Plataforma Analítica Multimodal em um Chip de Ressonância de Plasmon de Superfície Multiplexada para a Análise de Subconjuntos de Vesículas Extracelulares

Resumo

Este trabalho propõe uma nova geração de plataformas analíticas multiparamétricas com maior rendimento para a caracterização de subconjuntos de vesículas extracelulares. O método é baseado em uma combinação de métodos de biossensoriamento multiplexado com análises metrológicas e morfomecânicas por microscopia de força atômica, juntamente com espectroscopia Raman, para qualificar alvos vesiculares presos em um biochip de microarray.

Resumo

As vesículas extracelulares (EVs) são minúsculas vesículas derivadas de membrana produzidas por todas as células que variam de 50 a várias centenas de nanômetros de diâmetro e são usadas como meio de comunicação intercelular. Eles estão emergindo como ferramentas diagnósticas e terapêuticas promissoras para uma variedade de doenças. Existem dois processos principais de biogênese usados pelas células para produzir EVs com diferenças de tamanho, composição e conteúdo. Devido à sua alta complexidade em tamanho, composição e origem celular, sua caracterização requer uma combinação de técnicas analíticas. Este projeto envolve o desenvolvimento de uma nova geração de plataformas analíticas multiparamétricas com maior rendimento para a caracterização de subpopulações de VEs. Para atingir esse objetivo, o trabalho parte da plataforma nanobioanalítica (NBA) estabelecida pelo grupo, que permite uma investigação original de EVs com base em uma combinação de métodos de biossensoriamento multiplexados com análises metrológicas e morfomecânicas por microscopia de força atômica (AFM) de alvos vesiculares presos em um biochip de microarray. O objetivo foi completar esta investigação de EV com uma análise fenotípica e molecular por espectroscopia Raman. Esses desenvolvimentos permitem a proposta de uma solução analítica multimodal e fácil de usar para a discriminação de subconjuntos de EV em fluidos biológicos com potencial clínico

Introdução

O crescente interesse na pesquisa de EV em diagnóstico e terapêutica 1,2,3,4,5, aliado aos desafios enfrentados por esse campo^, resultou no desenvolvimento e implementação de uma grande variedade de abordagens e técnicas para quantificar ou caracterizar essas vesículas. Os métodos mais utilizados para a identificação de EV são imunoblotting e proteômica específicos de proteínas para confirmar a origem dos EVs, microscopia eletrônica de transmissão (MET) para confirmar sua estrutura e análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) para quantificar sua distribuição de número e tamanho em um volume de amostra.

Nenhuma dessas técnicas, por si só, no entanto, fornece todas as informações necessárias para caracterizar os subconjuntos de EV. A heterogeneidade inerente dos VEs devido à diversidade em suas propriedades bioquímicas e físicas impede análises globais confiáveis e reprodutíveis, especialmente para EVs contidos em uma mistura (amostra bruta). Métodos de detecção e caracterização são, portanto, necessários para os VEs, tanto individualmente quanto em geral, para complementar outros métodos mais rápidos, mas não seletivos⁶.

A imagem de alta resolução por MET (ou cryoTEM) ou AFM permite a determinação da morfologia e metrologia de EVs com resolução nanométrica 7,8,9,10,11,12. No entanto, a principal limitação do uso da microscopia eletrônica para objetos biológicos, como os EVs, é a necessidade de um vácuo para realizar o estudo, o que requer a fixação e desidratação da amostra. Tal preparo dificulta a tradução das estruturas observadas para a morfologia do VE em solução. Para evitar essa desidratação da amostra, a técnica de crioTEM é a mais adequada para caracterização do VE¹³. É amplamente utilizado para determinar a ultraestrutura dos VEs. A imunomarcação de vesículas por nanopartículas de ouro biofuncionalizadas também permite identificar subpopulações específicas de EVs e distingui-las de outras partículas presentes em uma amostra biológica complexa. No entanto, devido ao baixo número de EVs analisados por microscopia eletrônica, muitas vezes é difícil realizar uma caracterização que seja representativa de uma amostra complexa e heterogênea.

Para revelar essa heterogeneidade de tamanho, a International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) sugere a análise de um número suficiente de imagens de campo amplo, acompanhadas de imagens menores, para revelar EVs individuais com alta resolução¹⁴. O AFM é uma alternativa às abordagens ópticas e técnicas de difração eletrônica para o estudo de VEs. Esta técnica usa uma ponta afiada mantida por um cantilever flexível que digitaliza a amostra depositada em um suporte, linha por linha, e ajusta a distância entre a ponta e os elementos presentes através de um loop de feedback. Isso permite caracterizar a topografia da amostra e coletar informações morfomecânicas^15,16,17,18. Os EVs podem ser escaneados por AFM após serem depositados em um substrato atomicamente plano ou após terem sido capturados em um substrato específico funcionalizado por anticorpos, peptídeos ou aptâmeros para caracterizar as várias subpopulações^18,19. Devido à sua capacidade de quantificar e sondar simultaneamente a estrutura, a biomecânica e o conteúdo biomolecular membranoso de EVs dentro de amostras biológicas complexas sem a necessidade de pré-tratamento, marcação ou desidratação, o AFM é agora cada vez mais usado para caracterizar EVs de maneira fina e multiparamétrica sob condições fisiológicas de temperatura e meio.

Este trabalho propõe uma metodologia utilizando um núcleo de biochip de ouro capaz de ser (bio)quimicamente funcionalizado em um formato multiplexado. Este substrato é a pedra angular de uma poderosa plataforma analítica que combina a biodetecção de subconjuntos de EV por ressonância plasmônica de superfície e, uma vez que os EVs são adsorvidos / enxertados ou imunocapturados no chip, o AFM permite a caracterização metrológica e morfomecânica dos EVs. Juntamente com a assinatura Raman dos subconjuntos EV capturados no chip, esta plataforma analítica permite a qualificação dos EVs presentes em amostras biológicas de forma livre de rótulo e sem qualquer necessidade de etapas pré-analíticas. Este trabalho mostra que a combinação de técnicas poderosas, auxiliadas por uma metodologia altamente rigorosa na preparação de substratos e aquisição de dados, torna a análise de EV profunda, definitiva e robusta.

O princípio da abordagem proposta é preparar um substrato de ouro, adsorver/enxertar ou capturar os subtipos de EV e digitalizá-los por AFM para estimar o tamanho e a morfologia de cada subconjunto de EV. Além disso, esses EVs adsorvidos são analisados por espectroscopia Raman. Esse substrato pode, de fato, apresentar três tipos de interfaces de complexidade crescente: microarrays nus, quimicamente funcionalizados ou ligantes. Antes de descrever as diferentes etapas do protocolo, os leitores são encaminhados para a apresentação esquemática da abordagem da plataforma nanobioanalítica (NBA) na Figura 1, combinando ressonância plasmônica de superfície (SPRi), AFM e espectroscopia.

Figura 1: A plataforma NanoBioAnalítica. A abordagem combina (A) ressonância plasmônica de superfície, (B) microscopia de força atômica e (nano)espectroscopia de infravermelho/Raman, todos engajados no mesmo substrato - um chip de ouro multiplexado. Abreviaturas: NBA = plataforma NanoBioAnalítica; SPRi = ressonância plasmônica de superfície; AFM = microscopia de força atômica; EV = vesícula extracelular. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O biochip de ouro principal constitui o coração da plataforma, uma vez que todas as técnicas de caracterização sem rótulo são conduzidas neste biochip. De acordo com as necessidades de caracterização do EV (global/total de EVs ou subconjuntos de EV) e as limitações/demandas dos métodos utilizados, três tipos de superfícies de biochip de ouro foram desenvolvidas: ou "nuas", quimicamente funcionalizadas "C11/C16", ou ligantes-biofuncionalizadas, chamadas de superfície de ouro "ligante".

O biochip nu, chamado de "nu", permite a simples adsorção de EVs em ouro. É possível selecionar o tampão utilizado e realizar essa adsorção de forma passiva (etapas de incubação e depois enxágue) ou monitorá-lo sob fluxo (em SPRi). Além disso, essa adsorção passiva pode ser realizada em todo o chip (como um macroarray) ou localizada em microarrays usando um spotter de micropipeta. O "procedimento sob fluxo" permite que os investigadores acompanhem a cinética e o nível de adsorção do EV. Essa abordagem no substrato de ouro nu é adotada quando a interface da camada química pode interferir no método analítico (por exemplo, para espectroscopia Raman).

O biochip quimicamente funcionalizado, chamado "C11/C16", é usado para criar um "tapete" denso e robusto de EVs covalentemente ligados na superfície do ouro, formando ligações amidas primárias com os tiolatos quando o objetivo é ter uma visão global da amostra de EV. De fato, neste caso, o ouro é funcionalizado por uma mistura de tiolato de mercapto-1-undecanol (11-MUOH: "C11") e ácido mercapto-1-hexadecanóico (16-MHA: "C16"), e uma fração dos tiolatos é quimicamente ativada para estabelecer ligação covalente com os alvos. Novamente, essa estratégia pode ser realizada passivamente (etapas de incubação e depois enxágue, seja em "macroarray" ou em vários microarrays usando um observador de micropipetas) ou sob taxas de fluxo (em SPRi) para seguir a cinética e o nível de enxerto de EV na superfície de ouro.

O biochip biofuncionalizado por ligante, chamado de "ligantes", é quimicamente ativado para enxertar covalentemente diferentes ligantes (por exemplo, anticorpos, receptores) para capturar seletivamente (com afinidade) diferentes subconjuntos de EV que coexistem na amostra biológica.

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Protocolo

1. Preparação do substrato de ouro

NOTA: Três tipos de superfícies são produzidas em lascas de ouro: 1) superfície nua, 2) quimicamente funcionalizada e 3) biofuncionalizada (ligantes enxertados na camada C11C16). Eles serão chamados de "nus", "C11C16" e "ligantes", respectivamente, a partir deste ponto.

1. Preparação do substrato de ouro:
   NOTA: Para este protocolo, os biochips de ouro foram fabricados internamente na sala limpa. Os biochips caseiros foram compostos por lâminas de vidro (SF11) com revestimento de cromo (2 nm Cr) e ouro (48 nm Au). O comprimento do biochip foi de 28 mm, a largura foi de 12,5 mm e a espessura foi de 0,5 mm²⁰.
   1. Use magnetron DC sputtering¹⁵ para revestir as lâminas por deposição física de vapor (PVD).
2. Funcionalização química:
   1. Funcionalizar os chips nus incubando-os durante a noite em uma mistura de 90%/10% por mole de mercapto-1-undecanol (11-MUOH: C11) e ácido mercapto-1-hexadecanóico (16-MHA: C16) a 1 mM em etanol absoluto, sob agitação e à temperatura ambiente.
      NOTA: Esta etapa formará uma monocamada (SAM) estável e automontada, que é útil no enxerto dos ligantes.
   2. Limpe o biochip (lave suavemente) com etanol absoluto e água ultrapura, seque-o sob nitrogênio e armazene-o em condições de sala limpa.
   3. Ativação do biochip quimicamente funcionalizado:
      NOTA: A partir desta etapa, os experimentos devem ser realizados em um laboratório analítico.
      1. Limpe o biochip com água ultrapura, lavando-o suavemente e, em seguida, seque o chip sob um fluxo de ar suave. Para ativar os grupos carboxílicos C16, incubar o biochip em uma mistura de 200 mM de carbodiimida de etila (dimetilaminopropil) / N-hidroxisuccinimida (EDC) e 50 mmol / L de N-hidroxisuccinimida (Sulfo-NHS) por pelo menos 30 min no escuro à temperatura ambiente. Em seguida, enxágue com água antes dos experimentos de enxerto.
3. Enxerto dos ligantes no biochip funcionalizado:
   NOTA: A imobilização dos ligantes (ou EVs para alguns experimentos) no chip pode ser feita passivamente fora do instrumento SPRi (incubação de uma gota no chip ativado) ou dinamicamente sob o fluxo para o instrumento SPRi. Isso constitui os chips modificados por EV ou ligantes. A Figura 2 apresenta o biochip de ouro, o observador de micropipeta e o biochip após a mancha com 16 gotículas de ligante de 300 nL cada.
   1. Para o enxerto de ligantes, use moléculas como anticorpos (por exemplo, imunoglobulinas-antiCD41 [específicas para EVs derivadas de plaquetas sanguíneas nativas, chamadas N-PEVs], antiCD61, antiCD62P, antiCD9 e antiOVA [anticorpo de controle contra a ovalbumina]) e Anexina V. Dilua-as a 200 μg/mL em uma solução ácida (de pH 4,5 a 6, dependendo do pH ideal para atividade ou função do ligante).
      NOTA: O pH ótimo para o enxerto de anticorpos foi determinado previamente por experimentos de pré-concentração realizados em um instrumento SPR para a determinação do pH ótimo para enxerto de ligantes (ver Figura 3). À medida que as condições de enxerto mudam com os clones de anticorpos que são usados, recomenda-se determinar essas condições antes de prosseguir com os experimentos SPRi.
   2. Para o procedimento de enxerto, adicione 300 nL de EVs/solução de ligante usando o spotter.
      NOTA: Um pedaço de papel submerso em água deve ser mantido nos poços esquerdo e direito para evitar a evaporação de gotículas. Esta etapa é importante para manter os EVs/ligantes em suas condições ideais de estabilidade e funcionalidade.
   3. Após a mancha, mantenha o biochip sob um banho sônico (frequência: 37 kHz, potência: 30%) por uma incubação de 30 minutos. Lave o biochip de cima com água ultrapura e coloque-o suavemente em um prisma com o mesmo índice de refratividade (IR) que o biochip. Ao ajustar o biochip na parte superior do prisma, adicione uma gota (~ 2,3 μL) de óleo com o mesmo IR que o prisma para criar uma camada uniforme e fina entre o biochip e o prisma.
      NOTA: Esta etapa garante um meio contínuo do mesmo RI no caminho óptico. É importante evitar a incorporação de bolhas na camada de óleo nesta etapa, pois isso alterará as propriedades ópticas no caminho e dificultará uma análise mais aprofundada.

Figura 2: Biochip e spotter manual. Biochip de ouro (esquerda), observador de micropipeta (meio) e o biochip após a mancha com gotículas de ligante de 300 nL cada (direita). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Testes de pré-concentração para determinar o pH ideal para enxerto de ligantes. O sensorgrama apresenta o nível de interação em função do tempo para um ligante injetado aleatoriamente (em diferentes valores de pH) na mesma concentração durante 2 min na superfície. OG é o detergente, que permite que a linha de base seja recuperada entre cada injeção. Aqui, o sensorgrama indica que o pH 6 permitiu a maior enxertia de ligantes, com um sinal SPRi de 1091 RU. Abreviaturas: OG = octil glicosídeo; RU = unidade de resposta. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Ressonância plasmônica de superfície

1. Monte o biochip no sistema SPRi. Mantenha a taxa de fluxo do buffer PBS (buffer em execução) em 50 μL/min.
   NOTA: Se houver bolhas, aumente a taxa de fluxo até 500-1.000 μL / min e injete 40 mM de glicosídeo octil (OG) com frequência para removê-las o mais rápido possível.
2. Condicionamento do biochip de ouro no instrumento SPRi: Escolha dos ângulos de trabalho
   1. Clique no menu suspenso no lado esquerdo do software e clique no diretório de trabalho para definir a pasta onde os dados experimentais devem ser salvos. Depois, clique em Plasmon | Aquisição de imagens.
   2. Localize a imagem (como mostra a Figura 4A) onde diferentes pontos estão visíveis e clique para selecioná-la. Para definir a região de interesse (ROI), conforme representado na Figura 4, clique em detecção automática ou definição manual dentro dos pontos (Figura 4B) ou no chip para se referir a um local específico mesmo sem pontos (Figura 4C),.
   3. Quando biochips multiplexados são usados, escreva o nome das famílias de ligantes e, em seguida, clique nos pontos correspondentes.
      NOTA: Uma família de ligantes corresponde a vários pontos funcionalizados com o mesmo ligante. Normalmente, o chip apresenta pelo menos duplicatas e até triplicados de cada ligante.
   4. Clique na definição da espécie de acabamento e aguarde para ser direcionado para a janela que contém as curvas plasmônicas obtidas.
   5. Escolha um ângulo de trabalho. Arraste a linha preta com o cursor para o ângulo de trabalho ideal e clique em Mover espelho para o ângulo de trabalho.
      NOTA: A curva plasmônica consiste no valor da refletividade (%) versus o ângulo, e o software fornece outra curva com o valor da inclinação (%) versus o ângulo. Para selecionar um bom ângulo de trabalho, escolha o ângulo com o maior valor da inclinação.
      1. No caso de um passo passivante (por causa da albumina) realizado no interior do aparelho, selecione um ângulo de trabalho para obter a sensibilidade ideal em relação à superfície, estabelecendo assim um controle de qualidade da reatividade da superfície.
         NOTA: Esta etapa de passivação é importante quando o chip é preparado para biodetecção de afinidade/captura para reduzir interações não específicas entre a amostra e a superfície do biochip.
3. Clique em Cinética para iniciar o monitoramento cinético em tempo real. Uma vez que o software solicita ao usuário para definir o controle negativo, escolha nenhum controle negativo neste momento (pois isso permitirá a observação da cinética nos pontos de controle negativos).
   1. Injetar albumina sérica de ratos (RSA, 200 μg/mL, preparada em tampão acetato, pH 4,5) a 50 μL/min por 4 min para passivar a superfície ao redor dos pontos e, possivelmente, para preencher espaços vazios dentro dos pontos de ligante.
      NOTA: O RSA é injetado para cobrir o biochip, que não está ligado a nenhum ligante.
   2. Injetar etanolamina (1 M) a 20 μL/ min por 10 min para desativar os grupos carboxílicos ainda presentes e reativos na superfície.
   3. Lave o biochip injetando 40 mM OG a 50 μL/ min por 4 min.
      NOTA: Após a etapa de passivação, o ângulo de trabalho é ajustado (como uma nova determinação de linha de base antes da injeção da amostra) para estar na sensibilidade mais alta nos pontos de interesse.
4. Injeção de amostra:
   1. Redefina as curvas plasmônicas após a passivação e escolha o ângulo de trabalho de acordo com o ligante desta vez.
   2. No monitoramento cinético, reduza a taxa de fluxo para 20 μL/min e aguarde que a linha de base fique estável.
   3. Injete a amostra em uma concentração de escolha (de 1 x 10 8 EVs/mL a 1 x 10¹⁰ EVs/mL, dependendo da afinidade entre os EVs e os ligantes enxertados) e clique em injeção manual ou injeção automática. No caso de injeção manual, depois de injetar 200 μL da amostra, clique em parar a injeção. Como a duração da injeção é geralmente de 10 min, comece a seguir a cinética da interação e meça a variação da refletividade calculando a diferença na refletividade entre o início e o final da injeção observada durante o monitoramento cinético (Figura 5).
      NOTA: As diferentes amostras que foram injetadas são descritas na seção de resultados representativos.
5. Após a injeção da amostra, siga uma destas duas abordagens para concluir o experimento SPRi:
   1. Na abordagem não fixa/ em líquido, retire o biochip do aparelho SPRi, adicione uma gota líquida sobre ele e prossiga para uma caracterização AFM adicional da superfície em líquido.
   2. Na abordagem fixa , injetar glutaraldeído (0,5%) diluído em água a 20 μL/ min por 10 min para fixar as moléculas capturadas no biochip. Injete água para enxaguar a superfície, retire o biochip, lave-o muito suavemente com água destilada e seque-o ao ar para ser analisado mais detalhadamente sob AFM.

Figura 4: Imagem SPRi CCD do biochip. (A,B) Biochip multiplexado após passivação de albumina. (A) Um chip sem padrão; (B) alguns defeitos que apareceram no chip: fusão de manchas (i), enxerto fraco (ii), ou poeira ou "contaminantes" (iii). Os ROIs, em cor nas manchas (uma cor por família de ligantes), foram escolhidos para evitar esses "contaminantes". Quando as manchas se fundiam, elas eram notadas e ignoradas ou nomeadas como "mistura de ligantes 1 e 2". (C) Chip de ouro nu sem microarrays para o experimento que examina a adsorção de EVs em ouro. A seta azul indica a direção do fluxo. Esse chip não apresentava manchas, e as ROIs foram escolhidas para registrar o sinal de refletividade da linha 1 (L1, círculos vermelhos) para a linha 4 (L4, círculos roxos) durante a injeção da amostra. Barra de escala = 1 mm para as três imagens. Abreviaturas: SPRi = ressonância plasmônica de superfície; CCD = dispositivo de carga acoplada; ROIs = regiões de interesse; EVs = vesículas extracelulares. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Experimentos SPRi de injeção de EV em um biochip. (A) Experimento de captura em um biochip multiplexado mostrando os sinais de refletividade de diferentes ligantes. Aqui, a relação sinal-ruído para os diferentes ligantes foi muito boa (e especialmente nos pontos antiCD41), uma vez que a resposta do controle negativo foi insignificante. (B) Experimento de adsorção de EVs em um biochip nu. Sensorgrama apresentando o condicionamento do chip com duas descargas de tampão e limpeza OG (1), com a injeção de amostra EV (2) e o sinal de refletividade após interação EV (3). Neste biochip, não houve controle negativo, mas o sinal de refletividade (sua cinética, sua estabilidade após a injeção) foi alto, o que significa que esses EVs foram capazes de adsorver e permanecer estáveis no chip de ouro. Abreviaturas: EV = vesícula extracelular; OG = octil glicosídeo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Microscopia de força atômica

1. Use o modo de contato para digitalizar o biochip no ar e o modo de imagem quantitativa para digitalizar o biochip em condições líquidas.
2. Alinhar o biochip na parte superior da máscara na lâmina de vidro (desenvolvida em laboratório) para identificar a posição dos respectivos micropontos no biochip (Figura 6A).
   NOTA: A máscara contém as marcações das manchas, que correspondem às posições das manchas dos ligantes de acordo com o spotter utilizado. Esta máscara consiste em uma lâmina de vidro na qual duas cunhas perpendiculares permitem a colocação do chip. Além disso, a lâmina de vidro é marcada com 16 pontos de feltro correspondentes à localização pontual no chip, o que permite, por transparência, localizar os pontos e escanear a área desejada.
3. Posicionamento da ponta:
   1. Use uma câmera CCD na parte superior do AFM para localizar o cantilever no local correto que deve ser digitalizado. Para seguir este protocolo, use balanços triangulares de 200 μm de comprimento, 28 μm de largura e uma constante de mola de 0,08 N/m.
4. Alinhe o laser na parte superior do cantilever em uma posição que dê uma resposta ideal no mecanismo de controle de feedback.
5. Escaneamento:
   1. Uma vez engajado e em contato com a superfície do biochip, inicie a aquisição do AFM no modo de contato ou no modo de imagem quantitativa de três a cinco grandes áreas (tipicamente 10 × 10 μm²) para pequenas áreas (1 x 1 μm²).
      NOTA: Uma representação das diferentes áreas que podem ser verificadas é mostrada na Figura 6D. Garantir que a caracterização do AFM seja representativa de todo o ponto mm² e que EVs suficientes sejam visualizados em uma boa resolução para uma análise robusta (um mínimo de 300 EVs contados e analisados para cada condição) e realizar as medições de metrologia e morfologia.
6. Tratamento de imagem AFM:
   1. Trate as imagens AFM com o software de processamento de dados JPK selecionando primeiro o canal de altura.
   2. Escolha um ajuste polinomial a ser subtraído de cada linha para obter linhas de varredura endireitadas.
   3. Selecione o limite de altura em grãos de ouro para eliminar a rugosidade da superfície. No software referenciado (consulte a Tabela de Materiais), dentro do módulo de extração de grãos, marque os grãos usando um valor limite de altura de 8,5 nm. Uma vez que os grãos foram filtrados, o número de grãos aparece.
      NOTA: Normalmente, o substrato de ouro bruto (RMS de ~3 nm) e a presença das camadas químicas e de ligantes requerem que o limiar seja definido em 8,5 nm.
   4. Para extrair várias propriedades dos grãos marcados, como altura, volume e diâmetro, abra a imagem no software referenciado e selecione o tratamento de dados | Grãos | Marque por limite.
   5. Escolha grãos de filtro na função de propriedades. Quando uma nova janela for exibida, escolha os seguintes parâmetros: Valor = z-max máximo, Superfície = superfície projetada A_0. Em seguida, escolha os critérios A E B.
   6. Distribuição aberta de grãos; na janela exibida, escolha valor (máximo), volume (base: zero) e limite (comprimento). Observe a tabela (em formato .txt) que aparece, que apresenta três colunas com os valores de altura, volume e diâmetro para todos os grãos detectados no limite definido por imagem.
   7. A partir da altura, h e diâmetro, D, calcule o raio de curvatura, Rc, de cada EV usando a equação (1)⁸ e, em seguida, calcule o volume, V, usando a equação (2):
      (1)
      (2)
   8. A partir de V, calcular o diâmetro efetivo, d _eff, de cada EV (o diâmetro de uma esfera com o mesmo volume) usando a equação (3):
      (3)
   9. Gráficos de gráficos mostrando os tamanhos (altura medida, diâmetro medido e diâmetro efetivo calculado) dos EVs, com cada partícula contada representada por um ponto.
      NOTA: Assim, ao final da caracterização, a plataforma NBA possibilita a correlação do sinal de biodetecção e, em seguida, a fenotipagem, com os números e tamanhos dos subconjuntos de EV.

Figura 6: Caracterização do biochip por AFM. Após o experimento SPRi, o cavaco foi fixado e seco ou mantido em líquido para caracterização da AFM. (A) A lâmina de vidro usinado (com duas cunhas de posicionamento perpendiculares, indicadas com um "w" na figura) apresentando um encaixe de máscara com a localização dos 16 microarrays de biochip. Por exposição à luz e transparência, uma vez instalada para a caracterização do AFM, a lâmina de vidro permite que a ponta do AFM seja colocada no local desejado para caracterizá-la. (B) O biochip instalado na lâmina "máscara" e sob uma gota de tampão para varredura em condições líquidas. (C) Imagem SPRi dos 16 microarrays. (D) Um microarray fotografado por microscopia óptica após a imunocaptura de nanopartículas de calibração biofuncionalizadas de 920 nm de diâmetro. Os quadrados brancos indicam a amostragem das diferentes áreas escaneadas pelo AFM em cada ponto de interesse para tornar a caracterização do AFM robusta. Barras de escala = (C) 1 mm, (D) 500 μm. Abreviaturas: AFM = microscopia de força atômica; SPRi = ressonância plasmônica de superfície. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Espectroscopia Raman

NOTA: Para espectroscopia Raman, substitua a lâmina de vidro usada como substrato por uma lâmina de CaF₂, que tenha uma assinatura Raman insignificante.

1. Condições ópticas para a aquisição:
   1. Defina as seguintes condições para o microscópio de imagem Raman: objetiva do microscópio: 50x; comprimento de onda do laser: 532 nm; potência do laser: 10 mW; tempo de exposição: 500 ms; número de acúmulos: 140; faixa espectral: de 450 cm−1 a 3.200 cm⁻¹.
      NOTA: O uso de muita energia e/ou um tempo de aquisição muito longo pode levar a danos à amostra, evidenciados por espectros instáveis ao longo do tempo. Comece com uma baixa quantidade de energia e aumente isso se o sinal for muito fraco. Comprimentos de onda de laser mais altos podem ser usados (633 nm, 785 nm) para reduzir a fluorescência prejudicial às medições Raman. No entanto, a intensidade diminui com a quarta potência do comprimento de onda, e a sensibilidade espectral da câmera deve ser considerada.
2. Imagem Raman:
   1. Primeiro, observe os espectros ao vivo com um número reduzido de acúmulos (10) para encontrar a área com a melhor relação sinal-ruído.
      NOTA: Um sinal forte na região de alta frequência (2.800-3.000 cm⁻¹) pode facilitar a detecção de EVs na superfície com baixos tempos de exposição, como mostrado anteriormente¹⁰.
   2. Uma vez selecionado o ROI, escolha a resolução espacial de acordo com o tempo disponível para a aquisição.
      NOTA: A resolução espacial é limitada pelo limite de difração (~500 nm).
   3. Inicie a aquisição de mapeamento Raman.
3. Pré-processamento de dados:
   1. Usando um ambiente de desenvolvimento integrado Python (IDE) (por exemplo, Spyder), abra o arquivo que contém os espectros.
   2. Subtraia a linha de base dos espectros para corrigir a interferência de uma possível fluorescência. Por exemplo, use a função "arpls" do pacote "irfpy"²³. Teste diferentes valores do parâmetro "lam" para encontrar aquele que dá a melhor correção de linha de base (geralmente entre 10³ e 10⁷).
   3. Normalize os espectros, por exemplo, dividindo todas as intensidades de um espectro por sua intensidade a 2.900 cm⁻¹ ou subtraindo a média do espectro e, em seguida, dividindo-o por seu desvio padrão (normalização "normal padrão").
      NOTA: Esta etapa é necessária para comparar a composição molecular relativa dos VEs.

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Resultados

Determinação das condições ótimas de pH para enxerto de ligantes
Os diferentes ligantes utilizados para o preparo dos biochips são testados em função do pH e de sua disponibilidade para interagir com a camada química tiolato (Figura 3). Os ligantes são diluídos em tampão acetato em diferentes valores de pH e injetados no biochip quimicamente funcionalizado com uma camada C11C16. As soluções são injetadas aleatoriamente na superfície e um detergente (OG a 4...

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Discussão

Os métodos recentes para identificação de EV que são os mais amplamente utilizados são imunoblotting específico de proteína para confirmar a origem de EVs, TEM para confirmar sua estrutura e NTA para quantificar seu número e distribuição de tamanho em um volume de amostra³. No entanto, o alto interesse em VEs em pesquisa (bio)médica e as limitações das ferramentas analíticas existentes levaram a comunidade científica a desenvolver novos métodos para caracterização, discriminaçã...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD41a antibody	Diaclone SAS (France)	447528
CP920	Microparticles GmbH, Germany	448303
DXR3xi	Thermo Fisher Scientific	T1502
EDC	Sigma	A6272
Ethanolamine	Sigma	P5368-10PAK
Evs derived from platelet concentrates	Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei)	S2889
Evs from bovine milk	Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France)	3450
Glutaraldehyde	Sigma	56845
Gwyddion		853.223.020
Magnetron sputtering	PLASSYS	SAB5300165
mercapto-1-hexadecanoic acid	Sigma	G5882
Mercapto-1-undecanol	Sigma	O8001
Mountains SPIP ones	Digital Surf
NanoWizard 3 Bioscience	Bruker-JPK
Octyl Glucoside (OG)	Sigma
Ovalbumine antibody	Sigma
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma
Rat Albumin Serum (RSA)	Sigma
Sodium acetate buffer	Sigma
SPR-Biacore 3000	GE Healthcare/ Cytiva life sciences
SPRi Biochip	MIMENTO technology platform		The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon
SPRi Plex II	Horiba Scientific
Sulfo-NHS	Sigma