. protéines, acide désoxyribonucléique (ADN), acide ribonucléique (ARN)), de cellules ou de vésicules extracellulaires (p. ex., exosomes) dans le sang et d’autres fluides corporels qui proviennent de la tumeur primaire. L’utilisation d’échantillons de biopsie liquide a révolutionné la recherche translationnelle en oncologie, car les biopsies tissulaires, limitées à une région particulière à un moment donné, peuvent manquer des clones pertinents en raison de l’hétérogénéité tumorale. En outre, la biopsie liquide joue un rôle important dans les types de tumeurs où le tissu primaire est rare ou inaccessible, car elle peut éviter une biopsie invasive, réduisant ainsi les coûts et les risques pour les patients. En outre, les caractéristiques moléculaires de la tumeur évoluent constamment principalement en raison de la pression thérapeutique, et les échantillons de biopsie liquide peuvent capturer la dynamique clonale de la tumeur car ils peuvent être prélevés longitudinalement, à différents moments cliniques et thérapeutiques de la maladie tels que la ligne de base, le traitement, la meilleure réponse et à la progression de la maladie ou même avant. Le concept de « biopsie liquide en temps réel » signifie que les changements dynamiques dans la tumeur peuvent être surveillés en temps réel, permettant ainsi une médecine de précision dans cette maladie. La biopsie liquide a de nombreuses applications potentielles en clinique, notamment le dépistage et la détection précoce du cancer, la surveillance en temps réel de la maladie, la détection de la maladie résiduelle minimale, l’étude des mécanismes de résistance au traitement et la stratification des patients au niveau thérapeutique¹. La détection précoce de la récurrence et de la progression de la maladie est un besoin clinique non satisfait dans de nombreux types de tumeurs et est un facteur clé dans l’augmentation de la survie et de la qualité de vie des patients atteints de cancer. Les modalités d’imagerie de routine et les marqueurs tumoraux solubles peuvent manquer de la sensibilité et / ou de la spécificité requises pour cette tâche. Ainsi, de nouveaux marqueurs prédictifs sont nécessaires de toute urgence en clinique, tels que ceux basés sur les acides nucléiques libres circulants.

Les types d’échantillons utilisés pour les études de biopsie liquide comprennent, sans toutefois s’y limiter, des échantillons de sang, d’urine, de salive et de selles. D’autres échantillons spécifiques à la tumeur peuvent être des aspirateurs cellulaires, du liquide céphalo-rachidien, du liquide pleural, du liquide kystique et ascite, des expectorations et du suc pancréatique². Les premiers liquides peuvent contenir différents types de matériaux dérivés du cancer, des cellules tumorales circulantes (CTC) ou des fragments tels que des exosomes et de l’ADN tumoral circulant sans cellules (ADNct). Les acides nucléiques peuvent être encapsulés dans des vésicules extracellulaires (VE) ou libérés dans les fluides corporels en raison de la mort cellulaire et des dommages. L’ADN libre circulant (cfDNA) est principalement libéré dans la circulation sanguine par les cellules apoptotiques ou nécrotiques et est présent chez tous les individus, montrant des niveaux accrus dans les maladies inflammatoires ou oncologiques³. Les exosomes sont de petites vésicules extracellulaires (~30-150 nm) sécrétées par des cellules contenant des acides nucléiques, des protéines et des lipides. Ces vésicules font partie du réseau de communication intercellulaire et se trouvent couramment dans de nombreux types de fluides corporels². Les acides nucléiques enfermés à l’intérieur des VE sont protégés de l’environnement hostile dans les fluides corporels, offrant ainsi un moyen plus robuste d’étudier ces molécules dans le cadre de la biopsie liquide.

Dans l’ensemble, les niveaux d’acides nucléiques circulants dans les échantillons de biopsie liquide sont très faibles et, par conséquent, des méthodes sensibles sont nécessaires pour la détection, telles que la PCR numérique ou le séquençage de nouvelle génération (NGS). La gestion préanalytique de l’échantillon est cruciale pour prévenir la lyse des cellules sanguines et la libération d’ADN intact, provoquant une contamination de l’ADNf par l’ADN génomique. En outre, des précautions doivent être prises lors de l’extraction des échantillons pour éviter la présence d’inhibiteurs des méthodes d’analyse à base d’enzymes.

Nous présentons ici une méthode standardisée pour la collecte et le stockage d’échantillons de plasma et de sérum, qui est une première étape cruciale pour les applications en aval basées sur la biopsie liquide, y compris les analyses d’acides nucléiques circulants.

Protocole

Une approbation éthique préalable a été obtenue auprès des centres participants avant l’extraction des échantillons de sang. Les protocoles suivants pour l’isolement du sérum et du plasma ont été réalisés conformément aux principes éthiques de la recherche biomédicale.

REMARQUE: Les considérations préalables avant de commencer le protocole sont fournies ici. Une approbation éthique préalable est requise pour l’utilisation d’échantillons humains dans la recherche biomédicale, avec le consentement éclairé correspondant. Une armoire de biosécurité de classe II est nécessaire pour traiter les échantillons de sang. Une blouse de laboratoire, des gants de protection et des lunettes doivent être portés tout au long de la procédure pour éviter l’infection par des agents pathogènes transmissibles par le sang. Un minimum de 30 min est requis pour le traitement des échantillons de sérum. Après extraction du sang dans des tubes sans anticoagulant, maintenir à température ambiante (RT) pendant 30-45 min pour permettre la formation de caillots. Un minimum de 40 minutes est requis pour la préparation du plasma, et les échantillons doivent être traités dans les 4 h suivant le moment de l’extraction lors de l’utilisation de tubes d’acide éthylènediamine tétra-acétique (EDTA) ou dans les 24 à 48 heures si vous utilisez des tubes de prélèvement stabilisateurs cellulaires ou des tubes de prélèvement d’ADN spécifiques sans cellules. Cependant, selon certains fabricants, les échantillons sont stables jusqu’à 2 semaines dans ces tubes spécialisés. Il est important de vérifier l’hémolyse, qui donnera au plasma ou à la fraction sérique un aspect rougeâtre. Consultez la section de dépannage pour les exemples hémolysés dans la discussion.

1. Préparation du sérum pour les études de biopsie liquide

REMARQUE : Le temps total requis pour effectuer cette étape est de 30 min (Figure 1).

1. Extraire 4-10 mL de sang dans des tubes ne contenant pas d’anticoagulant (capuchon rouge ou rouge/gris-noir) et maintenir à TA pendant 30-45 min. Traiter ces échantillons dans les 4 heures suivant l’extraction.
2. Consignez l’heure et la date de l’extraction de l’échantillon et l’identification du sujet (ID) dans une base de données d’échantillons conçue de manière appropriée.
3. En portant une blouse de laboratoire, des gants de protection et des lunettes, centrifuger le tube contenant du sang frais à RT (15 °C-25 °C) pendant 10 min à 1 600 (± 150) x g, avec la pause maximale appliquée.
4. Après centrifugation, retirer soigneusement le tube de la centrifugeuse; la phase supérieure du surnageant sérique apparaîtra claire et jaunâtre (Figure 2). Vérifiez si l’échantillon présente des signes d’hémolyse (Figure 3) et notez la présence d’hémolyse le cas échéant.
5. Dans une armoire de biosécurité de classe II, transférer le sérum dans des tubes de collecte sous forme d’aliquotes de 250 μL.
   REMARQUE : Le volume des aliquotes doit être ajusté aux exigences de l’étude.
6. Congelez immédiatement le sérum à la verticale dans une boîte de stockage à -80 °C et enregistrez le temps de stockage de l’échantillon.
7. Vérifier que les échantillons ont été traités dans les 4 heures requises.

2. Préparation plasmatique pour les études de biopsie liquide

REMARQUE : Le temps total requis pour effectuer cette étape est de 40 min (Figure 4).

1. Extraire 4 à 10 mL de sang dans des tubes contenant de l’acide éthylènediamine tétra-acétique (EDTA). Traiter les échantillons dans les 4 heures suivant l’extraction.
2. Enregistrez l’heure et la date de l’extraction de l’échantillon et l’ID du sujet dans une base de données d’échantillons conçue de manière appropriée.
3. En portant une blouse de laboratoire, des gants de protection et des lunettes, centrifugez le tube EDTA à RT (15 °C-25 °C) pendant 10 min à 1 600 (± 150) x g, avec la pause maximale appliquée.
   REMARQUE: Reportez-vous aux instructions du fabricant lorsque vous utilisez d’autres tubes de collecte.
4. Après centrifugation, le surnageant plasmatique apparaîtra clair et jaunâtre. Vérifiez si l’échantillon présente des signes d’hémolyse (Figure 3) et transférez le plasma (surnageant) dans un tube centrifuge de 15 mL sans perturber la couche cellulaire à l’aide d’une pipette sérologique jetable (ou d’une pipette à bulbe jetable ou de pipettes p1000 avec embout de filtre). Laissez un petit volume résiduel de plasma au-dessus de la couche cellulaire (environ 5 mm).
5. Si une hémolyse est observée, jeter l’échantillon pour d’autres analyses. (Figure 5). Consultez la section de dépannage de la discussion pour évaluer l’hémolyse.
6. Centrifuger le plasma dans un tube de centrifugeuse de 15 mL à RT (15 °C-25 °C) pendant 10-20 min à 3 000 (±150) x g. Effectuez cette étape pour éliminer toutes les cellules sanguines intactes résiduelles reportées de la première étape de centrifugation.
7. Après centrifugation, retirez soigneusement le tube de la centrifugeuse et transférez 1 à 4 mL de plasma dans des flacons cryogéniques en polypropylène de 1 à 4 mL à l’aide d’une pipette sérologique jetable (ou d’une pipette à bulbe jetable ou de pipettes p1000 avec embout filtrant). Un volume résiduel de plasma (environ 0,3 mL ou 7 mm de hauteur) doit être laissé au fond du tube pour éviter de contaminer le plasma avec des cellules sanguines (figure 5).
8. Congelez immédiatement le plasma à la verticale dans la boîte de stockage à -80 °C et enregistrez le temps de stockage de l’échantillon. Vérifier que les échantillons ont été traités dans les 4 heures requises.
9. Recueillir la couche cellulaire (buffy coat) à l’aide d’une pointe P1000 et filtrée et la transférer dans un tube de 2 mL. Congeler et conserver immédiatement à -80 °C.

Résultats

Après centrifugation des tubes sanguins sans anticoagulant, la phase supérieure apparaît jaune pâle et correspond à la fraction sérique (Figure 2). Cette fraction est soigneusement enlevée et alicitée pour une analyse ultérieure.

L’hémolyse peut être présente dans la fraction plasmatique ou sérique, et la phase supérieure aura un aspect rougeâtre, ce qui indique la présence et le degré d’hémolyse (Figure 3).

...

Discussion

La biopsie liquide a de nombreuses applications potentielles à différents moments de la prise en charge du cancer. Tout d’abord, au moment du diagnostic, identifier les marqueurs moléculaires tumoraux qui suggéreraient la présence d’une lésion tumorale potentielle qui pourrait faire l’objet d’une étude clinique plus approfondie. Deuxièmement, pendant le traitement pour la surveillance en temps réel de la maladie, l’évaluation de la réponse moléculaire du traitement, l’évolution clonale et la dét...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 120.086	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010010	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367525	These tubes can be used for plasma collection
15 mL polypropylene centrifuge tubes	BIOFIL	CFT411150	Any standard tubes/equipment can be used
3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	368965	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing	Corning	430662	Any standard tubes/equipment can be used
4 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367864	These tubes can be used for plasma collection
4200 TapeStation System	Agilent	G2991BA	Several quantification methods are available with a  specific application for cfDNA
5 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010005	Any standard tubes/equipment can be used
8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	366468	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor	Thermo Fisher Scientific	Sorvall ST 16  10688725	Any standard tubes/equipment can be used
Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials	Corning	431120	These boxes are needed when using 4 mL vials for storage
p1000 pipette tips	CORNING	4809	Any standard tubes/equipment can be used
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit	Qiagen	55114	Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.
Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL	Streck	218997	These tubes can be used for plasma collection
Temperature Freezer (-80 °C)	ESCO	2180104	Any standard tubes/equipment can be used