JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقترح هذه الورقة جيلا جديدا من المنصات التحليلية متعددة المعلمات مع زيادة الإنتاجية لتوصيف مجموعات فرعية من الحويصلات خارج الخلية. تعتمد الطريقة على مزيج من طرق الاستشعار الحيوي متعددة الإرسال مع التحليلات المترولوجية والمورفولوجية بواسطة مجهر القوة الذرية ، إلى جانب التحليل الطيفي رامان ، لتأهيل الأهداف الحويصلية المحاصرة على رقاقة حيوية ميكروأري.

Abstract

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي حويصلات صغيرة مشتقة من الغشاء تنتجها جميع الخلايا التي يتراوح قطرها من 50 إلى عدة مئات من النانومتر وتستخدم كوسيلة للاتصال بين الخلايا. وهي تبرز كأدوات تشخيصية وعلاجية واعدة لمجموعة متنوعة من الأمراض. هناك نوعان من عمليات التكون الحيوي الرئيسية التي تستخدمها الخلايا لإنتاج EVs مع اختلافات في الحجم والتكوين والمحتوى. نظرا لتعقيدها العالي في الحجم والتكوين وأصل الخلية ، يتطلب توصيفها مزيجا من التقنيات التحليلية. يتضمن هذا المشروع تطوير جيل جديد من المنصات التحليلية متعددة المعلمات مع زيادة الإنتاجية لتوصيف المجموعات السكانية الفرعية للمركبات الكهربائية. لتحقيق هذا الهدف ، يبدأ العمل من منصة التحليل الحيوي النانوي (NBA) التي أنشأتها المجموعة ، والتي تسمح بإجراء تحقيق أصلي للمركبات الكهربائية بناء على مزيج من طرق الاستشعار الحيوي متعددة الإرسال مع التحليلات المترولوجية والمورفولوجية بواسطة مجهر القوة الذرية (AFM) للأهداف الحويصلية المحاصرة على رقاقة حيوية ميكروأري. كان الهدف هو إكمال هذا التحقيق في EV بتحليل النمط الظاهري والجزيئي بواسطة مطيافية رامان. تمكن هذه التطورات من اقتراح حل تحليلي متعدد الوسائط وسهل الاستخدام للتمييز بين المجموعات الفرعية EV في السوائل البيولوجية ذات الإمكانات السريرية

Introduction

أدى الاهتمام المتزايد بأبحاث EV في التشخيص والعلاجات1،2،3،4،5 ، جنبا إلى جنب مع التحديات التي يواجهها هذا المجال ، إلى تطوير وتنفيذ مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأساليب والتقنيات لتحديد أو توصيف هذه الحويصلات. الطرق الأكثر استخداما لتحديد EV هي النشاف المناعي الخاص بالبروتين والبروتينات لتأكيد أصل EVs ، والمجهر الإلكتروني النافذ (TEM) لتأكيد هيكلها ، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) لتحديد عددها وتوزيع حجمها في حجم العينة.

ومع ذلك ، لا تقدم أي من هذه التقنيات بمفردها جميع المعلومات المطلوبة لتوصيف المجموعات الفرعية للمركبات الكهربائية. إن عدم التجانس المتأصل في المركبات الكهربائية بسبب التنوع في خصائصها البيوكيميائية والفيزيائية يعوق التحليلات العالمية الموثوقة والقابلة للتكرار ، خاصة بالنسبة للمركبات الكهربائية الموجودة في خليط (عينة خام). لذلك ، هناك حاجة إلى طرق الكشف والتوصيف للمركبات الكهربائية ، بشكل فردي وعام لاستكمال الطرق الأخرى الأسرع ولكن غير الانتقائية6.

يسمح التصوير عالي الدقة بواسطة TEM (أو cryoTEM) أو AFM بتحديد مورفولوجيا ومقاييس المركبات الكهربائية بدقة نانومترية7،8،9،10،11،12. ومع ذلك ، فإن القيد الرئيسي لاستخدام المجهر الإلكتروني للأشياء البيولوجية ، مثل EVs ، هو الحاجة إلى فراغ لإجراء الدراسة التي تتطلب تثبيت وتجفيف العينة. مثل هذا التحضير يجعل من الصعب الترجمة من الهياكل التي تمت ملاحظتها إلى مورفولوجيا EV في الحل. لتجنب هذا الجفاف للعينة ، فإن تقنية cryoTEM هي الأنسب لتوصيف EV13. يستخدم على نطاق واسع لتحديد البنية التحتية للمركبات الكهربائية. كما أن وضع العلامات المناعية للحويصلات بواسطة جسيمات الذهب النانوية الوظيفية بيولوجيا يجعل من الممكن تحديد مجموعات فرعية محددة من المركبات الكهربائية وتمييزها عن الجسيمات الأخرى الموجودة في عينة بيولوجية معقدة. ومع ذلك ، نظرا لانخفاض عدد المركبات الكهربائية التي تم تحليلها بواسطة المجهر الإلكتروني ، غالبا ما يكون من الصعب إجراء توصيف يمثل عينة معقدة وغير متجانسة.

للكشف عن عدم تجانس الحجم هذا ، تقترح الجمعية الدولية للحويصلات خارج الخلية (ISEV) تحليل عدد كاف من الصور واسعة المجال ، مصحوبة بصور أصغر ، للكشف عن EVs فردية عالية الدقة14. AFM هو بديل للنهج البصرية وتقنيات الحيود الإلكترونية لدراسة المركبات الكهربائية. تستخدم هذه التقنية طرفا حادا يحمله ناتئ مرن يقوم بمسح العينة المودعة على دعامة واحدة ، سطرا بسطر ، ويضبط المسافة بين الطرف والعناصر الموجودة من خلال حلقة التغذية المرتدة. هذا يجعل من الممكن توصيف تضاريس العينة وجمع المعلومات المورفولوجيةالميكانيكية 15،16،17،18. يمكن مسح المركبات الكهربائية بواسطة AFM إما بعد ترسبها على ركيزة مسطحة ذريا أو بعد التقاطها على ركيزة معينة تعمل بواسطة الأجسام المضادة أو الببتيدات أو الأبتامرات لتوصيف المجموعات السكانية الفرعيةالمختلفة 18,19. نظرا لقدرته على تحديد البنية والميكانيكا الحيوية والمحتوى الجزيئي الحيوي الغشائي للمركبات الكهربائية داخل العينات البيولوجية المعقدة والتحقيق فيها في وقت واحد دون الحاجة إلى المعالجة المسبقة أو وضع العلامات أو الجفاف ، يتم الآن استخدام AFM بشكل متزايد لتوصيف المركبات الكهربائية بطريقة دقيقة ومتعددة المعلمات في ظل الظروف الفسيولوجية لدرجة الحرارة والمتوسطة.

تقترح هذه الورقة منهجية تستخدم رقاقة حيوية ذهبية أساسية قادرة على أن تكون وظيفية كيميائيا (حيوية) بتنسيق متعدد الإرسال. هذه الركيزة هي حجر الزاوية في منصة تحليلية قوية تجمع بين الكشف البيولوجي عن مجموعات فرعية من المركبات الكهربائية عن طريق رنين البلازمون السطحي ، وبمجرد امتصاص / تطعيم المركبات الكهربائية أو التقاطها مناعيا على الرقاقة ، يتيح AFM التوصيف المترولوجي والمورفولوجي للمركبات الكهربائية. إلى جانب توقيع رامان للمجموعات الفرعية للمركبات الكهربائية التي تم التقاطها على الشريحة ، تتيح هذه المنصة التحليلية تأهيل المركبات الكهربائية الموجودة في العينات البيولوجية بطريقة خالية من الملصقات ودون الحاجة إلى خطوات ما قبل التحليل. توضح هذه الورقة أن الجمع بين التقنيات القوية ، بمساعدة منهجية صارمة للغاية في إعداد الركيزة والحصول على البيانات ، يجعل تحليل EV عميقا ونهائيا وقويا.

مبدأ النهج المقترح هو إعداد ركيزة ذهبية ، لامتصاص / تطعيم أو التقاط الأنواع الفرعية للمركبات الكهربائية ، ومسحها ضوئيا بواسطة AFM لتقدير حجم وشكل كل مجموعة فرعية من المركبات الكهربائية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحليل تلك المركبات الكهربائية الممتصة بواسطة التحليل الطيفي لرامان. يمكن لهذه الركيزة ، في الواقع ، أن تقدم ثلاثة أنواع من الواجهات ذات التعقيد المتزايد: المصفوفات الدقيقة العارية أو الوظيفية كيميائيا أو الرباط. قبل وصف الخطوات المختلفة للبروتوكول ، تتم إحالة القراء إلى العرض التخطيطي لنهج منصة التحليل الحيوي النانوي (NBA) في الشكل 1 ، والذي يجمع بين التصوير بالرنين البلازموني السطحي (SPRi) و AFM والتحليل الطيفي.

figure-introduction-5142
الشكل 1: منصة التحليل الحيوي النانوي. يجمع هذا النهج بين (أ) التصوير بالرنين البلازموني السطحي ، (ب) مجهر القوة الذرية ، والتحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء / رامان (نانو) ، وكلها تعمل على نفس الركيزة - شريحة ذهبية متعددة. الاختصارات: NBA = منصة التحليل الحيوي النانوي ؛ SPRi = التصوير بالرنين البلازموني السطحي ؛ AFM = مجهر القوة الذرية ؛ EV = حويصلة خارج الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تشكل الرقاقة الحيوية الذهبية الأساسية قلب المنصة حيث يتم إجراء جميع تقنيات التوصيف الخالية من الملصقات على هذه الرقاقة الحيوية. وفقا لاحتياجات توصيف EV (إما مجموعات EVs العالمية / الكلية أو مجموعات فرعية EV) وقيود / متطلبات الطرق المستخدمة ، تم تطوير ثلاثة أنواع من أسطح الرقائق الحيوية الذهبية: إما "عارية" ، وظيفية كيميائيا "C11 / C16" ، أو ligand-biofunctionalized ، تسمى سطح الذهب "ligand".

تتيح الرقاقة الحيوية العارية ، المسماة "عارية" ، الامتزاز البسيط للمركبات الكهربائية على الذهب. من الممكن تحديد المخزن المؤقت المستخدم وتحقيق هذا الامتزاز إما بطريقة سلبية (الحضانة ثم خطوات الشطف) أو لمراقبته تحت التدفق (في SPRi). علاوة على ذلك ، يمكن تحقيق هذا الامتزاز السلبي إما على الشريحة بأكملها (كمصفوفة كبيرة) أو موضعية في المصفوفات الدقيقة باستخدام مراقب ماصة دقيقة. يسمح "إجراء التدفق المنخفض" للمحققين بمتابعة الحركية ومستوى امتصاص EV. يتم اعتماد هذا النهج على الركيزة الذهبية المجردة عندما تتداخل واجهة الطبقة الكيميائية مع الطريقة التحليلية (على سبيل المثال ، لتحليل رامان الطيفي).

تستخدم الرقاقة الحيوية الوظيفية كيميائيا ، والتي تسمى "C11 / C16" ، لإنشاء "سجادة" كثيفة وقوية من المركبات الكهربائية المرتبطة تساهميا على سطح الذهب عن طريق تكوين روابط أميد أولية مع الثيولات عندما يكون الهدف هو الحصول على رؤية عالمية لعينة EV. في الواقع ، في هذه الحالة ، يتم تشغيل الذهب بواسطة خليط ثيولات من mercapto-1-undecanol (11-MUOH: "C11") وحمض mercapto-1-hexadecanoic (16-MHA: "C16") ، ويتم تنشيط جزء من الثيولات كيميائيا لإنشاء ارتباط تساهمي مع الأهداف. مرة أخرى ، يمكن تحقيق هذه الاستراتيجية إما بشكل سلبي (خطوات الحضانة ثم الشطف ، إما في "macroarray" أو في مصفوفات دقيقة متعددة باستخدام مراقب micropipit) أو تحت معدلات التدفق (في SPRi) لمتابعة حركية ومستوى تطعيم EV على سطح الذهب.

يتم تنشيط الرقاقة الحيوية ذات الوظائف الحيوية ، والتي تسمى "الروابط" ، كيميائيا لتطعيم روابط مختلفة تساهميا (على سبيل المثال ، الأجسام المضادة والمستقبلات) لالتقاط مجموعات فرعية مختلفة من EV تتعايش في العينة البيولوجية بشكل انتقائي (مع التقارب).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد الركيزة الذهبية

ملاحظة: يتم إنتاج ثلاثة أنواع من الأسطح على رقائق الذهب: 1) سطح عاري ، 2) وظيفي كيميائيا ، و 3) وظيفي حيوي (روابط مطعمة على طبقة C11C16). سيطلق عليهم "عارية" و "C11C16" و "روابط" على التوالي ، من هذه النقطة فصاعدا.

  1. إعداد الركيزة الذهبية:
    ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم تصنيع الرقائق الحيوية الذهبية داخليا في الغرفة النظيفة. تتكون الرقائق الحيوية محلية الصنع من شرائح زجاجية (SF11) مع طلاء من الكروم (2 نانومتر Cr) والذهب (48 نانومتر Au). كان طول الرقاقة الحيوية 28 ملم ، وكان العرض 12.5 ملم ، وكان سمك 0.5 ملم20.
    1. استخدم الاخرق المغنطرونDC 15 لتغطية الشرائح عن طريق ترسيب البخار المادي (PVD).
  2. الوظائف الكيميائية:
    1. قم بتشغيل الرقائق المجردة عن طريق احتضانها طوال الليل في خليط 90٪ / 10٪ بواسطة الخلد من mercapto-1-undecanol (11-MUOH: C11) وحمض mercapto-1-hexadecanoic (16-MHA: C16) عند 1 mM في الإيثانول المطلق ، تحت التحريك ، وفي درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: ستشكل هذه الخطوة طبقة أحادية مستقرة ومجمعة ذاتيا (SAM) ، وهي مفيدة في تطعيم الروابط.
    2. نظف الرقاقة الحيوية (اغسلها برفق) بالإيثانول المطلق والماء عالي النقاء ، وجففها تحت النيتروجين ، وقم بتخزينها في ظروف غرفة نظيفة.
    3. تفعيل الرقاقة الحيوية الوظيفية كيميائيا:
      ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، يجب إجراء التجارب في مختبر تحليلي.
      1. نظف الرقاقة الحيوية بماء عالي النقاء عن طريق غسلها برفق ، ثم جفف الرقاقة تحت تدفق هواء لطيف. لتنشيط المجموعات الكربوكسيلية C16 ، احتضان الرقاقة الحيوية في خليط من 200 mM إيثيل (ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) كربوديميد / N-hydroxysuccinimide (EDC) و 50 مليمول / لتر N-hydroxysuccinimide (Sulfo-NHS) لمدة 30 دقيقة على الأقل في الظلام في درجة حرارة الغرفة. ثم شطف بالماء قبل تجارب التطعيم.
  3. تطعيم الروابط على الرقاقة الحيوية الوظيفية:
    ملاحظة: يمكن أن يتم تثبيت الروابط (أو EVs لبعض التجارب) على الشريحة إما بشكل سلبي خارج أداة SPRi (حضانة قطرة على الشريحة المنشطة) أو التدفق الديناميكي إلى أداة SPRi. هذا يشكل رقائق EV أو ligand المعدلة. يعرض الشكل 2 الرقاقة الحيوية الذهبية ، ومراقب الماصة الدقيقة ، والرقاقة الحيوية بعد اكتشافها ب 16 قطرة ليجند كل منها 300 nL.
    1. لتطعيم الرباط ، استخدم جزيئات مثل الأجسام المضادة (على سبيل المثال ، الغلوبولين المناعي-antiCD41 [خاص ب EVs المشتقة من الصفائح الدموية الأصلية ، تسمى N-PEVs] ، antiCD61 ، antiCD62P ، antiCD9 ، و antiOVA [التحكم في الجسم المضاد ضد البومين البيضاوي]) و Annexin V. قم بتخفيفها عند 200 ميكروغرام / مل في محلول حمضي (من الرقم الهيدروجيني 4.5 إلى 6 اعتمادا على الرقم الهيدروجيني الأمثل لنشاط أو وظيفة الرباط).
      ملاحظة: تم تحديد الرقم الهيدروجيني الأمثل لتطعيم الأجسام المضادة سابقا من خلال تجارب التركيز المسبق التي أجريت على أداة SPR لتحديد الرقم الهيدروجيني الأمثل لتطعيم الليجند (انظر الشكل 3). مع تغير ظروف التطعيم مع استنساخ الأجسام المضادة المستخدمة ، يوصى بتحديد هذه الشروط قبل الشروع في تجارب SPRi.
    2. لإجراء التطعيم ، أضف 300 nL من EVs / ligand Solution باستخدام جهاز الرصد.
      ملاحظة: يجب حفظ قطعة من الورق مغمورة في الماء في كل من الآبار اليمنى واليسرى لتجنب تبخر القطرات. هذه الخطوة مهمة للحفاظ على المركبات الكهربائية / الروابط في ظروفها المثلى من أجل الاستقرار والوظائف.
    3. بعد الإكتشاف ، احتفظ بالرقاقة الحيوية تحت حمام صوتي (التردد: 37 كيلو هرتز ، الطاقة: 30٪) لمدة 30 دقيقة حضانة. اغسل الرقاقة الحيوية من الأعلى بماء فائق النقاء ، وضعها برفق على منشور بنفس معامل الانكسار (RI) مثل الرقاقة الحيوية. أثناء ضبط الرقاقة الحيوية في الجزء العلوي من المنشور ، أضف قطرة (~ 2.3 ميكرولتر) من الزيت بنفس RI مثل المنشور لإنشاء طبقة رقيقة موحدة بين الرقاقة الحيوية والمنشور.
      ملاحظة: تضمن هذه الخطوة وسيطا مستمرا لنفس المثيل المحجوز في المسار البصري. من المهم تجنب دمج أي فقاعات في طبقة الزيت في هذه الخطوة ، لأن هذا سيغير الخصائص البصرية في المسار ويعيق المزيد من التحليل.

figure-protocol-4112
الشكل 2: رقاقة حيوية ومراقب يدوي. رقاقة حيوية ذهبية (يسار) ، مراقب ماصة دقيقة (وسط) ، ورقاقة حيوية بعد اكتشافها بقطرات ليجند تبلغ 300 نانولتر لكل منها (يمين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-4612
الشكل 3: اختبارات التركيز المسبق لتحديد الأس الهيدروجيني الأمثل لتطعيم الرباط. يعرض مخطط الاستشعار مستوى التفاعل كدالة للوقت لرابط واحد يتم حقنه عشوائيا (بقيم أس هيدروجيني مختلفة) بنفس التركيز على مدى 2 دقيقة على السطح. OG هو المنظف ، الذي يسمح باستعادة خط الأساس بين كل حقنة. هنا ، يشير مخطط الاستشعار إلى أن الرقم الهيدروجيني 6 سمح بتطعيم معظم الرباط ، مع إشارة SPRi تبلغ 1091 RU. الاختصارات: OG = أوكتيل جلوكوزيد. RU = وحدة الاستجابة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. التصوير بالرنين البلازموني السطحي

  1. قم بتركيب الرقاقة الحيوية على نظام SPRi. حافظ على معدل تدفق المخزن المؤقت PBS (المخزن المؤقت قيد التشغيل) عند 50 ميكرولتر / دقيقة.
    ملاحظة: إذا كان هناك أي فقاعات ، فقم بزيادة معدل التدفق حتى 500-1000 ميكرولتر / دقيقة ، وقم بحقن 40 مللي متر أوكتيل جلوكوزيد (OG) بشكل متكرر لإزالتها في أسرع وقت ممكن.
  2. تكييف الرقاقة الحيوية الذهبية في أداة SPRi: اختيار زوايا العمل
    1. انقر فوق القائمة المنسدلة على الجانب الأيسر من البرنامج ، وانقر فوق دليل العمل لتحديد المجلد الذي سيتم حفظ البيانات التجريبية فيه. بعد ذلك ، انقر فوق Plasmon | الحصول على الصور.
    2. ابحث عن الصورة (كما هو موضح في الشكل 4 أ) حيث تظهر بقع مختلفة ، وانقر لتحديد هذه الصورة. لتحديد منطقة الاهتمام (ROI) ، كما هو موضح في الشكل 4 ، انقر إما على الكشف التلقائي أو التعريف اليدوي داخل البقع (الشكل 4B) أو على الشريحة للإشارة إلى موقع معين حتى بدون بقع (الشكل 4C) ،.
    3. عند استخدام الرقائق الحيوية المتعددة ، اكتب اسم عائلات الليجند ، ثم انقر فوق البقع المقابلة.
      ملاحظة: تتوافق عائلة الليجند مع عدة نقاط تعمل بنفس الرباط. عادة ، تقدم الشريحة على الأقل نسخا مكررة وحتى في كثير من الأحيان ثلاث نسخ من كل رابط.
    4. انقر فوق إنهاء تعريف الأنواع وانتظر حتى يتم توجيهك إلى النافذة التي تحتوي على منحنيات البلازمون التي تم الحصول عليها.
    5. اختر زاوية العمل. اسحب الخط الأسود مع المؤشر إلى زاوية العمل المثلى ، وانقر فوق تحريك المرآة إلى زاوية العمل.
      ملاحظة: يتكون منحنى البلازمون من قيمة الانعكاسية (٪) مقابل الزاوية ، ويعطي البرنامج منحنى آخر بقيمة الميل (٪) مقابل الزاوية. لتحديد زاوية عمل جيدة ، اختر الزاوية ذات أعلى قيمة للميل.
      1. في حالة وجود خطوة تخميل (بسبب الألبومين) يتم إجراؤها داخل الجهاز ، حدد زاوية عمل للحصول على الحساسية المثلى تجاه السطح ، وبالتالي إنشاء مراقبة جودة تفاعل السطح.
        ملاحظة: تعد خطوة التخميل هذه مهمة عندما تكون الرقاقة جاهزة للكشف البيولوجي عن التقارب / الالتقاط لتقليل التفاعلات غير المحددة بين العينة وسطح الرقاقة الحيوية.
  3. انقر فوق الحركية لبدء المراقبة الحركية في الوقت الفعلي. بمجرد أن يطالب البرنامج المستخدم بتحديد التحكم السلبي ، اختر عدم وجود تحكم سلبي في هذه المرحلة (حيث سيسمح ذلك بمراقبة الحركية على نقاط التحكم السلبية).
    1. حقن ألبومين مصل الفئران (RSA ، 200 ميكروغرام / مل ، محضر في محلول خلات ، درجة الحموضة 4.5) عند 50 ميكرولتر / دقيقة لمدة 4 دقائق لتخميل السطح حول البقع وربما لملء المساحات الفارغة داخل بقع الرباط.
      ملاحظة: يتم حقن RSA لتغطية الرقاقة الحيوية ، والتي لا ترتبط بأي روابط.
    2. حقن الإيثانولامين (1 M) عند 20 ميكرولتر / دقيقة لمدة 10 دقائق لإلغاء تنشيط المجموعات الكربوكسيلية التي لا تزال موجودة ومتفاعلة على السطح.
    3. اغسل الرقاقة الحيوية عن طريق حقن 40 mM OG عند 50 ميكرولتر / دقيقة لمدة 4 دقائق.
      ملاحظة: بعد خطوة التخميل ، يتم ضبط زاوية العمل (كتحديد أساسي جديد قبل حقن العينة) لتكون بأعلى حساسية على النقاط المهمة.
  4. حقن العينة:
    1. أعد تعريف منحنيات البلازمون بعد التخميل ، واختر زاوية العمل وفقا لليجند هذه المرة.
    2. في المراقبة الحركية ، قلل معدل التدفق إلى 20 ميكرولتر / دقيقة ، وانتظر حتى يكون خط الأساس مستقرا.
    3. قم بحقن العينة بتركيز من اختيارك (من 1 × 10 8 EVs / مل إلى 1 × 10 10 EVs / mL اعتمادا على التقارب بين EVs والروابط المطعمة) ، وانقر فوق الحقن اليدوي أو الحقن التلقائي. في حالة الحقن اليدوي ، بعد حقن 200 ميكرولتر من العينة ، انقر فوق إيقاف الحقن. نظرا لأن مدة الحقن تكون بشكل عام 10 دقائق ، ابدأ في اتباع حركية التفاعل ، وقم بقياس تباين الانعكاسية عن طريق حساب الفرق في الانعكاسية بين بداية ونهاية الحقن التي لوحظت أثناء المراقبة الحركية (الشكل 5).
      ملاحظة: يتم وصف العينات المختلفة التي تم حقنها في قسم النتائج التمثيلية.
  5. بعد حقن العينة، اتبع أيا من هذين النهجين لإنهاء تجربة SPRi:
    1. في النهج غير الثابت / السائل ، أخرج الرقاقة الحيوية من جهاز SPRi ، وأضف قطرة سائلة عليها ، وتابع لمزيد من توصيف AFM للسطح في السائل.
    2. في النهج الثابت ، حقن الجلوتارالدهيد (0.5٪) المخفف في الماء عند 20 ميكرولتر / دقيقة لمدة 10 دقائق لإصلاح الجزيئات التي تم التقاطها على الرقاقة الحيوية. قم بحقن الماء لشطف السطح ، وأخرج الرقاقة الحيوية ، واغسلها برفق شديد بالماء المقطر ، وجففها في الهواء لتحليلها بشكل أكبر تحت AFM.

figure-protocol-10333
الشكل 4: صورة SPRi CCD للرقاقة الحيوية . (أ ، ب) رقاقة حيوية متعددة الإرسال بعد تخميل الألبومين. (أ) شريحة بدون تقصير ؛ (ب) بعض العيوب التي ظهرت على الرقاقة: اندماج البقع (i) ، التطعيم الضعيف (ii) ، أو الغبار أو "الملوثات" (iii). تم اختيار عائد الاستثمار ، بالألوان في البقع (لون واحد لكل عائلة يجند) ، لتجنب تلك "الملوثات". عندما اندمجت البقع ، تمت ملاحظتها وتجاهلها أو تسميتها باسم "خليط من الروابط 1 و 2". (ج) رقاقة ذهبية عارية بدون مصفوفات دقيقة للتجربة التي تفحص امتزاز المركبات الكهربائية على الذهب. يشير السهم الأزرق إلى اتجاه التدفق. لم تقدم هذه الشريحة بقعا ، وتم اختيار عائد الاستثمار لتسجيل إشارة الانعكاسية من الخط 1 (L1 ، الدوائر الحمراء) إلى الخط 4 (L4 ، الدوائر الأرجواني) أثناء حقن العينة. شريط المقياس = 1 مم لجميع الصور الثلاث. الاختصارات: SPRi = التصوير بالرنين البلازموني السطحي ؛ CCD = جهاز مقترن بالشحن ؛ عائد الاستثمار = مناطق الاهتمام ؛ EVs = حويصلات خارج الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-11647
الشكل 5: تجارب SPRi لحقن EV على رقاقة حيوية. (أ) تجربة التقاط على رقاقة حيوية متعددة الإرسال توضح إشارات الانعكاسية للروابط المختلفة. هنا ، كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء للروابط المختلفة جيدة جدا (وخاصة على البقع المضادة ل CD41) لأن استجابة التحكم السلبي كانت ضئيلة. (ب) تجربة امتزاز المركبات الكهربائية على رقاقة حيوية عارية. يقدم مخطط الاستشعار تكييف الشريحة مع تدفقين من المخزن المؤقت وتنظيف OG (1) ، مع حقن عينة EV (2) ، وإشارة الانعكاسية بعد تفاعل EV (3). على هذه الرقاقة الحيوية ، لم يكن هناك تحكم سلبي ، ولكن إشارة الانعكاسية (حركيتها ، ثباتها بعد الحقن) كانت عالية ، مما يعني أن تلك المركبات الكهربائية كانت قادرة على الامتصاص والبقاء مستقرة على شريحة الذهب. الاختصارات: EV = حويصلة خارج الخلية. OG = أوكتيل جلوكوزيد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. مجهر القوة الذرية

  1. استخدم وضع الاتصال لمسح الرقاقة الحيوية في الهواء ووضع التصوير الكمي لمسح الرقاقة الحيوية في ظروف سائلة.
  2. قم بمحاذاة الرقاقة الحيوية الموجودة أعلى القناع على الشريحة الزجاجية (التي تم تطويرها في المختبر) لتحديد موضع البقع الدقيقة المعنية على الرقاقة الحيوية (الشكل 6 أ).
    ملاحظة: يحتوي القناع على علامات البقع ، والتي تتوافق مع مواضع بقع الروابط وفقا للمراقب المستخدم. يتكون هذا القناع من شريحة زجاجية يتيح عليها إسفينان عموديان وضع الشريحة. علاوة على ذلك ، يتم تمييز الشريحة الزجاجية ب 16 نقطة محسوسة تتوافق مع توطين البقعة على الشريحة ، مما يسمح ، عن طريق الشفافية ، بتحديد موقع البقع ومسح المنطقة المطلوبة.
  3. وضع الحافة:
    1. استخدم كاميرا CCD أعلى AFM لتحديد موقع الكابولي في المكان الصحيح الذي يجب مسحه ضوئيا. لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم ناتئات مثلثة بطول 200 ميكرومتر وعرض 28 ميكرومتر وثابت زنبركي يبلغ 0.08 نيوتن / م.
  4. قم بمحاذاة الليزر في الجزء العلوي من الكابولي في وضع يعطي استجابة مثالية في آلية التحكم في التغذية المرتدة.
  5. المسح الضوئي:
    1. بمجرد تعشيق سطح الرقاقة الحيوية وملامسته ، ابدأ اكتساب AFM في وضع التلامس أو في وضع التصوير الكمي من ثلاث إلى خمس مناطق كبيرة (عادة 10 × 10 ميكرومتر مربع) إلى مناطق صغيرة (1 × 1 ميكرومتر مربع).
      ملاحظة: يظهر تمثيل للمناطق المختلفة التي يمكن مسحها ضوئيا في الشكل 6D. تأكد من أن توصيف AFM يمثل بقعة mm² بأكملها وأن ما يكفي من المركبات الكهربائية يتم تصورها بدقة جيدة لإجراء تحليل قوي (يتم حساب وتحليل 300 EVs على الأقل لكل حالة) ، وإجراء قياسات القياس والمورفولوجيا.
  6. معالجة صورة AFM:
    1. تعامل مع صور AFM باستخدام برنامج معالجة بيانات JPK عن طريق تحديد قناة الارتفاع أولا.
    2. اختر ملاءمة كثيرة الحدود ليتم طرحها من كل سطر للحصول على خطوط مسح مستقيمة.
    3. حدد عتبة الارتفاع على حبيبات الذهب للتخلص من خشونة السطح. في البرنامج المشار إليه (انظر جدول المواد) ، ضمن وحدة استخراج الحبوب ، قم بتمييز الحبوب باستخدام قيمة عتبة الارتفاع عند 8.5 نانومتر. بمجرد تصفية الحبوب ، يظهر عدد الحبوب .
      ملاحظة: عادة ، تتطلب الركيزة الذهبية الخام (RMS من ~ 3 نانومتر) ووجود الطبقات الكيميائية والرباط تعيين العتبة عند 8.5 نانومتر.
    4. لاستخراج العديد من خصائص الحبيبات المحددة ، مثل الارتفاع والحجم والقطر ، افتح الصورة في البرنامج المشار إليه ، وحدد معالجة البيانات | الحبوب | ضع علامة حسب العتبة.
    5. اختيار الحبوب مرشح في وظيفة الخصائص. عند ظهور نافذة جديدة، اختر المعلمات التالية: القيمة = الحد الأقصى z-max، Surface = السطح المسقط A0. ثم اختر المعيارين A و B.
    6. توزيع الحبوب المفتوحة ؛ في النافذة التي تظهر، اختر القيمة (الحد الأقصى) والحجم (الأساسي: صفر) والحد (الطول). لاحظ الجدول (بتنسيق .txt) الذي يظهر ، والذي يقدم ثلاثة أعمدة مع قيم الارتفاع والحجم والقطر لجميع الحبوب المكتشفة عند العتبة المحددة لكل صورة.
    7. من الارتفاع ، h ، والقطر ، D ، احسب نصف قطر الانحناء ، Rc ، لكل EV باستخدام المعادلة (1) 8 ، ثم احسب الحجم ، V ، باستخدام المعادلة (2):
      figure-protocol-16303(1)
      figure-protocol-16415(2)
    8. من V ، احسب القطر الفعال ، d eff ، لكل EV (قطر كرة بنفس الحجم) باستخدام المعادلة (3):
      figure-protocol-16679(3)
    9. رسم بياني يوضح الأحجام (الارتفاع المقاس والقطر المقاس والقطر الفعال المحسوب) للمركبات الكهربائية ، مع حساب كل جسيم ممثلة بنقطة.
      ملاحظة: وبالتالي ، في نهاية التوصيف ، تتيح منصة NBA ارتباط إشارة الكشف البيولوجي ثم التنميط الظاهري بأرقام وأحجام المجموعات الفرعية EV.

figure-protocol-17155
الشكل 6: توصيف الرقاقة الحيوية بواسطة AFM. بعد تجربة SPRi ، تم تثبيت الشريحة وتجفيفها أو صيانتها في سائل لتوصيف AFM. (أ) الشريحة الزجاجية المشكلة (مع إسفينين عموديين لتحديد المواقع ، يشار إليهما بحرف "w" على الصورة) تقدم قناعا مناسبا لتوطين 16 صفيفا دقيقا للرقائق الحيوية. من خلال التعرض للضوء والشفافية ، بمجرد التثبيت لتوصيف AFM ، تتيح الشريحة الزجاجية وضع طرف AFM في المكان المطلوب لتوصيفه. (ب) الرقاقة الحيوية المثبتة على شريحة "القناع" وتحت قطرة من المخزن المؤقت للمسح في ظروف السائل. (ج) صورة SPRi للمصفوفات الدقيقة ال 16. (د) مصفوفة ميكروية واحدة تم تصويرها بواسطة المجهر الضوئي بعد الالتقاط المناعي لجسيمات نانوية معايرة وظيفية حيوية يبلغ قطرها 920 نانومتر. تشير المربعات البيضاء إلى أخذ عينات من المناطق المختلفة التي تم مسحها ضوئيا بواسطة AFM في كل بقعة مهمة لجعل توصيف AFM قويا. قضبان المقياس = (C) 1 مم ، (D) 500 ميكرومتر. الاختصارات: AFM = مجهر القوة الذرية ؛ SPRi = التصوير بالرنين البلازموني السطحي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. مطيافية رامان

ملاحظة: بالنسبة لمطيافية رامان ، استبدل الشريحة الزجاجية المستخدمة كركيزة بشريحة من CaF2 ، والتي لها توقيع رامان ضئيل.

  1. الشروط البصرية للاستحواذ:
    1. اضبط الشروط التالية لمجهر تصوير رامان: هدف المجهر: 50x ؛ الطول الموجي بالليزر: 532 نانومتر ؛ طاقة الليزر: 10 ميجاوات ؛ وقت التعرض: 500 مللي ثانية ؛ عدد التراكمات: 140 ؛ المدى الطيفي: من 450 سم −1 إلى 3200 سم −1.
      ملاحظة: يمكن أن يؤدي استخدام الكثير من الطاقة و / أو وقت الاستحواذ الطويل جدا إلى تلف العينة ، كما يتضح من الأطياف غير المستقرة بمرور الوقت. ابدأ بكمية منخفضة من الطاقة وقم بزيادتها إذا كانت الإشارة ضعيفة جدا. يمكن استخدام أطوال موجية ليزر أعلى (633 نانومتر ، 785 نانومتر) لتقليل التألق الضار بقياسات رامان. ومع ذلك ، تنخفض الشدة مع القوة الرابعة للطول الموجي ، ويجب مراعاة الحساسية الطيفية للكاميرا.
  2. تصوير رامان:
    1. أولا ، راقب الأطياف الحية بعدد أقل من التراكمات (10) للعثور على المنطقة ذات أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء.
      ملاحظة: يمكن للإشارة القوية في منطقة التردد العالي (2800-3000 سم −1) أن تسهل اكتشاف المركبات الكهربائية على السطح مع أوقات تعرض منخفضة ، كما هو موضح سابقا10.
    2. بمجرد تحديد عائد الاستثمار ، اختر الدقة المكانية وفقا للوقت المتاح للاكتساب.
      ملاحظة: الدقة المكانية محدودة بحد الحيود (~ 500 نانومتر).
    3. ابدأ عملية الاستحواذ على تعيين رامان.
  3. المعالجة المسبقة للبيانات:
    1. باستخدام بيئة تطوير Python المتكاملة (IDE) (على سبيل المثال ، Spyder) ، افتح الملف الذي يحتوي على الأطياف.
    2. اطرح خط الأساس للأطياف لتصحيح التداخل من التألق المحتمل. على سبيل المثال ، استخدم وظيفة "arpls" من الحزمة "irfpy"23. اختبر قيما مختلفة للمعلمة "lam" للعثور على القيم التي تعطي أفضل تصحيح أساسي (عادة بين 103 و 107).
    3. تطبيع الأطياف ، على سبيل المثال ، بقسمة جميع شدة الطيف على شدته عند 2900 سم − 1 أو بطرح متوسط الطيف ثم قسمته على انحرافه المعياري (تطبيع "المتغير الطبيعي القياسي").
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لمقارنة التركيب الجزيئي النسبي للمركبات الكهربائية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تحديد ظروف الأس الهيدروجيني المثلى لتطعيم الليجند
يتم اختبار الروابط المختلفة المستخدمة لإعداد الرقائق الحيوية كدالة للأس الهيدروجيني وتوافرها للتفاعل مع الطبقة الكيميائية الثيولات (الشكل 3). يتم تخفيف الروابط في محلول الأسيتات عند قيم أس هيدروجيني مختلفة وي?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الطرق الحديثة لتحديد EV الأكثر استخداما هي النشاف المناعي الخاص بالبروتين لتأكيد أصل EVs ، TEM لتأكيد هيكلها ، و NTA لتحديد توزيعها على العدد والحجم في حجم العينة3. ومع ذلك ، فإن الاهتمام الكبير بالمركبات الكهربائية في البحوث الطبية (الحيوية) والقيود المفروضة على الأدوات التحليلية...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم تكريم كيلي أوبرتين وفابيان بيكو من منشأة IVETh الأساسية (باريس) لتجارب تصوير رامان. تم الاعتراف بتييري بورنوف (جامعة تايبيه الطبية ، تايوان) وزوزانا كروبوفا (من هيلينكورت ، فرنسا) لتقديمهما عينات EV المشتقة من عينات الصفائح الدموية وحليب الأبقار ، على التوالي. تم دعم العمل من قبل منطقة بورغون فرانش كونتيه وكلية الدراسات العليا EUR EIPHI (مشروع NOVICE ، 2021-2024). تم إنجاز جزء من هذا العمل باستخدام منصة CLIPP وفي مرافق الغرف النظيفة RENATECH في FEMTO-ENGINEERING ، والتي نشكر عليها رابح زقاري.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CD41a antibodyDiaclone SAS (France)447528
CP920Microparticles GmbH, Germany448303
DXR3xi Thermo Fisher ScientificT1502
EDCSigmaA6272
EthanolamineSigmaP5368-10PAK
Evs derived from platelet concentratesCollaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei)S2889
Evs from bovine milkCollaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France)3450
GlutaraldehydeSigma56845
Gwyddion 853.223.020
Magnetron sputteringPLASSYSSAB5300165
mercapto-1-hexadecanoic acidSigmaG5882
Mercapto-1-undecanol SigmaO8001
Mountains SPIP onesDigital Surf
NanoWizard 3 Bioscience Bruker-JPK 
Octyl Glucoside (OG) Sigma
Ovalbumine antibodySigma
Phosphate Buffer Saline (PBS)Sigma
Rat Albumin Serum (RSA)Sigma
Sodium acetate buffer Sigma
SPR-Biacore 3000GE Healthcare/ Cytiva life sciences
SPRi BiochipMIMENTO technology platformThe biochips were produced in-house in the clean room, Besancon
SPRi Plex IIHoriba Scientific 
Sulfo-NHSSigma

References

  1. Silva, A. K. A., et al. Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group "Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France". Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001(2021).
  2. Xunian, Z., Kalluri, R. Biology and therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes. Cancer Science. 111 (9), 3100-3110 (2020).
  3. Hartjes, T. A., et al. Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches. Bioengineering. 6 (1), 7(2019).
  4. Xing, Y., et al. Analysis of extracellular vesicles as emerging theranostic nanoplatforms. Coordination Chemistry Reviews. 424, 213506(2020).
  5. Wang, T., Xing, Y., Cheng, Z., Yu, F. Analysis of single extracellular vesicles for biomedical applications with especial emphasis on cancer investigations. Trends in Analytical Chemistry. 152, 116604(2022).
  6. Boireau, W., Elie-Caille, C. Extracellular vesicles: Definition, isolation and characterization. Medecine Sciences: M/S. 37 (12), 1092-1100 (2021).
  7. Brisson, A. R., et al. Extracellular vesicles from activated platelets: A semiquantitative cryo-electron microscopy and immuno-gold labeling study. Platelets. 28 (3), 263-271 (2017).
  8. Yuana, Y., et al. Atomic force microscopy: A novel approach to the detection of nanosized blood microparticles. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (2), 315-323 (2010).
  9. Sebaihi, N., de Boeck, B., Yuana, Y., Nieuwland, R., Pétry, J. Dimensional characterization of extracellular vesicles using atomic force microscopy. Measurement Science and Technology. 28 (3), 034006(2017).
  10. Beekman, P., et al. Immuno-capture of extracellular vesicles for individual multi-modal characterization using AFM, SEM and Raman spectroscopy. Lab on a Chip. 19 (15), 2526-2536 (2019).
  11. Malenica, M., et al. Perspectives of microscopy methods for morphology characterisation of extracellular vesicles from human biofluids. Biomedicines. 9 (6), 603(2021).
  12. Verweij, F. J., et al. The power of imaging to understand extracellular vesicle biology in vivo. Nature Methods. 18 (9), 1013-1026 (2021).
  13. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  14. Obeid, S., et al. NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: A tool to improve transfusion safety. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 101977(2019).
  15. Obeid, S., et al. Development of a NanoBioAnalytical platform for «on-chip» qualification and quantification of platelet-derived microparticles. Biosensors and Bioelectronics. 93, 250-259 (2017).
  16. Ridolfi, A., et al. AFM-based high-throughput nanomechanical screening of single extracellular vesicles. Analytical Chemistry. 92 (15), 10274-10282 (2020).
  17. Vorselen, D., et al. The fluid membrane determines mechanics of erythrocyte extracellular vesicles and is softened in hereditary spherocytosis. Nature Communications. 9 (1), 4960(2018).
  18. Hardij, J., et al. Characterisation of tissue factor bearing extracellular vesicles with AFM: Comparison of air-tapping-mode AFM and liquid Peak Force AFM. Journal of Extracellular Vesicles. 2, 21045(2013).
  19. Jorgensen, M., et al. Extracellular Vesicle (EV) Array: Microarray capturing of exosomes and other extracellular vesicles for multiplexed phenotyping. Journal of Extracellular Vesicles. 2, 20920(2013).
  20. Remy-Martin, F., et al. Surface plasmon resonance imaging in arrays coupled with mass spectrometry (SUPRA-MS): Proof of concept of on-chip characterization of a potential breast cancer marker in human plasma. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (2), 423-432 (2012).
  21. Czamara, K., et al. Raman spectroscopy of lipids: A review. Journal of Raman Spectroscopy. 46 (1), 4-20 (2015).
  22. Penders, J., et al. Single particle automated Raman trapping analysis of breast cancer cell-derived extracellular vesicles as cancer biomarkers. ACS Nano. 15 (11), 18192-18205 (2021).
  23. Baek, S. J., Park, A., Ahn, Y. J., Choo, J. Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing. Analyst. 140 (1), 250-257 (2015).
  24. Daaboul, G. G., et al. Digital detection of exosomes by interferometric imaging. Scientific Reports. 6, 37246(2016).
  25. Ertsgaard, C. T., et al. Integrated nanogap platform for sub-volt dielectrophoretic trapping and real-time Raman imaging of biological nanoparticles. Nano Letters. 18 (9), 5946-5953 (2018).
  26. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved