פרוטוקול קדם-אנליטי של ביופסיה נוזלית סטנדרטית ליישומי דנ"א ללא מחזור במורד הזרם

Summary

הביופסיה הנוזלית חוללה מהפכה בגישה שלנו למחקרים תרגומיים אונקולוגיים, כאשר איסוף הדגימות, האיכות והאחסון היוו שלבים מכריעים ליישום הקליני המוצלח שלה. כאן אנו מתארים פרוטוקול מתוקנן ומאומת ליישומי דנ"א ללא מחזור במורד הזרם, שניתן ליישם ברוב מעבדות המחקר התרגומיות.

Abstract

המונח ביופסיה נוזלית (LB) מתייחס למולקולות כגון חלבונים, דנ"א, רנ"א, רנ"א, תאים או שלפוחיות חוץ-תאיות בדם ובנוזלי גוף אחרים שמקורם בגידול הראשוני ו/או הגרורתי. LB התגלתה כעמוד תווך במחקר תרגומי והחלה להפוך לחלק מהפרקטיקה האונקולוגית הקלינית, המספקת חלופה זעיר פולשנית לביופסיה מוצקה. ה- LB מאפשר ניטור בזמן אמת של גידול באמצעות מיצוי דגימה זעיר פולשנית, כגון דם. היישומים כוללים גילוי מוקדם של סרטן, מעקב אחר מטופלים לגילוי התקדמות המחלה, הערכה של מחלה שיורית מינימלית, וזיהוי פוטנציאלי של התקדמות מולקולרית ומנגנון עמידות. על מנת להשיג ניתוח אמין של דגימות אלה שניתן לדווח עליהן במרפאה, יש לשקול בזהירות את ההליכים הקדם-אנליטיים ולעקוב בקפדנות. איסוף דגימות, איכות ואחסון הם שלבים חיוניים שקובעים את התועלת שלהם ביישומים במורד הזרם. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים סטנדרטיים ממודול העבודה שלנו בביופסיה נוזלית לאיסוף, עיבוד ואחסון דגימות פלזמה וסרום לניתוח ביופסיה נוזלית במורד הזרם בהתבסס על דנ"א ללא מחזור הדם. הפרוטוקולים המוצגים כאן דורשים ציוד סטנדרטי והם גמישים מספיק כדי להיות מיושמים ברוב המעבדות המתמקדות בהליכים ביולוגיים.

Introduction

המונח "ביופסיה נוזלית" הוגדר בשנת 2010¹ כנוכחות של מולקולות (למשל, חלבון, חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA), חומצה ריבונוקלאית (RNA)), תאים או שלפוחיות חוץ-תאיות (למשל, אקסוזומים) בדם ובנוזלי גוף אחרים שמקורם בגידול הראשוני. השימוש בדגימות ביופסיה נוזלית חולל מהפכה במחקר האונקולוגי התרגומי, שכן ביופסיות רקמות, המוגבלות לאזור מסוים ברגע מסוים, עלולות להחמיץ שיבוטים רלוונטיים בשל הטרוגניות הגידול. בנוסף, ביופסיה נוזלית ממלאת תפקיד רלוונטי בסוגי גידולים שבהם הרקמה הראשונית נדירה או אינה נגישה, שכן היא עשויה למנוע ביופסיה פולשנית, ולהפחית עלויות וסיכון לחולים. יתר על כן, המאפיינים המולקולריים של הגידול מתפתחים ללא הרף בעיקר בשל לחץ הטיפול, ודגימות ביופסיה נוזליות יכולות ללכוד את הדינמיקה הקלונלית של הגידול כפי שניתן לקחת אותן לאורך, בזמנים קליניים וטיפוליים שונים של המחלה כגון בסיס, על הטיפול, על הטיפול, התגובה הטובה ביותר, ובהתקדמות המחלה או אפילו לפני כן. הרעיון של "ביופסיה נוזלית בזמן אמת" פירושו שניתן לעקוב אחר שינויים דינמיים בגידול בזמן אמת, ובכך לאפשר רפואה מדויקת במחלה זו. לביופסיה הנוזלית יש יישומים פוטנציאליים רבים במרפאה, כולל סינון וגילוי מוקדם של סרטן, ניטור בזמן אמת של המחלה, זיהוי מחלה שיורית מינימלית, חקר מנגנונים לעמידות לטיפול וריבוד חולים ברמה הטיפולית¹. הגילוי המוקדם של הישנות המחלה והתקדמותה הם צורך קליני שלא קיבל מענה בסוגי גידולים רבים ומהווים גורם מפתח בהגדלת ההישרדות ואיכות החיים של חולי סרטן. שיטות הדמיה שגרתיות וסמני גידול מסיסים עשויים להיות חסרים את הרגישות ו/או הספציפיות הנדרשות למשימה זו. לפיכך, יש צורך דחוף בסמני חיזוי חדשניים במרפאה, כגון אלה המבוססים על הפצת חומצות גרעין חופשיות במחזור הדם.

סוגי הדגימות המשמשות למחקרי ביופסיה נוזלית כוללים, בין היתר, דגימות דם, שתן, רוק וצואה. דגימות אחרות הספציפיות לגידול יכולות להיות שאיפות תאים, נוזל מוחי, נוזל pleural, נוזל ציסטה ומיימת, כיח ומיץ לבלב². הנוזלים הראשונים עשויים להכיל סוגים שונים של חומרים שמקורם בסרטן, תאי גידול במחזור הדם (CTC), או שברים כגון אקסוזומים ודנ"א גידולי במחזור ללא תאים (ctDNA). חומצות גרעין עשויות להיות עטופות בשלפוחיות חוץ-תאיות (רכבים חשמליים) או להשתחרר לנוזלי הגוף עקב מוות ונזק לתאים. דנ"א חופשי במחזור הדם (cfDNA) משתחרר בעיקר לזרם הדם מתאים אפופטוטיים או נמקיים ונמצא בכל האנשים, ומראה רמות מוגברות במחלות דלקתיות או אונקולוגיות³. אקסוזומים הם בועיות חוץ-תאיות קטנות (כ-30-150 ננומטר) המופרשות על-ידי תאים המכילים חומצות גרעין, חלבונים וליפידים. שלפוחיות אלה מהוות חלק מרשת התקשורת הבין-תאית והן נמצאות בדרך כלל בסוגים רבים של נוזלי גוף². חומצות הגרעין הסגורות בתוך כלי רכב חשמליים מוגנות מפני הסביבה הקשה בנוזלי הגוף, ובכך מספקות דרך איתנה יותר לחקור את המולקולות הללו במסגרת הביופסיה הנוזלית.

באופן כללי, הרמות של חומצות גרעין במחזור הדם בדגימות ביופסיה נוזלית נמוכות מאוד, ולכן יש צורך בשיטות רגישות לזיהוי, כגון PCR דיגיטלי או ריצוף מהדור הבא (NGS). ניהול פרה-אנליטי של הדגימה הוא חיוני כדי למנוע תזה של תאי דם ושחרור של דנ"א שלם, מה שגורם לזיהום של ה-cfDNA עם הדנ"א הגנומי. יתר על כן, יש לנקוט משנה זהירות בעת חילוץ דגימות כדי למנוע נוכחות של מעכבים של שיטות ניתוח מבוססות אנזימים.

כאן אנו מציגים שיטה מתוקננת לאיסוף ואחסון של דגימות פלזמה וסרום, המהווה צעד ראשון מכריע עבור יישומים מבוססי ביופסיה נוזלית במורד הזרם, כולל ניתוחי חומצות גרעין במחזור הדם.

Protocol

אישור אתי מוקדם התקבל מהמרכזים המשתתפים לפני הפקת דגימות הדם. הפרוטוקולים הבאים לבידוד סרום ופלזמה בוצעו בהתאם לעקרונות האתיים למחקר ביו-רפואי.

הערה: שיקולים קודמים לפני תחילת הפרוטוקול מובאים כאן. נדרש אישור אתי מוקדם לשימוש בדגימות אנושיות במחקר ביו-רפואי, בהסכמה מדעת מתאימה. ארון בטיחות ביולוגית מדרגה II נדרש כדי לטפל בדגימות דם. יש ללבוש מעיל מעבדה, כפפות מגן ומשקפיים לאורך כל ההליך כדי למנוע זיהום על ידי פתוגנים הנישאים בדם. נדרש מינימום של 30 דקות לעיבוד דגימות סרום. לאחר שאיבת הדם בצינורות ללא נוגדי קרישה, יש לשמור על טמפרטורת החדר (RT) במשך 30-45 דקות כדי לאפשר היווצרות קרישי דם. לפחות 40 דקות נדרשות להכנת פלזמה, ויש לעבד דגימות תוך 4 שעות מרגע המיצוי בעת שימוש בצינורות חומצה טטרה-אצטית אתילנדיאמין (EDTA) או תוך 24-48 שעות אם משתמשים בצינורות איסוף מייצבי תאים או בצינורות איסוף DNA ספציפיים ללא תאים. עם זאת, לדברי כמה יצרנים, הדגימות יציבות עד שבועיים בצינורות מיוחדים אלה. חשוב לבדוק אם יש המוליזה, אשר תיתן לחלק הפלזמה או הסרום מראה אדמדם. עיין בסעיף פתרון הבעיות לקבלת דוגמאות המוליות בדיון.

1. הכנת סרום למחקרי ביופסיה נוזלית

הערה: הזמן הכולל הנדרש לביצוע שלב זה הוא 30 דקות (איור 1).

1. יש לחלץ 4-10 מ"ל דם בצינורות שאינם מכילים נוגדי קרישה (כובע אדום או אדום/אפור-שחור) ולשמור ב-RT למשך 30-45 דקות. לעבד דגימות אלה תוך 4 שעות מרגע החילוץ.
2. תעד את השעה והתאריך של חילוץ הדגימה ואת זיהוי הנושא (ID) במסד נתונים לדוגמה שתוכנן כראוי.
3. לבוש במעיל מעבדה, כפפות מגן ומשקפיים, צנטריפוגה הצינור המכיל דם טרי ב- RT (15 °C -25 ° C) במשך 10 דקות ב 1,600 (± 150) x g, עם ההפסקה המקסימלית מוחלת.
4. לאחר צנטריפוגה, בזהירות להסיר את הצינור מן הצנטריפוגה; השלב העליון של חומר-העל בסרום ייראה צלול וצהבהב (איור 2). בדקו אם הדגימה מראה סימנים של המוליזה (איור 3) ותעדו את נוכחות ההמוליזה בעת הצורך.
5. בארון בטיחות ביולוגית מסוג II, העבירו את הסרום לצינורות האיסוף כ-250 μL aliquots.
   הערה: יש להתאים את נפח האליקוטים לדרישות המחקר.
6. מיד להקפיא את הסרום זקוף בקופסת אחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ולרשום את זמן אחסון הדגימה.
7. ודא שהדגימות עובדו במסגרת הזמן הנדרשת של 4 שעות.

2. הכנת פלזמה למחקרי ביופסיה נוזלית

הערה: הזמן הכולל הנדרש לביצוע שלב זה הוא 40 דקות (איור 4).

1. יש לחלץ 4-10 מ"ל דם בצינורות המכילים חומצה טטרה-אצטית אתילנדיאמין (EDTA). לעבד את הדגימות ברדיוס של 4 שעות מרגע החילוץ.
2. רשום את השעה והתאריך של חילוץ הדגימה ואת מזהה הנושא במסד נתונים לדוגמה שתוכנן כראוי.
3. לבוש במעיל מעבדה, כפפות מגן ומשקפיים, צנטריפוגה בצינור EDTA ב- RT (15 °C -25 ° C) למשך 10 דקות ב 1,600 (± 150) x g, עם ההפסקה המרבית מוחלת.
   הערה: עיין בהוראות היצרן בעת שימוש בצינורות איסוף אחרים.
4. לאחר צנטריפוגה, סופרנאטנט הפלזמה ייראה צלול וצהבהב. בדקו אם הדגימה מראה סימנים של המוליזה (איור 3) והעברת הפלזמה (סופרנטנט) לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל מבלי להפריע לשכבת התא באמצעות פיפטה סרולוגית חד פעמית (או פיפטת נורה חד פעמית או פיפטות p1000 עם קצה מסנן). השאירו נפח שיורי קטן של פלזמה מעל שכבת התא (כ-5 מ"מ).
5. אם ההמוליזה נצפתה, השליכו את הדגימה לניתוחים נוספים. (איור 5). עיין בסעיף פתרון הבעיות בדיון כדי להעריך את ההמוליזה.
6. צנטריפוגה הפלזמה בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל ב- RT (15 °C-25 °C) למשך 10-20 דקות ב 3,000 (±150) x g. בצע שלב זה כדי להסיר את כל שאריות תאי הדם השלמים המועברים משלב הצנטריפוגה הראשון.
7. לאחר צנטריפוגה, הסר בזהירות את הצינור מהצנטריפוגה והעביר 1-4 מ"ל של פלזמה לבקבוקונים קריוגניים של פוליפרופילן 1-4 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית חד פעמית (או פיפטת נורה חד פעמית או פיפטות p1000 עם קצה מסנן). יש להשאיר נפח שיורי של פלזמה (כ-0.3 מ"ל או 7 מ"מ גובה) בתחתית הצינור כדי למנוע זיהום של הפלזמה בתאי הדם (איור 5).
8. מיד להקפיא את הפלזמה זקופה בקופסת האחסון ב -80 מעלות צלזיוס ולרשום את זמן אחסון הדגימה. ודא שהדגימות עובדו במסגרת הזמן הנדרשת של 4 שעות.
9. אספו את השכבה התאית (ציפוי באפי) באמצעות P1000 והקצה המסונן והעבירו אותה לצינור של 2 מ"ל. מיד להקפיא ולאחסן ב -80 °C (80 °F).

תוצאות

לאחר צנטריפוגה של צינורות הדם ללא נוגדי קרישה, הפאזה העליונה נראית צהובה בהירה ומתאימה לשבר הסרום (איור 2). חלק זה מוסר בקפידה ומועבר לניתוח הבא.

המוליזה עשויה להיות נוכחת בחלק הפלזמה או הסרום, והפאזה העליונה תהיה בעלת מראה אדמדם, מה שמעיד על נוכחות ומידת ההמו...

Discussion

לביופסיה הנוזלית יש יישומים פוטנציאליים רבים בזמנים שונים במהלך ניהול הסרטן. ראשית, באבחון כדי לזהות סמנים מולקולריים של גידולים שיצביעו על נוכחות של נגע פוטנציאלי בגידול שעשוי להיחקר עוד יותר מבחינה קלינית. שנית, במהלך הטיפול לניטור בזמן אמת של המחלה, הערכת התגובה המולקולרית של הטיפול, ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 120.086	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010010	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367525	These tubes can be used for plasma collection
15 mL polypropylene centrifuge tubes	BIOFIL	CFT411150	Any standard tubes/equipment can be used
3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	368965	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing	Corning	430662	Any standard tubes/equipment can be used
4 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367864	These tubes can be used for plasma collection
4200 TapeStation System	Agilent	G2991BA	Several quantification methods are available with a  specific application for cfDNA
5 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010005	Any standard tubes/equipment can be used
8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	366468	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor	Thermo Fisher Scientific	Sorvall ST 16  10688725	Any standard tubes/equipment can be used
Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials	Corning	431120	These boxes are needed when using 4 mL vials for storage
p1000 pipette tips	CORNING	4809	Any standard tubes/equipment can be used
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit	Qiagen	55114	Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.
Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL	Streck	218997	These tubes can be used for plasma collection
Temperature Freezer (-80 °C)	ESCO	2180104	Any standard tubes/equipment can be used