用于下游无循环DNA应用的标准化液体活检前分析方案

摘要

液体活检彻底改变了我们的肿瘤学转化研究方法，样本收集、质量和储存是其成功临床应用的关键步骤。在这里，我们描述了一种标准化且经过验证的下游无循环DNA应用的方案，该协议可应用于大多数转化研究实验室。

摘要

术语液体活检（LB）是指来自原发性和/或转移性肿瘤的血液和其他体液中的蛋白质，DNA，RNA，细胞或细胞外囊泡等分子。LB已成为转化研究的中流砥柱，并开始成为临床肿瘤学实践的一部分，为实体活检提供了一种微创的替代方案。LB允许 通过 微创样本提取（例如血液）实时监测肿瘤。这些应用包括早期癌症检测、患者随访以检测疾病进展、评估最小残留疾病以及潜在识别分子进展和耐药机制。为了对这些可以在临床上报告的样品进行可靠的分析，应仔细考虑并严格遵守分析前程序。样品收集、质量和储存是确定其在下游应用中的有用性的关键步骤。在这里，我们介绍了液活检工作模块的标准化方案，用于收集、处理和储存血浆和血清样本，以便基于无循环DNA进行下游液体活检分析。这里介绍的协议需要标准设备，并且足够灵活，可以应用于大多数专注于生物程序的实验室。

引言

术语"液体活检"在2010年^被定义为 起源于原发肿瘤的血液和其他体液中存在分子（例如蛋白质，脱氧核糖核酸（DNA），核糖核酸（RNA）），细胞或细胞外囊泡（例如外泌体）。液体活检样本的使用彻底改变了转化肿瘤学研究，因为组织活检仅限于特定时刻的特定区域，由于肿瘤异质性，可能会错过相关的克隆。此外，液体活检在原发组织稀缺或无法获得的肿瘤类型中起着相关作用，因为它可以避免侵入性活检，从而降低患者的成本和风险。此外，肿瘤分子特征的不断发展主要是由于治疗压力，液体活检样品可以捕获肿瘤克隆动力学，因为它们可以纵向，在疾病的不同临床和治疗时间，如基线，治疗，最佳反应，疾病进展甚至之前。"实时液体活检"的概念意味着可以实时监测肿瘤的动态变化，从而允许对这种疾病进行精准医疗。液体活检在临床上具有许多潜在的应用，包括癌症的筛查和早期检测，疾病的实时监测，最小残留疾病的检测，治疗耐药性的研究机制以及治疗水平¹的患者分层。在许多肿瘤类型中，早期发现疾病复发和进展是未满足的临床需求，是提高癌症患者生存率和生活质量的关键因素。常规成像方式和可溶性肿瘤标志物可能缺乏该任务所需的敏感性和/或特异性。因此，临床上迫切需要新的预测标志物，例如基于循环游离核酸的靶标物。

用于液体活检研究的样本类型包括但不限于血液、尿液、唾液和粪便样本。其他肿瘤特异性样本可以是细胞抽吸物、脑脊液、胸腔积液、囊肿和腹水液、痰液和胰液².前一种液体可能含有不同类型的癌症衍生物质，循环肿瘤细胞（CTC），或片段，例如外泌体和无细胞循环肿瘤DNA（ctDNA）。核酸可能被包封在细胞外囊泡（EV）中，或由于细胞死亡和损伤而释放到体液中。循环游离DNA（cfDNA）主要从凋亡或坏死细胞释放到血液中，并且存在于所有个体中，在炎症或肿瘤疾病中显示水平升高³。外泌体是由含有核酸，蛋白质和脂质的细胞分泌的小细胞外囊泡（~30-150nm）。这些囊泡构成细胞间通信网络的一部分，常见于许多类型的体液^{中 2}.封闭在EV内的核酸受到保护，免受体液中恶劣环境的影响，从而为在液体活检环境中研究这些分子提供了更强大的方法。

总体而言，液体活检样品中循环核酸的水平非常低，因此需要灵敏的检测方法，例如数字PCR或下一代测序（NGS）。样品的分析前管理对于防止血细胞裂解和完整DNA的释放至关重要，从而导致cfDNA被基因组DNA污染。此外，在提取样品时必须小心，以避免存在基于酶的分析方法的抑制剂。

在这里，我们提出了一种用于收集和储存血浆和血清样品的标准化方法，这是基于液体活检的下游应用（包括循环核酸分析）的关键第一步。

研究方案

在提取血液样本之前，事先从参与中心获得伦理批准。以下血清和血浆分离方案是根据生物医学研究的伦理原则进行的。

注意:此处提供了开始协议之前的注意事项。在生物医学研究中使用人类样本需要事先获得伦理批准，并征得相应的知情同意。需要一个II类生物安全柜来处理血液样本。在整个手术过程中应穿戴实验室外套、防护手套和眼镜，以避免被血源性病原体感染。处理血清样品至少需要30分钟。在没有抗凝剂的管中提取血液后，在室温（RT）下保持30-45分钟以允许凝块形成。血浆制备至少需要40分钟，当使用乙二胺四乙酸（EDTA）管时，样品应在提取时间起4小时内处理，如果使用细胞稳定收集管或特定的无细胞DNA收集管，则应在24-48小时内处理。然而，根据一些制造商的说法，样品在这些专用管中稳定长达2周。检查溶血很重要，这将使血浆或血清部分呈微红色外观。请参阅讨论中有关溶血样品的故障排除部分。

1. 液体活检研究的血清制备

注:执行此步骤所需的总时间为30分钟（图1）。

1. 在不含抗凝剂（红色或红色/灰黑色帽）的试管中提取4-10mL血液，并在室温下维持30-45分钟。在提取后4小时内处理这些样品。
2. 在适当设计的样本数据库中记录样品提取的时间和日期以及受试者识别（ID）。
3. 穿着实验室外套，防护手套和眼镜，在RT（15°C-25°C）下以1，600（±150）x g离心含有新鲜血液的管子10分钟，并施加最大断裂。
4. 离心后，小心地从离心机中取出管子;血清上清液的上相将显示清澈和淡黄色（图2）。检查样品是否显示溶血迹象（图3），并在适当时记录溶血的存在。
5. 在II类生物安全柜中，将血清作为250μL等分试样转移到收集管中。
   注:等分试样的体积必须根据研究要求进行调整。
6. 立即将血清直立冷冻在-80°C的储存箱中，并记录样品储存时间。
7. 验证样品是否在所需的4小时时间范围内处理。

2. 用于液体活检研究的血浆制备

注:执行此步骤所需的总时间为40分钟（图4）。

1. 在含有乙二胺四乙酸（EDTA）的管中提取4-10 mL血液。从提取时间开始在4小时内处理样品。
2. 在适当设计的示例数据库中记录样本提取的时间和日期以及受试者ID。
3. 穿着实验室外套，防护手套和眼镜，在室温（15°C-25°C）下以1，600（±150）x g离心EDTA管10分钟，并施加最大断裂。
   注:使用其他收集管时，请参阅制造商的说明。
4. 离心后，血浆上清液将呈清澈和淡黄色。检查样品是否出现溶血迹象（图3），并使用一次性血清移液管（或一次性球形移液管或带过滤尖端的p1000移液器）将血浆（上清液剂）转移到15 mL离心管中而不会干扰细胞层。在细胞层上方留下少量残留的血浆（约5mm）。
5. 如果观察到溶血，请丢弃样品进行进一步分析。（图 5）。请参阅讨论中的故障排除部分以评估溶血。
6. 将血浆在15mL离心管中以RT（15°C-25°C）以3，000（±150）x g离心10-20分钟 。 执行此步骤以除去从第一个离心步骤中携带的任何残留的完整血细胞。
7. 离心后，小心地从离心机中取出管子，并使用一次性血清移液管（或一次性球形移液管或带过滤尖端的p1000移液器）将1-4 mL血浆转移到1-4 mL聚丙烯低温小瓶中。残留的血浆体积（约0.3mL或7mm高度）必须留在管的底部，以避免血浆被血细胞污染（图5）。
8. 立即将等离子体直立冷冻在-80°C的储存箱中，并记录样品储存的时间。验证样品是否在所需的4小时时间范围内处理。
9. 使用P1000和过滤的吸头收集细胞层（黄褐色涂层）并将其转移到2 mL管中。立即冷冻并储存在-80°C。

结果

在没有抗凝剂的情况下离心血管后，上相呈现淡黄色并对应于血清级分（图2）。该馏分被小心地除去并等分，以便随后进行分析。

溶血可能存在于血浆或血清部分，并且上相将具有红色外观，这表明溶血的存在和程度（图3）。

EDTA管离心后，几个相或层将很明显;上相（淡黄色）是血浆部分，占总血容量的55%;?...

讨论

液体活检在癌症管理的不同时间具有许多潜在的应用。首先，在诊断时识别肿瘤分子标志物，这些标记物将表明存在潜在的肿瘤病变，可以在临床上进一步研究。其次，在治疗期间对疾病进行实时监测，评估治疗分子反应、克隆进化，以及早期发现疾病复发或治疗耐药性。最后，在手术治疗后，作为检测最小残留疾病的工具。欧洲肿瘤内科学会（ESMO）最近发布了在转移性非小细胞肺癌（NSCLC）中?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 120.086	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010010	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367525	These tubes can be used for plasma collection
15 mL polypropylene centrifuge tubes	BIOFIL	CFT411150	Any standard tubes/equipment can be used
3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	368965	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing	Corning	430662	Any standard tubes/equipment can be used
4 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367864	These tubes can be used for plasma collection
4200 TapeStation System	Agilent	G2991BA	Several quantification methods are available with a  specific application for cfDNA
5 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010005	Any standard tubes/equipment can be used
8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	366468	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor	Thermo Fisher Scientific	Sorvall ST 16  10688725	Any standard tubes/equipment can be used
Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials	Corning	431120	These boxes are needed when using 4 mL vials for storage
p1000 pipette tips	CORNING	4809	Any standard tubes/equipment can be used
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit	Qiagen	55114	Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.
Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL	Streck	218997	These tubes can be used for plasma collection
Temperature Freezer (-80 °C)	ESCO	2180104	Any standard tubes/equipment can be used