Ein standardisiertes präanalytisches Flüssigbiopsieprotokoll für nachgeschaltete zirkulatorfreie DNA-Anwendungen

Zusammenfassung

Die Flüssigbiopsie hat unseren Ansatz für translationale Onkologiestudien revolutioniert, wobei die Probenentnahme, -qualität und -lagerung entscheidende Schritte für ihre erfolgreiche klinische Anwendung sind. Hier beschreiben wir ein standardisiertes und validiertes Protokoll für nachgelagerte zirkulatorfreie DNA-Anwendungen, das in den meisten translationalen Forschungslabors angewendet werden kann.

Zusammenfassung

Der Begriff Liquid Biopsy (LB) bezieht sich auf Moleküle wie Proteine, DNA, RNA, Zellen oder extrazelluläre Vesikel im Blut und anderen Körperflüssigkeiten, die aus dem Primär- und / oder metastasierenden Tumor stammen. LB hat sich zu einer tragenden Säule in der translationalen Forschung entwickelt und hat begonnen, Teil der klinischen Onkologiepraxis zu werden, die eine minimal-invasive Alternative zur soliden Biopsie bietet. Das LB ermöglicht die Echtzeitüberwachung eines Tumors über eine minimal-invasive Probenextraktion, wie z.B. Blut. Die Anwendungen umfassen die Krebsfrüherkennung, die Nachsorge von Patienten zur Erkennung des Krankheitsverlaufs, die Beurteilung der minimalen Resterkrankung und die mögliche Identifizierung der molekularen Progression und des Resistenzmechanismus. Um eine zuverlässige Analyse dieser Proben zu erreichen, die in der Klinik gemeldet werden kann, sollten die präanalytischen Verfahren sorgfältig abgewogen und strikt befolgt werden. Probensammlung, -qualität und -speicherung sind entscheidende Schritte, die ihre Nützlichkeit in nachgelagerten Anwendungen bestimmen. Hier stellen wir standardisierte Protokolle aus unserem Flüssigbiopsie-Arbeitsmodul zur Entnahme, Verarbeitung und Lagerung von Plasma- und Serumproben für die nachgeschaltete Flüssigbiopsieanalyse auf Basis zirkulierender DNA vor. Die hier vorgestellten Protokolle erfordern eine Standardausrüstung und sind flexibel genug, um in den meisten Laboratorien, die sich auf biologische Verfahren konzentrieren, angewendet zu werden.

Einleitung

Der Begriff "Flüssigbiopsie" wurde 2010¹ als das Vorhandensein von Molekülen (z. B. Protein, Desoxyribonukleinsäure (DNA), Ribonukleinsäure (RNA)), Zellen oder extrazellulären Vesikeln (z. B. Exosomen) im Blut und anderen Körperflüssigkeiten definiert, die aus dem Primärtumor stammen. Die Verwendung von Flüssigbiopsieproben hat die translationale onkologische Forschung revolutioniert, da Gewebebiopsien, die zu einem bestimmten Zeitpunkt auf eine bestimmte Region beschränkt sind, aufgrund der Tumorheterogenität relevante Klone übersehen können. Darüber hinaus spielt die Flüssigbiopsie eine relevante Rolle bei Tumorarten, bei denen Primärgewebe knapp oder nicht zugänglich ist, da sie eine invasive Biopsie vermeiden kann, wodurch Kosten und Risiken für Patienten reduziert werden. Darüber hinaus entwickeln sich die molekularen Eigenschaften des Tumors hauptsächlich aufgrund des Therapiedrucks ständig weiter, und Flüssigbiopsieproben können die klonale Dynamik des Tumors erfassen, da sie longitudinal, in verschiedenen klinischen und therapeutischen Zeiten der Krankheit wie Ausgangswert, bei der Behandlung, beim besten Ansprechen und beim Fortschreiten der Krankheit oder sogar davor entnommen werden können. Das Konzept der "Echtzeit-Flüssigbiopsie" bedeutet, dass dynamische Veränderungen im Tumor in Echtzeit überwacht werden können, was eine Präzisionsmedizin bei dieser Krankheit ermöglicht. Die Flüssigbiopsie hat zahlreiche potenzielle Anwendungen in der Klinik, darunter Screening und Früherkennung von Krebs, Echtzeitüberwachung von Krankheiten, Erkennung von minimalen Resterkrankungen, Untersuchung von Mechanismen zur Behandlungsresistenz und Stratifizierung von Patienten auf der therapeutischen Ebene¹. Die Früherkennung von Krankheitsrezidiven und -progression ist bei vielen Tumorarten ein ungedeckter klinischer Bedarf und ein Schlüsselfaktor für die Steigerung des Überlebens und der Lebensqualität von Krebspatienten. Routinemäßigen Bildgebungsmodalitäten und löslichen Tumormarkern fehlt möglicherweise die für diese Aufgabe erforderliche Sensitivität und / oder Spezifität. Daher werden in der Klinik dringend neuartige prädiktive Marker benötigt, etwa auf Basis zirkulierender freier Nukleinsäuren.

Die Arten von Proben, die für Flüssigbiopsiestudien verwendet werden, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Blut-, Urin-, Speichel- und Stuhlproben. Andere tumorspezifische Proben können Zellaspirate, Zerebrospinalflüssigkeit, Pleuraflüssigkeit, Zysten- und Aszitesflüssigkeit, Sputum und Pankreassaft² sein. Die ehemaligen Flüssigkeiten können verschiedene Arten von krebsabgeleiteten Materialien, zirkulierende Tumorzellen (CTC) oder Fragmente wie Exosomen und zellfreie zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA) enthalten. Nukleinsäuren können in extrazellulären Vesikeln (EVs) verkapselt oder aufgrund von Zelltod und -schäden in Körperflüssigkeiten freigesetzt werden. Zirkulierende freie DNA (cfDNA) wird hauptsächlich aus apoptotischen oder nekrotischen Zellen in den Blutkreislauf freigesetzt und ist bei allen Individuen vorhanden, wobei sie bei entzündlichen oder onkologischen Erkrankungen erhöhte Spiegel aufweist³. Exosomen sind kleine extrazelluläre Vesikel (~ 30-150 nm), die von Zellen mit Nukleinsäuren, Proteinen und Lipiden sezerniert werden. Diese Vesikel sind Teil des interzellulären Kommunikationsnetzwerks und kommen häufig in vielen Arten von Körperflüssigkeiten^{vor 2}. Die Nukleinsäuren, die in EVs eingeschlossen sind, sind vor der rauen Umgebung in Körperflüssigkeiten geschützt und bieten somit eine robustere Möglichkeit, diese Moleküle in der Flüssigbiopsieumgebung zu untersuchen.

Insgesamt sind die Konzentrationen zirkulierender Nukleinsäuren in Flüssigbiopsieproben sehr niedrig, weshalb für den Nachweis empfindliche Methoden wie digitale PCR oder Next-Generation-Sequencing (NGS) erforderlich sind. Das präanalytische Management der Probe ist entscheidend, um die Blutzelllyse und die Freisetzung intakter DNA zu verhindern, was zu einer Kontamination der cfDNA mit der genomischen DNA führt. Darüber hinaus ist bei der Probenentnahme darauf zu achten, dass Inhibitoren enzymbasierter Analysemethoden nicht vorhanden sind.

Hier stellen wir eine standardisierte Methode zur Entnahme und Lagerung von Plasma- und Serumproben vor, die ein entscheidender erster Schritt für flüssigbiopsiebasierte Downstream-Anwendungen einschließlich zirkulierender Nukleinsäureanalysen ist.

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Protokoll

Die vorherige ethische Genehmigung wurde von den teilnehmenden Zentren vor der Entnahme von Blutproben eingeholt. Die folgenden Protokolle zur Serum- und Plasmaisolierung wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Grundsätzen für die biomedizinische Forschung durchgeführt.

HINWEIS: Vorherige Überlegungen vor Beginn des Protokolls finden Sie hier. Für die Verwendung menschlicher Proben in der biomedizinischen Forschung ist eine vorherige ethische Genehmigung mit der entsprechenden Einverständniserklärung erforderlich. Für die Handhabung von Blutproben ist eine Biosicherheitskabine der Klasse II erforderlich. Ein Laborkittel, Schutzhandschuhe und eine Brille sollten während des gesamten Verfahrens getragen werden, um eine Infektion durch durch Blut übertragene Krankheitserreger zu vermeiden. Für die Verarbeitung von Serumproben sind mindestens 30 min erforderlich. Nach der Blutextraktion in Röhrchen ohne Antikoagulans 30-45 min bei Raumtemperatur (RT) halten, um die Bildung von Gerinnseln zu ermöglichen. Für die Plasmapräparation sind mindestens 40 min erforderlich, und die Proben sollten innerhalb von 4 Stunden ab dem Zeitpunkt der Extraktion verarbeitet werden, wenn Ethylendiamin-Tetraessigsäureröhrchen (EDTA) verwendet werden, oder innerhalb von 24-48 Stunden, wenn zellstabilisierende Entnahmeröhrchen oder spezifische zellfreie DNA-Entnahmeröhrchen verwendet werden. Nach Angaben einiger Hersteller sind die Proben in diesen Spezialröhrchen jedoch bis zu 2 Wochen haltbar. Es ist wichtig, auf Hämolyse zu prüfen, die der Plasma- oder Serumfraktion ein rötliches Aussehen verleiht. Informationen zu hämolysierten Beispielen in der Diskussion finden Sie im Abschnitt zur Fehlerbehebung.

1. Serumpräparation für Flüssigbiopsiestudien

HINWEIS: Die Gesamtzeit für diesen Schritt beträgt 30 Minuten (Abbildung 1).

1. Extrahieren Sie 4-10 ml Blut in Röhrchen, die kein Antikoagulans enthalten (rote oder rote/grau-schwarze Kappe) und halten Sie sie bei RT für 30-45 min. Verarbeiten Sie diese Proben innerhalb von 4 Stunden ab dem Zeitpunkt der Entnahme.
2. Erfassen Sie Uhrzeit und Datum der Probenextraktion und der Subjektidentifikation (ID) in einer entsprechend gestalteten Probendatenbank.
3. Mit einem Laborkittel, Schutzhandschuhen und einer Brille zentrifugieren Sie das Röhrchen mit frischem Blut bei RT (15 °C-25 °C) für 10 min bei 1.600 (± 150) x g, wobei die maximale Pause angewendet wird.
4. Nach der Zentrifugation das Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge entfernen; Die obere Phase des Serumüberstands erscheint klar und gelblich (Abbildung 2). Überprüfen Sie, ob die Probe Anzeichen einer Hämolyse aufweist (Abbildung 3), und zeichnen Sie gegebenenfalls das Vorhandensein einer Hämolyse auf.
5. In einer Biosicherheitskabine der Klasse II wird das Serum als 250-μL-Aliquots in Auffangröhrchen überführt.
   HINWEIS: Das Volumen der Aliquots muss an die Studienanforderungen angepasst werden.
6. Das Serum sofort aufrecht in einer Lagerbox bei -80 °C einfrieren und die Zeit der Probenlagerung aufzeichnen.
7. Stellen Sie sicher, dass die Proben innerhalb des erforderlichen Zeitrahmens von 4 Stunden verarbeitet wurden.

2. Plasmapräparation für Flüssigbiopsiestudien

HINWEIS: Die Gesamtzeit für die Ausführung dieses Schritts beträgt 40 Minuten (Abbildung 4).

1. Extrahieren Sie 4-10 ml Blut in Röhrchen, die Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthalten. Verarbeiten Sie die Proben innerhalb von 4 Stunden ab dem Zeitpunkt der Entnahme.
2. Notieren Sie Uhrzeit und Datum der Probenextraktion und die Betreff-ID in einer entsprechend gestalteten Beispieldatenbank.
3. Mit einem Laborkittel, Schutzhandschuhen und einer Brille zentrifugieren Sie das EDTA-Röhrchen bei RT (15 °C-25 °C) für 10 min bei 1.600 (± 150) x g, wobei die maximale Pause angewendet wird.
   HINWEIS: Beachten Sie die Anweisungen des Herstellers, wenn Sie andere Auffangrohre verwenden.
4. Nach der Zentrifugation erscheint der Plasmaüberstand klar und gelblich. Prüfen Sie, ob die Probe Anzeichen einer Hämolyse aufweist (Abbildung 3) und übertragen Sie das Plasma (Überstand) mit einer serologischen Einwegpipette (oder Einweg-Bulbpipette oder p1000-Pipetten mit Filterspitze) in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen, ohne die Zellschicht zu stören. Lassen Sie ein kleines Restvolumen des Plasmas über der Zellschicht (ca. 5 mm).
5. Wenn eine Hämolyse beobachtet wird, verwerfen Sie die Probe für weitere Analysen. (Abbildung 5). Lesen Sie den Abschnitt zur Fehlerbehebung in der Diskussion, um Hämolyse zu beurteilen.
6. Zentrifugieren Sie das Plasma in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen bei RT (15 °C-25 °C) für 10-20 min bei 3.000 (±150) x g. Führen Sie diesen Schritt durch, um alle verbleibenden intakten Blutzellen zu entfernen, die aus dem ersten Zentrifugationsschritt übernommen wurden.
7. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig das Röhrchen aus der Zentrifuge und geben Sie 1-4 ml Plasma mit einer serologischen Einwegpipette (oder Einweg-Birnenpipette oder p1000-Pipetten mit Filterspitze) auf 1-4 ml kryogene Polypropylen-Durchstechflaschen ab. Ein Restvolumen des Plasmas (ca. 0,3 ml oder 7 mm Höhe) muss am Boden des Röhrchens belassen werden, um eine Kontamination des Plasmas mit Blutzellen zu vermeiden (Abbildung 5).
8. Sofort das Plasma aufrecht in der Lagerbox bei -80 °C einfrieren und die Zeit der Probenlagerung aufzeichnen. Stellen Sie sicher, dass die Proben innerhalb des erforderlichen Zeitrahmens von 4 Stunden verarbeitet wurden.
9. Sammeln Sie die Zellschicht (Buffy Coat) mit einem P1000 und einer gefilterten Spitze und übertragen Sie sie in eine 2-ml-Röhre. Sofort einfrieren und bei -80 °C lagern.

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Ergebnisse

Nach Zentrifugation der Blutröhrchen ohne Antikoagulans erscheint die obere Phase blassgelb und entspricht der Serumfraktion (Abbildung 2). Dieser Bruchteil wird sorgfältig entfernt und zur späteren Analyse aliquotiert.

Hämolyse kann entweder in der Plasma- oder Serumfraktion vorhanden sein, und die obere Phase hat ein rötliches Aussehen, was auf das Vorhandensein und den Grad der Hämolyse hinweist (Abbildung 3).

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Diskussion

Die Flüssigbiopsie hat zahlreiche potenzielle Anwendungen zu verschiedenen Zeiten während der Behandlung von Krebs. Erstens, bei der Diagnose, um molekulare Marker des Tumors zu identifizieren, die auf das Vorhandensein einer potenziellen Tumorläsion hindeuten würden, die klinisch weiter untersucht werden könnte. Zweitens während der Behandlung zur Echtzeitüberwachung der Krankheit, zur Beurteilung der molekularen Reaktion der Behandlung, zur klonalen Evolution und zur Früherkennung von Krankheitsrückfällen ode...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 120.086	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010010	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367525	These tubes can be used for plasma collection
15 mL polypropylene centrifuge tubes	BIOFIL	CFT411150	Any standard tubes/equipment can be used
3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	368965	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing	Corning	430662	Any standard tubes/equipment can be used
4 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367864	These tubes can be used for plasma collection
4200 TapeStation System	Agilent	G2991BA	Several quantification methods are available with a  specific application for cfDNA
5 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010005	Any standard tubes/equipment can be used
8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	366468	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor	Thermo Fisher Scientific	Sorvall ST 16  10688725	Any standard tubes/equipment can be used
Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials	Corning	431120	These boxes are needed when using 4 mL vials for storage
p1000 pipette tips	CORNING	4809	Any standard tubes/equipment can be used
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit	Qiagen	55114	Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.
Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL	Streck	218997	These tubes can be used for plasma collection
Temperature Freezer (-80 °C)	ESCO	2180104	Any standard tubes/equipment can be used