A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
מאמר זה מציע דור חדש של פלטפורמות אנליטיות רב-פרמטריות עם תפוקה מוגברת לאפיון תת-קבוצות שלפוחית חוץ-תאיות. השיטה מבוססת על שילוב של שיטות חישה ביולוגית מרובות עם אנליזות מטרולוגיות ומורפומכניות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי, יחד עם ספקטרוסקופיית ראמאן, כדי להכשיר מטרות שלפוחיתיות הכלואות על שבב ביולוגי של מיקרו-מערך.
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן שלפוחיות זעירות שמקורן בקרום, המיוצרות על ידי כל התאים בקוטר של בין 50 לכמה מאות ננומטרים ומשמשות כאמצעי לתקשורת בין-תאית. הם מסתמנים ככלי אבחון וטיפול מבטיחים למגוון מחלות. ישנם שני תהליכי ביוגנזה עיקריים המשמשים תאים לייצור כלי רכב חשמליים עם הבדלים בגודל, בהרכב ובתוכן. בשל מורכבותם הגבוהה בגודלם, הרכבם ומוצא התא, אפיונם דורש שילוב של טכניקות אנליטיות. פרויקט זה כולל פיתוח דור חדש של פלטפורמות אנליטיות מולטי-פרמטריות עם תפוקה מוגברת לאפיון תת-אוכלוסיות של כלי רכב חשמליים. כדי להשיג מטרה זו, העבודה מתחילה מהפלטפורמה הננו-ביואנליטית (NBA) שהוקמה על ידי הקבוצה, המאפשרת חקירה מקורית של כלי רכב חשמליים המבוססת על שילוב של שיטות ביו-חישה מרובות עם ניתוחים מטרולוגיים ומורפומכניים על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) של מטרות שלפוחיתיות הכלואות על שבב ביולוגי של מיקרו-מערך. המטרה הייתה להשלים את חקירת הרכב החשמלי באמצעות ניתוח פנוטיפי ומולקולרי על ידי ספקטרוסקופיית ראמאן. פיתוחים אלה מאפשרים להציע פתרון אנליטי רב-מודאלי וקל לשימוש להבחנה בין תת-קבוצות של כלי רכב חשמליים בנוזלים ביולוגיים בעלי פוטנציאל קליני
העניין הגובר במחקר EV באבחון ובטיפולים 1,2,3,4,5, בשילוב עם האתגרים העומדים בפני תחום זה, הביאו לפיתוח ויישום של מגוון רחב של גישות וטכניקות לכימות או אפיון שלפוחיות אלה. השיטות הנפוצות ביותר לזיהוי EV הן אימונובלוטציה ספציפית לחלבון ופרוטאומיקה כדי לאשר את מקורם של כלי רכב חשמליים, מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) כדי לאשר את המבנה שלהם, וניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) כדי לכמת את מספרם ואת התפלגות גודלם בנפח דגימה.
עם זאת, אף אחת מהטכניקות הללו כשלעצמה אינה מספקת את כל המידע הדרוש כדי לאפיין תת-קבוצות של כלי רכב חשמליים. ההטרוגניות המובנית של כלי רכב חשמליים בשל הגיוון בתכונות הביוכימיות והפיזיקליות שלהם מונעת ניתוחים גלובליים אמינים וניתנים לשחזור, במיוחד עבור כלי רכב חשמליים הכלולים בתערובת (מדגם גולמי). לכן, יש צורך בשיטות איתור ואפיון עבור כלי רכב חשמליים, הן באופן פרטני והן באופן כללי כדי להשלים שיטות אחרות שהן מהירות יותר אך לא סלקטיביות6.
הדמיה ברזולוציה גבוהה על ידי TEM (או cryoTEM) או AFM מאפשרת לקבוע את המורפולוגיה והמטרולוגיה של כלי רכב חשמליים ברזולוציה ננומטרית 7,8,9,10,11,12. עם זאת, המגבלה העיקרית של השימוש במיקרוסקופ אלקטרונים עבור אובייקטים ביולוגיים, כגון EVs, היא הצורך בוואקום לביצוע המחקר הדורש קיבוע והתייבשות של הדגימה. הכנה כזו מקשה על התרגום מהמבנים שנצפו למורפולוגיה של EV בתמיסה. כדי למנוע התייבשות זו של הדגימה, הטכניקה של cryoTEM היא המתאימה ביותר לאפיון EV13. הוא נמצא בשימוש נרחב לקביעת מבנה העל של כלי רכב חשמליים. הסימון החיסוני של שלפוחיות על ידי ננו-חלקיקי זהב ביו-פונקציונליים מאפשר גם לזהות תת-אוכלוסיות ספציפיות של כלי רכב חשמליים ולהבדיל אותן מחלקיקים אחרים הנמצאים בדגימה ביולוגית מורכבת. עם זאת, בשל המספר הנמוך של כלי רכב חשמליים המנותחים במיקרוסקופ אלקטרוני, לעיתים קרובות קשה לבצע אפיון המייצג מדגם מורכב והטרוגני.
כדי לחשוף את ההטרוגניות בגודל זה, האגודה הבינלאומית לשלפוחיות חוץ-תאיות (ISEV) מציעה לנתח מספר מספיק של תמונות שדה רחב, בליווי תמונות קטנות יותר, כדי לחשוף כלי רכב חשמליים בודדים ברזולוציה גבוהה14. AFM הוא חלופה לגישות אופטיות וטכניקות עקיפה אלקטרוניות לחקר כלי רכב חשמליים. טכניקה זו משתמשת בקצה חד המוחזק על ידי מקל גמיש הסורק את הדגימה שהונחה על תמיכה אחת, שורה אחר שורה, ומתאים את המרחק בין הקצה לבין האלמנטים הנוכחים באמצעות לולאת משוב. זה מאפשר לאפיין את הטופוגרפיה של המדגם ולאסוף מידע מורפומכני15,16,17,18. ניתן לסרוק את כלי הרכב החשמליים על ידי AFM לאחר שהופקדו על מצע שטוח אטומית או לאחר שנלכדו על מצע ספציפי המתפקד על ידי נוגדנים, פפטידים או אפטמרים כדי לאפיין את תת-האוכלוסיות השונות18,19. בשל יכולתו לכמת ובו זמנית את המבנה, הביומכניקה והתכולה הביומולקולרית הממברנית של כלי רכב חשמליים בתוך דגימות ביולוגיות מורכבות ללא צורך בטיפול מקדים, תיוג או התייבשות, AFM משמש כיום יותר ויותר לאפיון כלי רכב חשמליים בצורה עדינה ורב-פרמטרית בתנאים פיזיולוגיים של טמפרטורה ומדיום.
מאמר זה מציע מתודולוגיה המשתמשת בביו-שבב זהב ליבה המסוגל להיות (ביו) פונקציונלי כימית בפורמט מרובה. מצע זה הוא אבן הפינה של פלטפורמה אנליטית רבת עוצמה המשלבת זיהוי ביולוגי של תת-קבוצות EV על ידי תהודה פלסמונית על פני השטח, וברגע שכלי הרכב החשמליים נספגים/מושתלים או נלכדים חיסון על השבב, AFM מאפשר אפיון מטרולוגי ומורפומכני של כלי הרכב החשמליים. יחד עם חתימת ראמאן של תת-קבוצות הרכב החשמלי שנלכדו על השבב, פלטפורמה אנליטית זו מאפשרת את ההסמכה של כלי הרכב החשמליים הנמצאים בדגימות ביולוגיות באופן ללא תוויות וללא כל צורך בצעדים פרה-אנליטיים. מאמר זה מראה כי השילוב של טכניקות רבות-עוצמה, בסיוע מתודולוגיה קפדנית ביותר בהכנת מצעים ורכישת נתונים, הופך את ניתוח הרכב החשמלי לעמוק, מוחלט וחזק.
העיקרון של הגישה המוצעת הוא להכין מצע זהב, לספוח/להשתיל או ללכוד את תת-הסוגים של EV, ולסרוק אותם על ידי AFM כדי להעריך את הגודל והמורפולוגיה של כל תת-קבוצה של EV. בנוסף, כלי הרכב החשמליים הנספחים מנותחים על ידי ספקטרוסקופיית ראמאן. מצע זה יכול, אכן, להציג שלושה סוגים של ממשקים בעלי מורכבות הולכת וגדלה: עירום, פונקציונלי כימית, או מיקרו-מערכי ליגנד. לפני תיאור השלבים השונים של הפרוטוקול, הקוראים מופנים להצגה הסכמטית של גישת הפלטפורמה הננו-ביואנליטית (NBA) באיור 1, המשלבת דימות תהודה פלסמוני פני השטח (SPRi), AFM וספקטרוסקופיה.
איור 1: הפלטפורמה הננו-ביואנליטית. הגישה משלבת (A) הדמיית תהודה פלסמונית על פני השטח, (B) מיקרוסקופ כוח אטומי, וספקטרוסקופיית אינפרא אדום/ראמאן (ננו), כולם עוסקים על אותו מצע - שבב זהב מרובה. קיצורים: NBA = פלטפורמה ננו-ביואנליטית; SPRi = הדמיית תהודה פלסמונית פני השטח; AFM = מיקרוסקופ כוח אטומי; EV = שלפוחית חוץ-תאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
ביו-שבב הזהב מהווה את לב הפלטפורמה מכיוון שכל טכניקות האפיון ללא תוויות מתבצעות על שבב זה. בהתאם לצרכים של אפיון הרכב החשמלי (תת-קבוצות גלובליות/כלל של כלי רכב חשמליים או תת-קבוצות של כלי רכב חשמליים) והמגבלות/הדרישות של השיטות בהן נעשה שימוש, פותחו שלושה סוגים של משטחי ביו-שבב זהב: או "עירום", "C11/C16" המתפקד כימית, או ליגנד-ביו-פונקציונלי, המכונה משטח זהב "ליגנד".
השבב העירום, המכונה "עירום", מאפשר ספיחה פשוטה של כלי רכב חשמליים על זהב. ניתן לבחור את המאגר המשמש ולממש ספיחה זו באופן פסיבי (שלבי דגירה ולאחר מכן שטיפה) או לפקח עליו תחת זרימה (ב SPRi). יתר על כן, ספיחה פסיבית זו יכולה להתממש או על השבב כולו (כמו macroarray) או מקומי microarrays באמצעות ספוטר micropipette. "נוהל הזרימה" מאפשר לחוקרים לעקוב אחר הקינטיקה ורמת ספיחת הרכב החשמלי. גישה זו על מצע הזהב העירום מאומצת כאשר ממשק השכבה הכימית עלול להפריע לשיטה האנליטית (למשל, עבור ספקטרוסקופיית ראמאן).
השבב הביולוגי המתפקד כימית, הנקרא "C11/C16", משמש ליצירת "שטיח" צפוף וחזק של כלי רכב חשמליים הקשורים באופן קוולנטי על פני הזהב על ידי יצירת קשרי אמיד ראשוניים עם התיולטים כאשר המטרה היא לקבל מבט גלובלי על דגימת הרכב החשמלי. ואכן, במקרה זה, הזהב מתפקד על ידי תערובת תיולאט של mercapto-1-undecanol (11-MUOH: "C11") וחומצה mercapto-1-hexadecanoic (16-MHA: "C16"), וחלק קטן של thiolates מופעלים כימית כדי ליצור קישור קוולנטי עם המטרות. שוב, אסטרטגיה זו יכולה להתממש באופן פסיבי (שלבי דגירה ולאחר מכן שטיפה, או ב"מקרו-מערך" או במספר מיקרו-מערכים באמצעות ספוטר מיקרופיפטה) או תחת קצבי זרימה (ב-SPRi) כדי לעקוב אחר הקינטיקה ורמת השתלת הרכב החשמלי על משטח הזהב.
השבב הביולוגי של הליגנד, הנקרא "ליגנדים", מופעל כימית כדי להשתיל באופן קוולנטי ליגנדים שונים (למשל, נוגדנים, קולטנים) כדי ללכוד באופן סלקטיבי (עם זיקה) תת-קבוצות שונות של EV המתקיימות יחד בדגימה הביולוגית.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
1. הכנת מצע זהב
הערה: שלושה סוגים של משטחים מיוצרים על שבבי זהב: 1) משטח עירום, 2) מתפקד כימית, 3) ביו-פונקציונלי (ליגנדות שהושתלו על שכבת C11C16). מנקודה זו ואילך הם ייקראו "עירומים", "C11C16" ו"ליגנדים", בהתאמה.
איור 2: שבב ביולוגי וספוטר ידני. שבב ביו-שבב זהב (משמאל), ספוטר מיקרופיפטה (באמצע) והביו-שבב לאחר זיהוי עם טיפות ליגנד של 300 nL כל אחת (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: בדיקות קדם-ריכוז כדי לקבוע את רמת החומציות האופטימלית עבור השתלת ליגנדים. החיישן מציג את רמת האינטראקציה כפונקציה של זמן עבור ליגנד אחד המוזרק באופן אקראי (בערכי pH שונים) באותו ריכוז במשך 2 דקות על פני השטח. OG הוא חומר הניקוי, המאפשר לשחזר את קו הבסיס בין כל הזרקה. כאן, החיישן מציין כי pH 6 איפשר את השתלת הליגנד ביותר, עם אות SPRi של 1091 RU. קיצורים: OG = גלוקוזיד אוקטיל; RU = יחידת תגובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
2. הדמיית תהודה פלסמונית פני השטח
איור 4: תמונת SPRi CCD של השבב הביולוגי. (A,B) שבב ביולוגי מרובב לאחר פסיבציה של אלבומין. (א) שבב ללא ברירת מחדל; (B) כמה פגמים שהופיעו על השבב: איחוי כתמים (i), השתלה חלשה (ii), או אבק או "מזהמים" (iii). ה-ROIs, בצבע הכתמים (צבע אחד לכל משפחת ליגנדים), נבחרו כדי להימנע מאותם "מזהמים". כאשר הכתמים התמזגו, הם צוינו וזכו להתעלמות או כ"תערובת של ליגנדות 1 ו-2". (C) שבב זהב עירום ללא מיקרו-מערכים לניסוי הבוחן ספיחת כלי רכב חשמליים על זהב. החץ הכחול מציין את כיוון הזרימה. שבב זה לא הציג כתמים, וה-ROI נבחרו לרשום את אות ההחזרה מקו 1 (L1, עיגולים אדומים) לקו 4 (L4, עיגולים סגולים) במהלך הזרקת הדגימה. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ לכל שלוש התמונות. קיצורים: SPRi = הדמיית תהודה פלסמונית פני השטח; CCD = התקן מצומד טעינה; ROI = אזורי עניין; EVs = שלפוחיות חוץ-תאיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניסויי SPRi של הזרקת EV לשבב ביולוגי. (A) ניסוי לכידה על שבב ביולוגי מרובה משתתפים המראה את אותות ההחזרה של ליגנדות שונות. כאן, יחס האות לרעש עבור הליגנדות השונות היה טוב מאוד (ובמיוחד בנקודות antiCD41) מכיוון שתגובת הבקרה השלילית הייתה זניחה. (B) ניסוי ספיחה של כלי רכב חשמליים על שבב ביולוגי עירום. חיישן המציג את ההתניה של השבב עם שתי שטיפות של חיץ וניקוי OG (1), עם הזרקת דגימת EV (2), ואת אות ההחזרה לאחר אינטראקציה EV (3). על שבב ביולוגי זה לא הייתה בקרה שלילית, אך אות ההחזרה (הקינטיקה שלו, יציבותו לאחר ההזרקה) היה גבוה, כלומר אותם רכבים חשמליים הצליחו לספוח ולהישאר יציבים על שבב הזהב. קיצורים: EV = שלפוחית חוץ-תאית; OG = גלוקוזיד אוקטיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
3. מיקרוסקופ כוח אטומי
איור 6: אפיון ביו-שבב על-ידי AFM. לאחר ניסוי SPRi, השבב תוקן והתייבש או נשמר בנוזל לצורך אפיון AFM. (A) שקופית זכוכית במכונה (עם שני טריזי מיקום מאונכים, המסומנים באות "w" על התמונה) המציגה מסכה המתאימה ללוקליזציה של 16 מיקרו-מערכי הביו-שבב. על ידי חשיפה לאור ושקיפות, לאחר התקנתו לאפיון AFM, מגלשת הזכוכית מאפשרת למקם את קצה ה-AFM על הנקודה הרצויה כדי לאפיין אותו. (B) השבב הביולוגי המותקן על שקופית ה"מסכה" ותחת טיפת חיץ לסריקה בתנאי נוזל. (C) תמונת SPRi של 16 המיקרו-מערכים. (D) מיקרו-מערך אחד שצולם במיקרוסקופ אופטי לאחר לכידה חיסונית של ננו-חלקיקי כיול ביו-פונקציונליים בקוטר 920 ננומטר. הריבועים הלבנים מציינים את הדגימה של האזורים השונים שנסרקו על ידי AFM בכל נקודה מעניינת כדי להפוך את אפיון AFM לחזק. פסי קנה מידה = (C) 1 מ"מ, (D) 500 מיקרומטר. קיצורים: AFM = מיקרוסקופ כוח אטומי; SPRi = הדמיית תהודה פלסמונית פני השטח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
4. ספקטרוסקופיית ראמאן
הערה: עבור ספקטרוסקופיית ראמאן, החלף את שקופית הזכוכית המשמשת כמצע בשקופית של CaF2, בעלת חתימת ראמאן זניחה.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
קביעת תנאי החומציות האופטימליים להשתלת ליגנד
הליגנדות השונות שמשמשות להכנת הביו-שבבים נבדקות כפונקציה של ה-pH והזמינות שלהן לאינטראקציה עם השכבה הכימית של תיולאט (איור 3). הליגנדות מדוללות במאגר אצטט בערכי pH שונים ומוזרקות על השבב הביולוגי המתפקד כימית עם שכבת C1...
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
השיטות האחרונות לזיהוי EV שנמצאות בשימוש הנרחב ביותר הן אימונובלוטינג ספציפי לחלבון כדי לאשר את מקורם של כלי רכב חשמליים, TEM כדי לאשר את המבנה שלהם, ונת"ע כדי לכמת את התפלגות מספרם וגודלם במדגםנפח 3. עם זאת, העניין הרב ברכבים חשמליים במחקר (ביו)רפואי והמגבלות של הכלים האנליטיים ה...
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
קלי אוברטין ופביאן פיקו ממתקן הליבה IVETh (פריז) מוכרים על ניסויי ההדמיה של ראמאן. תיירי בורנוף (האוניברסיטה הרפואית של טאיפיי, טייוואן) וזוזנה קרופובה (מהלינקור, צרפת) מוכרים על מתן דגימות EV שמקורן בדגימות טסיות דם וחלב בקר, בהתאמה. העבודה נתמכה על ידי אזור Bourgogne Franche-Comté ובית הספר לתארים מתקדמים EUR EIPHI (פרויקט טירון, 2021-2024). חלק מעבודה זו נעשתה באמצעות פלטפורמת CLIPP ובמתקני החדרים הנקיים של RENATECH ב-FEMTO-ENGINEERING, ועל כך אנו מודים לרבאח זגרי.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CD41a antibody | Diaclone SAS (France) | 447528 | |
CP920 | Microparticles GmbH, Germany | 448303 | |
DXR3xi | Thermo Fisher Scientific | T1502 | |
EDC | Sigma | A6272 | |
Ethanolamine | Sigma | P5368-10PAK | |
Evs derived from platelet concentrates | Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei) | S2889 | |
Evs from bovine milk | Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France) | 3450 | |
Glutaraldehyde | Sigma | 56845 | |
Gwyddion | 853.223.020 | ||
Magnetron sputtering | PLASSYS | SAB5300165 | |
mercapto-1-hexadecanoic acid | Sigma | G5882 | |
Mercapto-1-undecanol | Sigma | O8001 | |
Mountains SPIP ones | Digital Surf | ||
NanoWizard 3 Bioscience | Bruker-JPK | ||
Octyl Glucoside (OG) | Sigma | ||
Ovalbumine antibody | Sigma | ||
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | ||
Rat Albumin Serum (RSA) | Sigma | ||
Sodium acetate buffer | Sigma | ||
SPR-Biacore 3000 | GE Healthcare/ Cytiva life sciences | ||
SPRi Biochip | MIMENTO technology platform | The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon | |
SPRi Plex II | Horiba Scientific | ||
Sulfo-NHS | Sigma |
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved