Um protocolo pré-analítico de biópsia líquida padronizada para aplicações de DNA sem circulação a jusante

Resumo

A biópsia líquida revolucionou nossa abordagem para estudos translacionais em oncologia, com coleta de amostras, qualidade e armazenamento sendo passos cruciais para sua aplicação clínica bem sucedida. Aqui descrevemos um protocolo padronizado e validado para aplicações de DNA sem circulação a jusante que podem ser aplicados na maioria dos laboratórios de pesquisa translacional.

Resumo

O termo biópsia líquida (LB) refere-se a moléculas como proteínas, DNA, RNA, células ou vesículas extracelulares no sangue e outros fluidos corporais que se originam do tumor primário e/ou metastático. A LB emergiu como um pilar na pesquisa translacional e começou a fazer parte da prática clínica de oncologia, fornecendo uma alternativa minimamente invasiva à biópsia sólida. A LB permite o monitoramento em tempo real de um tumor através de uma extração de amostra minimamente invasiva, como sangue. As aplicações incluem detecção precoce de câncer, acompanhamento do paciente para detecção de progressão da doença, avaliação de doença residual mínima e identificação potencial de progressão molecular e mecanismo de resistência. Para obter uma análise confiável dessas amostras que possam ser relatadas na clínica, os procedimentos pré-analíticos devem ser cuidadosamente considerados e rigorosamente seguidos. Coleta, qualidade e armazenamento de amostras são etapas cruciais que determinam sua utilidade em aplicações a jusante. Aqui, apresentamos protocolos padronizados do nosso módulo de trabalho de biópsia líquida para coleta, processamento e armazenamento de amostras de plasma e soro para análise de biópsia líquida a jusante com base no DNA livre de circulação. Os protocolos aqui apresentados exigem equipamentos padrão e são suficientemente flexíveis para serem aplicados na maioria dos laboratórios focados em procedimentos biológicos.

Introdução

O termo "biópsia líquida" foi definido em 2010¹ como a presença de moléculas (por exemplo, proteína, ácido desoxiribonucleico (DNA), ácido ribonucleico (RNA)), células ou vesículas extracelulares (por exemplo, exosomos) no sangue e outros fluidos corporais originários do tumor primário. O uso de amostras de biópsia líquida revolucionou a pesquisa de oncologia translacional como biópsias teciduais, limitadas a uma determinada região em um determinado momento, podendo perder clones relevantes devido à heterogeneidade tumoral. Além disso, a biópsia líquida desempenha um papel relevante nos tipos de tumores onde o tecido primário é escasso ou não acessível, pois pode evitar uma biópsia invasiva, reduzindo custos e riscos aos pacientes. Além disso, as características moleculares tumorais estão em constante evolução principalmente devido à pressão terapêutica, e amostras de biópsia líquida podem capturar a dinâmica clonal tumoral, pois podem ser tomadas longitudinalmente, em diferentes momentos clínicos e terapêuticos da doença, como linha de base, no tratamento, na melhor resposta e na progressão da doença ou mesmo antes. O conceito de "biópsia líquida em tempo real" significa que mudanças dinâmicas no tumor podem ser monitoradas em tempo real, permitindo assim a medicina de precisão nesta doença. A biópsia líquida possui inúmeras aplicações potenciais na clínica, incluindo rastreamento e detecção precoce de câncer, monitoramento em tempo real da doença, detecção de doença residual mínima, estudo de mecanismos de resistência ao tratamento e estratificação de pacientes no nível terapêutico¹. A detecção precoce da recidiva e progressão da doença são uma necessidade clínica não atendida em muitos tipos de tumores e é um fator-chave para aumentar a sobrevivência e a qualidade de vida dos pacientes com câncer. Modalidades de imagem de rotina e marcadores tumorais solúveis podem não ter a sensibilidade e/ou especificidade necessária para essa tarefa. Assim, novos marcadores preditivos são urgentemente necessários na clínica, como aqueles baseados na circulação de ácidos nucleicos livres.

Os tipos de amostras que são usadas para estudos de biópsia líquida incluem, mas não se limitam a amostras de sangue, urina, saliva e fezes. Outras amostras específicas do tumor podem ser aspirados celulares, fluido cefalorraquidiano, fluido pleural, cisto e ascites fluido, escarro e suco pancreático². Os líquidos antigos podem conter diferentes tipos de materiais derivados do câncer, células tumorais circulantes (CTC), ou fragmentos como exosóis e DNA tumor circulante livre de células (CTDNA). Os ácidos nucleicos podem ser encapsulados em vesículas extracelulares (EVs) ou liberados em fluidos corporais devido à morte e danos celulares. O DNA livre circulante (CFN) é liberado principalmente na corrente sanguínea a partir de células apoptóticas ou necróticas e está presente em todos os indivíduos, apresentando níveis aumentados em doenças inflamatórias ou oncológicas³. Exosomos são pequenas vesículas extracelulares (~30-150 nm) secretadas por células que contêm ácidos nucleicos, proteínas e lipídios. Essas vesículas fazem parte da rede de comunicação intercelular e são comumente encontradas em muitos tipos de fluidos corporais². Os ácidos nucleicos fechados dentro dos EVs são protegidos do ambiente áspero dentro dos fluidos corporais, fornecendo assim uma maneira mais robusta de estudar essas moléculas no cenário da biópsia líquida.

No geral, os níveis de ácidos nucleicos circulantes em amostras de biópsia líquida são muito baixos e, portanto, métodos sensíveis são necessários para detecção, como PCR digital ou sequenciamento de última geração (NGS). O manejo pré-analítico da amostra é crucial para prevenir a lise das células sanguíneas e a liberação de DNA intacto, causando contaminação do CFDNA com o DNA genômico. Além disso, deve-se tomar cuidado ao extrair amostras para evitar a presença de inibidores de métodos de análise baseados em enzimas.

Aqui apresentamos um método padronizado para a coleta e armazenamento de amostras de plasma e soro, que é um primeiro passo crucial para aplicações a jusante à base de biópsia líquida, incluindo análises de ácido nucleico circulante.

Protocolo

A aprovação ética prévia foi obtida nos centros participantes antes da extração de amostras de sangue. Os seguintes protocolos de isolamento sérico e plasmá plasma foram realizados de acordo com os princípios éticos para a pesquisa biomédica.

NOTA: Considerações prévias antes de iniciar o protocolo são fornecidas aqui. É necessária aprovação ética prévia para o uso de amostras humanas em pesquisas biomédicas, com o consentimento informado correspondente. Um armário de biossegurança classe II é necessário para manusear amostras de sangue. Um jaleco, luvas de proteção e óculos devem ser usados durante todo o procedimento para evitar infecções por patógenos transmitidos pelo sangue. É necessário um mínimo de 30 min para o processamento de amostras de soro. Após a extração de sangue em tubos sem anticoagulante, mantenha-se em temperatura ambiente (RT) por 30-45 min para permitir a formação de coágulos. É necessário um mínimo de 40 min para a preparação do plasma, e as amostras devem ser processadas dentro de 4 h a partir do momento da extração quando usar tubos de ácido tetra-acético de etilenodiamina (EDTA) ou dentro de 24-48 h se usar tubos de coleta de estabilização celular ou tubos específicos de coleta de DNA sem células. No entanto, de acordo com alguns fabricantes, as amostras são estáveis por até 2 semanas nestes tubos especializados. É importante verificar se há hemólise, o que dará à fração de plasma ou soro uma aparência avermelhada. Veja a seção de solução de problemas para amostras hemolisada na discussão.

1. Preparação do soro para estudos de biópsia líquida

NOTA: O tempo total necessário para realizar esta etapa é de 30 min (Figura 1).

1. Extrair 4-10 mL de sangue em tubos que não contenham anticoagulant (vermelho ou vermelho/cinza-preto) e manter em RT por 30-45 min. Processe essas amostras dentro de 4h a partir do momento da extração.
2. Registo a hora e a data da extração da amostra e a identificação do sujeito (ID) em um banco de dados de amostras devidamente projetado.
3. Usando um jaleco, luvas de proteção e óculos, centrifugar o tubo contendo sangue fresco na RT (15 °C-25 °C) por 10 min a 1.600 (± 150) x g, com a quebra máxima aplicada.
4. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o tubo da centrífuga; a fase superior do supernante sérico aparecerá clara e amarelada (Figura 2). Verifique se a amostra apresenta sinais de hemólise (Figura 3) e regissou a presença de hemólise quando apropriado.
5. Em um armário de biossegurança classe II, transfira o soro para tubos de coleta como alíquotas de 250 μL.
   NOTA: O volume das alíquotas deve ser ajustado aos requisitos do estudo.
6. Congele imediatamente o soro ereto em uma caixa de armazenamento a -80 °C e registe o tempo de armazenamento da amostra.
7. Verifique se as amostras foram processadas dentro do prazo de 4h necessário.

2. Preparação de plasma para estudos de biópsia líquida

NOTA: O tempo total necessário para realizar esta etapa é de 40 min (Figura 4).

1. Extrair 4-10 mL de sangue em tubos contendo ácido tetra-acético de etilenodiamina (EDTA). Processe as amostras dentro de 4h a partir do momento da extração.
2. Regissão a hora e a data da extração da amostra e o ID do assunto em um banco de dados de amostras devidamente projetado.
3. Usando um jaleco, luvas de proteção e óculos, centrifute o tubo EDTA em RT (15 °C-25 °C) por 10 min a 1.600 (± 150) x g, com a quebra máxima aplicada.
   NOTA: Consulte as instruções do fabricante ao usar outros tubos de coleta.
4. Após a centrifugação, o supernatante de plasma parecerá claro e amarelado. Verifique se a amostra mostra sinais de hemólise (Figura 3) e transfira o plasma (supernacante) para um tubo de centrífuga de 15 mL sem perturbar a camada celular usando uma pipeta sorológica descartável (ou pipetas descartáveis ou pipetas p1000 com ponta de filtro). Deixe um pequeno volume residual de plasma acima da camada celular (aproximadamente 5 mm).
5. Se for observada a hemólise, descarte a amostra para novas análises. (Figura 5). Consulte a seção de solução de problemas na Discussão para avaliar a hemólise.
6. Centrifugar o plasma em um tubo de centrífuga de 15 mL em RT (15 °C-25 °C) por 10-20 min a 3.000 (±150) x g. Realize esta etapa para remover quaisquer células sanguíneas intactas residuais transportadas a partir da primeira etapa de centrifugação.
7. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o tubo da centrífuga e transfira 1-4 mL de plasma para frascos criogênicos de polipropileno de 1-4 mL usando uma pipeta sorológica descartável (ou pipeta de bulbo descartável ou pipetas p1000 com ponta de filtro). Um volume residual de plasma (aproximadamente 0,3 mL ou 7 mm de altura) deve ser deixado na parte inferior do tubo para evitar contaminar o plasma com células sanguíneas (Figura 5).
8. Congele imediatamente o plasma ereto na caixa de armazenamento a -80 °C e regise o tempo de armazenamento da amostra. Verifique se as amostras foram processadas dentro do prazo de 4h necessário.
9. Colete a camada celular (casaco buffy) usando uma ponta P1000 e filtrada e transfira-a para um tubo de 2 mL. Congele imediatamente e armazene a -80 °C.

Resultados

Após a centrifugação dos tubos sanguíneos sem anticoagulante, a fase superior parece um amarelo pálido e corresponde à fração do soro (Figura 2). Esta fração é cuidadosamente removida e aliquoted para análise subsequente.

A hemólise pode estar presente na fração plasmática ou sárida, e a fase superior terá uma aparência avermelhada, o que indica a presença e o grau de hemólise (Figura 3).

Discussão

A biópsia líquida tem inúmeras aplicações potenciais em diferentes momentos durante o manejo do câncer. Primeiro, no diagnóstico para identificar marcadores moleculares tumorais que sugerem a presença de uma lesão tumoral potencial que poderia ser mais investigada clinicamente. Em segundo lugar, durante o tratamento para monitoramento em tempo real da doença, avaliação da resposta molecular do tratamento, evolução clonal e detecção precoce de recaídas da doença ou resistência ao tratamento. Finalmente,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 120.086	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010010	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367525	These tubes can be used for plasma collection
15 mL polypropylene centrifuge tubes	BIOFIL	CFT411150	Any standard tubes/equipment can be used
3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	368965	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing	Corning	430662	Any standard tubes/equipment can be used
4 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367864	These tubes can be used for plasma collection
4200 TapeStation System	Agilent	G2991BA	Several quantification methods are available with a  specific application for cfDNA
5 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010005	Any standard tubes/equipment can be used
8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	366468	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor	Thermo Fisher Scientific	Sorvall ST 16  10688725	Any standard tubes/equipment can be used
Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials	Corning	431120	These boxes are needed when using 4 mL vials for storage
p1000 pipette tips	CORNING	4809	Any standard tubes/equipment can be used
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit	Qiagen	55114	Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.
Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL	Streck	218997	These tubes can be used for plasma collection
Temperature Freezer (-80 °C)	ESCO	2180104	Any standard tubes/equipment can be used