Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

فرط الحساسية التماسية (CHS) هو نموذج تجريبي للفئران لالتهاب الجلد التماسي التحسسي (ACD). يعتمد CHS على التحسس باستخدام hapten التفاعلي عن طريق طلاء الجلد الحليق للصدر والبطن ، مع تحدي جلد الأذن اللاحق باستخدام هابتن مخفف ، مما يسبب رد فعل تورم يتم تقييمه بطرق مختلفة.

Abstract

فرط الحساسية التماسية (CHS) هو نموذج تجريبي لالتهاب الجلد التماسي التحسسي (ACD) يمكن دراسته على الفئران. تهدف هذه الدراسة إلى تقديم طريقة مختبرية موضوعية قد تساعد في دراسة تفاعل CHS في الفئران ، والتي يمكن قياسها وتحديدها كميا من خلال اختبارات مختلفة. وللحث على CHS، في اليوم "0"، تم تحسس الفئران على بقعة كانت محلوقة سابقا عن طريق طلاء جلد البطن باستخدام الهابتن 2،4،6-trinitrochlorobenzene (TNCB) في خليط الأسيتون والإيثانول، في حين تم تحسس الفئران ذات التحكم السلبي بخليط الأسيتون والإيثانول وحده في السيارة. في اليوم "4" ، تم قياس سمك الأذن الأساسي بميكرومتر قبل استنباط CHS (التحدي) عن طريق طلاء كلتا الأذنين ب TNCB المخفف في كل من مجموعات الاختبار والتحكم. بعد 24 ساعة ، تم قياس تورم الأذن باستخدام ميكرومتر. CHS هو مثال على الاستجابة المناعية بوساطة الخلايا التائية التي تسبب تورما في الأنسجة الملتهبة ، وتبلغ ذروتها بعد 24 ساعة من تحدي الجلد بنفس الهابتن. ارتبطت الزيادة في وذمة الأذن بزيادة وزن الأذن ، ونشاط الميلوبيروكسيديز (MPO) ، وتركيز السيتوكين المؤيد للالتهابات في مستخلصات الأذن ، وزيادة سماكة الأدمة الوذمية في الفحص النسيجي ، ونفاذية الأوعية الدموية في الأذن. كانت هناك أيضا زيادة في تركيز الأجسام المضادة IgG1 الخاصة ب TNP في مصال مجموعة الاختبار عند مقارنتها بالفئران الضابطة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن نقل هذه المواد بنجاح باستخدام الخلايا المستجيبة ل CHS التي تم الحصول عليها من الجهات المانحة التي سبق توعيتها باستخدام TNCB. تم إعطاء الخلايا المستجيبة ل CHS عن طريق الوريد في الفئران المتلقية الساذجة ، والتي تم تحديها لاحقا بنفس الهابتن المخفف. تم قياس تورم الأذن مع ميكرومتر 24 ساعة في وقت لاحق.

Introduction

التهاب الجلد التماسي التحسسي (ACD) هو مرض التهابي جلدي شائع في البلدان الصناعية ناجم عن تفاعل فرط الحساسية من النوع الرابع الناتج عن التعرض لمواد كيميائية منخفضة الوزن الجزيئي تسمى haptens. تشمل المواد المسببة للتحسس التماسي لدى البشر أيونات المعادن الثقيلة (الكروم والنيكل والحديد والكوبالت) وزيت التربنتين والعطور والأصباغ والمواد الحافظة الموجودة في مستحضرات التجميل (على سبيل المثال ، p-phenylenediamine) ، وبعض الأدوية (مثل النيومايسين والبنزوكايين) والمضادات الحيوية β-lactam (أي البنسلين) والمواد الكيميائية التي تنتجها النباتات (pentadecacatechol ، وهي مادة موجودة في اللبلاب السام) ، وكذلك الهيدروكينون المستخدم في صناعة التصوير الفوتوغرافي 1,2 . العوامل المسببة ل ACD عالية جدا حيث يتم استخدام أكثر من 100000 مادة كيميائية في الصناعة وحدها ، ويتم تصنيع 2000 مادة كيميائية جديدة كل عام. حتى الآن ، تم تحديد أكثر من 3700 جزيء قد يكون ملامسا للهابتنز / المواد المسببة للحساسية3. تفاعل فرط الحساسية التماسية (CHS) هو نموذج تجريبي ل ACD يمكن دراسته في الفئران والخنازير الغينية والجرذان ويمكن أن يسببه التطبيق الجلدي الموضعي للهابتنز الكيميائي التفاعلي المذاب في المذيبات العضوية 4,5,6. تهدف هذه الدراسة إلى وصف طريقة مختبرية موضوعية قد تساعد في دراسة تفاعل CHS في الفئران ، والتي يمكن قياسها وتحديدها كميا من خلال اختبارات مختلفة.

يتكون CHS من مراحل التوعية (الحث) والمستجيب (التحدي). في النماذج الحيوانية ، ترتبط الهابتنز أولا تساهميا بالبروتينات في الجسم لإنشاء مستضدات جديدة. خلال مرحلة التحسس، تعزز الخلايا الكيراتينية المنشطة هجرة ونضج الخلايا المتغصنة الجلدية (sDCs) عن طريق إنتاج عامل نخر السيتوكينات المؤيد للالتهابات α (TNF-α) والإنترلوكين 1β (IL-1β)7. تقدم خلايا لانجرهانز الجلدية (LCs) مستضدات خلال مراحل الحث والمستجيب CHS8. LCs المعرضة للهابتن أثناء التحسس تعزز تحريض كل من الخلايا التنظيمية والمستجيبة9. تشير الأدلة المتزايدة من العديد من الدراسات إلى أن استجابات CHS يمكن أن تتوسط فيها إما خلايا Th1 المقيدة من الفئة الثانية CD4 + MHC ، والتي تطلق محليا γ الإنترفيرون (IFN-γ) لاستخدام تسلل التهابي مميز ، والخلايا الليمفاوية Tc1 المقيدة من الفئة الأولى CD8 + MHC التي يمكنها أيضا إطلاق γ IFN ولكن في الغالب توسط الضرر السام للخلايا للخلايا الكيراتينية ، والآن أيضا خلايا Th17 المنتجة للإنترلوكين 17 (IL-17)10 ، 11.

تم تطوير العديد من نماذج CHS المختلفة التي تستخدم أنواعا مختلفة 1 2,13,14 و haptens (يتم تلخيص مقارنة مفصلة بين مختلف haptens والمذيبات ووقت التطبيق في الجدول 1). يقدم الفأر ، وهو نوع مختبري يستخدم بشكل متكرر ، بعض المزايا في دراسة CHS. هناك المزيد من السلالات والضربات القاضية (KO) والحيوانات المعدلة وراثيا بين الفئران مقارنة بالأنواع الأخرى ، مما يجعلها حيوانا جذابا للغاية15. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب نموذج CHS العديد من الحيوانات ، والفئران أكثر اقتصادا هنا. النماذج الحيوانية لا تحاكي ACD في جميع الجوانب. على وجه الخصوص ، فإنها تظهر التقشر والتقشر ، وهو أمر غير شائع بالنسبة للبشر16,17. من الصعب إعادة إنتاج ميزات الأمراض المزمنة ، ويرجع ذلك أساسا إلى أن النموذج الموصوف لا يفترض تطبيق hapten لفترة طويلة من الزمن. ومع ذلك، فقد تأكد هنا أن العديد من الجوانب الهامة لحوار التعاون الآسيوي مستنسخة. وقد تبين أيضا أنه ، كما هو الحال في البشر ، ترتبط هذه الميزات بالحساسية المحلية. تم إملاء اختيار hapten ومذيبه وتطبيقه الموضح في هذا البروتوكول من خلال حقيقة أن النتائج قد تم تأكيدها من خلال العديد من الاختبارات في المختبر وأنه تم اختبارها وتعديلها في المختبر لسنوات عديدة حتى تم إنشاء الإصدار الحالي. تسمح نماذج المورين بتحليل المجموعات الفرعية للخلايا أو السيتوكينات التي تشارك في تطوير ACD وهي ضرورية للتقييمات قبل السريرية للعلاجات الجديدة.

Protocol

أجريت جميع التجارب المقدمة في هذه المقالة وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقية المحلية 1st للتجارب على الحيوانات في كراكوف. تم تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة وفقا للتوصيات المحلية ، خاصة فيما يتعلق باستخدام الكيتامين / الزيلازين كمخدر ، واستخدام جانبي الأذنين لتطبيق المادة / hapten ، وقطع الأذن ، وجمع الدم عن طريق إزالة مقلة العين. تم استخدام BALB/c (النمط الفرداني H-2d) و CBA/J (H-2k) و C57BL/6 (H-2b) من ذكور وإناث الفئران التي يتراوح عمرها بين 6 و 12 أسبوعا في هذه الدراسة (انظر جدول المواد). بالنسبة للدلالة الإحصائية ، من الأفضل أن تتكون كل مجموعة من الفئران من 10-12 حيوانا.

1. إعداد الحيوان

  1. نظف طاولة العمليات بمحلول إيثانول بنسبة 70٪ قبل وبعد جميع الإجراءات. في حالة استخدام الفئران التي تتطلب ظروفا معقمة ، فقم بإجراء جميع العمليات في خزانة السلامة الأحيائية.

2. وضع علامات على الفئران لتحديد هويتها

  1. قم بتسمية الفئران عن طريق حلق الجلد بشفرة حلاقة: # 0 - بدون علامة ، # 2 - على المخلب الأمامي الأيمن ، # 3 - على الجانب الأيمن ، # 4 - على المخلب الخلفي الأيمن ، # 5 - في قاعدة الذيل ، # 6 - على المخلب الخلفي الأيسر ، # 7 - على الجانب الأيسر ، # 8 - على المخلب الأمامي الأيسر.
    ملاحظة: بسبب التفاعل المستحث، لا يمكن تمييز الفئران بشكل كلاسيكي عن طريق لكم الأذن أو وضع العلامات. لم يتم تخدير الفئران أثناء وضع العلامات.

3. تحريض CHS

ملاحظة: يوضح الشكل 1 هذا الإجراء.

  1. قم بإجراء التحسس (الحث) باتباع الخطوات أدناه.
    1. في اليوم "0" ، حلق الفئران على الصدر والبطن (مربع 2 سم × 2 سم) عن طريق تطبيق الصابون الرمادي بالماء والحلاقة بشفرة حلاقة.
      ملاحظة: قبل تطبيق hapten ، انتظر لمدة 6 ساعات حتى لا يتهيج الجلد.
    2. تحضير 5٪ هابتن: 2،4،6-ترينيتروكلوروبنزين (TNCB ، انظر جدول المواد) في خليط الأسيتون والإيثانول (نسبة 1: 3) أو السيارة وحدها (الأسيتون - الإيثانول). قم بإعداد المحاليل قبل الاستخدام مباشرة في قارورة زجاجية وحمايتها من الضوء عن طريق تغطية القارورة بورق الألومنيوم.
    3. في نفس اليوم ، قم بتحسس الفئران عن طريق تطبيق 150 ميكرولتر من 5٪ hapten على البقعة المحلوقة سابقا. في مجموعة الفئران الضابطة ، ضع السيارة وحدها لتقييم التفاعل الالتهابي غير المحدد. قبل وضع الحيوان مرة أخرى في القفص ، انتظر لمدة 30 ثانية ، واترك hapten يجف.
      تحذير: استخدام القفازات; يسبب TNCB رد فعل تحسسي شديد لدى معظم الناس.
  2. إجراء الاستنباط (التحدي) وقياس تورم الأذن.
    1. في اليوم "4" ، قم بإعداد 0.4٪ hapten: TNCB في خليط الأسيتون والإيثانول (نسبة 1: 1). قم بإعداد المحلول قبل الاستخدام مباشرة في قارورة زجاجية وقم بحمايته من الضوء عن طريق تغطية القارورة بورق الألومنيوم.
    2. تخدير الفئران عن طريق حقن داخل الصفاق (i.p) من خليط من الكيتامين (90-120 ملغم / كغ) والزيلازين (5-10 ملغ / كغ) (انظر جدول المواد) للتخدير العميق. تأكد من تخدير الماوس بالكامل لمدة 5 دقائق على الأقل عن طريق قرصة إصبع القدم.
    3. قم بقياس سمك الأذن (قياس 0 ساعة ، خط الأساس) باستخدام ميكرومتر (انظر جدول المواد) من قبل مراقب غير مدرك للمجموعات التجريبية.
    4. ضع 10 ميكرولتر من 0.4٪ hapten على جانبي الأذنين في كلتا المجموعتين (الاختبار والتحكم). قبل وضع الحيوان مرة أخرى في القفص ، انتظر لمدة 30 ثانية واسمح للهابتن أن يجف.
    5. في اليوم "5" ، بعد 24 ساعة من تطبيق hapten ، كرر الخطوات 3.2.2-3.2.3 لقياس 24 ساعة.
    6. قم بتقييم استجابة CHS عن طريق حساب الفرق في سمك الأذن قبل وبعد التحدي باستخدام hapten: سمك الأذن 24 ساعة (ميكرومتر) - 0 ساعة سمك الأذن (ميكرومتر). عد كل أذن كقياس منفصل. بعد ذلك ، عبر عن تورم الأذن بالميكرومتر (μm) ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM) (الجدول 2 ، الشكل 3).

4. خزعات الأذن

  1. مباشرة بعد قياس 24 ساعة لسمك الأذن (عندما لا يزال الماوس تحت التخدير العميق) ، اقطع الأذنين بالقرب من الجمجمة قدر الإمكان باستخدام مقص. اجمع الخزعات من الجانب البعيد من الأذنين عن طريق عمل لكمة قطرها 6 مم باستخدام لكمة خزعة (انظر جدول المواد).
    1. قم بقياس وزن الأذن (الخطوة 4.2) بالإضافة إلى إجراء أحد الاختبارات التالية على خزعة الأذن نفسها: فحص الميلوبيروكسيديز (MPO) (الخطوة 4.3) أو القياس المختبري لتركيز السيتوكين في مستخلصات الأذن (على سبيل المثال ، IFN-γ ، IL-17A ، TNF-α [الخطوة 4.4]).
      ملاحظة: قطع الأذنين قبل جمع الدم. بعد هذا الإجراء ، يجب قتل الفئران الرحيم (على سبيل المثال ، عن طريق خلع عنق الرحم).
  2. قياس وزن كل خزعة أذن على التوازن التحليلي والتعبير عنها بالملليغرام (ملغ) (الشكل 4).
  3. قم بإجراء فحص MPO باتباع الخطوات أدناه.
    1. تحضير المخزن المؤقت للتجانس عن طريق إذابة بروميد الأمونيوم سداسي أديل ثلاثي ميثيل الأمونيوم بنسبة 0.5٪ في مخزن فوسفورات 50 مليمول KH 2 PO 4/ Na2HPO4 وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.0 (يستخدم في درجة حرارة الغرفة ، RT).
    2. تجانس الخزعات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2 مل مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المحضر لمدة 10 دقائق باستخدام مجانس مع حبات الفولاذ المقاوم للصدأ قطرها 5 مم (أضف خرزتين / قارورة) (انظر جدول المواد). بعد ذلك ، قم بتبريد العينة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية وتجانسها لمدة 10 دقائق إضافية.
      ملاحظة: تحتوي أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة على قاع دائري بحيث يمكن للخرز التحرك بسهولة.
    3. تجميد المتجانسات عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ذوبان الجليد والدوامة (تأكد من إذابة العينات). كرر هذا الإجراء 3x.
    4. جهاز الطرد المركزي المتجانسات عند 3000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. حصاد supernatants مع ماصة. عبر عن نشاط MPO بالوحدات (U) لكل 1 ملغ من البروتين.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. العينات مستقرة عند -20 درجة مئوية لمدة 3 أشهر.
    5. لقياس نشاط MPO ، قم بإجراء تفاعل إنزيمي عن طريق خلط 20 ميكرولتر من supernatant و 200 μL من ركيزة MPO (0.167 mg / mL من ortho-dianisine dihydrochloride في 50 مليمول من KH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 المخزن المؤقت مع 5 × 10-4٪ H 2 0 2) وأضف إلى 96 لوحة مسطحة القاع. احتضان اللوحات لمدة 20 دقيقة في RT.
    6. قم بإعداد المنحنى القياسي باستخدام 20 ميكرولتر من معيار MPO بتركيزات من 0.008 U إلى 0.5 U في 200 ميكرولتر من ركيزة MPO. قم بإعداد العينة الفارغة باستخدام الركيزة MPO وحدها.
      تنبيه: استخدم قناعا أثناء العمل مع ثنائي هيدروكلوريد أورثو ديانيسين.
      ملاحظة: يجب أن تكون الألواح مصنوعة من مادة البولي بروبيلين ، والتي لديها قدرة ربط أقل حتى لا ترتبط البروتينات أو الحمض النووي.
    7. قياس الكثافة البصرية (OD) عند الطول الموجي λ = 460 نانومتر. التفاعل الأنزيمي مستقر لمدة 10 دقائق. اقرأ نشاط MPO في العينات المختبرة من المنحنى القياسي.
    8. لقياس تركيز البروتين ، استخدم 20 ميكرولتر من supernatant ، وقم بإجراء اختبار باستخدام مجموعة حمض Bicinchoninic لتحديد البروتين (انظر جدول المواد) ، وقياس OD عند λ = 562 nm (الشكل 5).
  4. إجراء قياس في المختبر من السيتوكينات في مستخلص الأذن.
    1. تجانس خزعات الأذن في RT في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2 مل مع 500 ميكرولتر من كاشف استخراج بروتين الأنسجة (T-PER) لمدة 10 دقائق باستخدام مجانس مع خرز الفولاذ المقاوم للصدأ قطره 5 مم (أضف خرزتين / قارورة). بعد ذلك ، قم بتبريد العينة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية وتجانسها لمدة 10 دقائق إضافية.
      ملاحظة: تحتوي أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة على قاع دائري بحيث يمكن للخرز التحرك بسهولة.
    2. جهاز الطرد المركزي المتجانسات عند 3000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. العينات مستقرة عند -80 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.
    3. تقييم مستويات السيتوكين باستخدام مجموعة ELISA المتاحة تجاريا (على سبيل المثال، IFN-γ) (انظر جدول المواد) باتباع تعليمات الشركة المصنعة (الشكل 6).

5. علم الأنسجة من أنسجة الأذن

  1. مباشرة بعد قياس 24 ساعة لسمك الأذن ، عندما لا يزال الماوس مخدرا بعمق ، اقطع الأذنين بالقرب من الجمجمة قدر الإمكان باستخدام المقص (الخطوة 4.1).
    ملاحظة: بعد هذا الإجراء ، يجب قتل الفئران الرحيم (على سبيل المثال ، عن طريق خلع عنق الرحم).
  2. قم بإجراء تضمين البارافين لكتل الأنسجة باتباع الخطوات أدناه.
    1. مباشرة بعد الإزالة ، ضع الأذن في ~ 10 مل من الفورمالين بنسبة 10٪ لمدة 24 ساعة.
    2. ضع الأذنين في كاسيت معالجة الأنسجة. ضع الكاسيت في معالج آلي (انظر جدول المواد) لدورات الجفاف (الكحول 70٪ ، 90٪ ، 100٪ ، 30 دقيقة لكل منها في RT) ، دورات التطهير (الزيلين 3x ، 30 دقيقة لكل منها في RT) ، ودورات تسلل الشمع (البارافين 3x ، 30 دقيقة لكل منها عند 56 درجة مئوية).
    3. قم بإزالة الكاسيت من المعالج الآلي، واحتفظ بلوحة التسخين حتى الحاجة. املأ قالب الشمع بالشمع الدافئ (من الموزع).
    4. قم بإزالة الأقسام من الكاسيت باستخدام ملقط دافئ ووضعها في القالب ؛ بعد ذلك ، ضع قاعدة الكاسيت في الجزء العلوي من القالب ثم املأها بمزيد من الشمع. ضعه في ماء مبرد على طبق بارد لمدة 30 دقيقة حتى يتصلب البارافين لتشكيل كتلة تحتوي على العينة.
    5. استخدم ميكروتوم دوار (انظر جدول المواد) لقطع المقاطع بسماكة ~ 5 ميكرومتر. تطفو الأقسام في حمام دافئ لتسطيحها. التقط الأقسام على شريحة مجهر زجاجية. اتركها لتجف في RT لضمان التصاق الأقسام بالشرائح.
      ملاحظة: استخدم الشرائح التي تلغي الحاجة إلى تطبيق مواد لاصقة أو طلاءات بروتينية لمنع فقدان أجزاء الأنسجة أثناء التلطيخ.
  3. أداء تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E).
    1. قم بإعداد 17 طبقا ملطخا بما يلي: الزيلين (أربعة أطباق) ، الإيثانول 100٪ (الكحول المطلق) (أربعة أطباق) ، 90٪ الإيثانول ، 80٪ الإيثانول ، الإيثانول 70٪ ، الإيثانول 50٪ ، PBS (ثلاثة أطباق) ، محلول الهيماتوكسيلين ، محلول الإيوسين. انقل الشرائح من طبق إلى آخر وفقا للخطوات التالية ، وقم بإجراء كل ذلك في RT.
      ملاحظة: يمكن تكرار الإجراء في كل طبق حوالي 10 أضعاف (على سبيل المثال، إذا تم استخدام طبق مكون من 20 طبقة، يمكن عمل 200 بقعة دون تغيير السوائل).
    2. قم بإزالة البارافينات من الأقسام عن طريق الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الحاضنة. اغمر الشرائح في الزيلين لمدة 30 دقيقة. كرر 1x في الزيلين الجديد لمدة 30 دقيقة.
    3. اغمر الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق. كرر 1x في الإيثانول الجديد 100٪ لمدة 5 دقائق. اغمر الشرائح في صف الإيثانول ، 90٪ ، 80٪ ، 70٪ ، و 50٪ ، لمدة 2 دقيقة في كل تخفيف.
    4. اغمر الشرائح في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة 5 دقائق. امسح السائل الزائد من حول الأنسجة والجانب الخلفي من الشرائح.
    5. قم بتلطيخ الأقسام في محلول الهيماتوكسيلين (انظر جدول المواد) لمدة 7-8 دقائق. اغسل في الماء الجاري لمدة 30 ثانية من الجانب الخلفي حتى لا تتلف الأقسام. كرر الخطوة 5.3.4.
    6. قم بتلطيخ الأقسام بمحلول eosin (انظر جدول المواد) لمدة 30 ثانية. اغسل كما هو مذكور في الخطوة 5.3.5 ثم كرر الخطوة 5.3.4.
    7. اغمر الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ (الكحول المطلق) لمدة 2 دقيقة. كرر 1x في الإيثانول الجديد 100٪ لمدة 2 دقيقة.
    8. اغمر الشرائح في الزيلين لمدة 5 دقائق. كرر 1x في الزيلين الجديد لمدة 5 دقائق.
    9. اترك الأقسام تجف في الهواء لمدة 15 دقيقة في RT. أضف قطرة من وسط التركيب (انظر جدول المواد) على غطاء ثم ضعها في الجزء العلوي من القسم.
  4. افحص القسم تحت المجهر الضوئي تحت تكبير 20x أو 40x ، والتقط الصور (الشكل 7).

6. اختبار نفاذية الأوعية الدموية

ملاحظة: بالتناوب مع قياس سمك الأذن، يمكن إجراء اختبار نفاذية الأوعية الدموية.

  1. قم بتحسس الفئران في اليوم "0" (الخطوات 3.1.1-3.1.3) ، ثم في اليوم "4" ، قم بتخدير الفئران (الخطوة 3.2.2) وتطبيق hapten مباشرة على الأذنين (الخطوة 3.2.4) ، مع حذف قياس الأذن لمدة 0 ساعة.
  2. في الساعة 23 بعد التحدي ، قم بتخدير الفئران (الخطوة 3.2.2).
  3. حقن عن طريق الوريد (i.v.) 8.3 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم من صبغة إيفانز الزرقاء 1٪ (انظر جدول المواد) في دولبيكو الفوسفات الملوحة المخزن مؤقتا (DPBS).
  4. تخدير الفئران مرة أخرى التخدير العميق (الخطوة 3.2.2) -1 ساعة بعد حقن إيفانز الأزرق.
  5. جمع خزعات الأذن (الخطوة 4.1).
    ملاحظة: بعد هذا الإجراء ، يجب قتل الفئران الرحيم (على سبيل المثال ، عن طريق خلع عنق الرحم).
  6. استخراج الصبغة من الأنسجة ، ووضع لكمات الأذن في الأنابيب التي تحتوي على 1 مل من الفورماميد ، وحضان في 37 درجة مئوية في الغلاف الجوي من 5 ٪ CO2 لمدة 18 ساعة.
  7. الطرد المركزي للخزعات في 3000 × غرام لمدة 3 دقائق في RT. جمع supernatants مع ماصة.
  8. قم بقياس OD عند طول موجي λ = 565 نانومتر في لوحات مسطحة القاع ذات 96 بئرا مقابل فورماميد فارغ يحتوي على فورماميد. اللون مستقر لمدة 24 ساعة. اقرأ تركيز عينات الاختبار من المنحنى القياسي (استخدم تركيزات إيفانز الزرقاء التي تتراوح بين 0.2-30 ميكروغرام من فورماميد الصبغة / مل ) (الشكل 8).
    ملاحظة: يجب أن تكون الألواح مصنوعة من مادة البولي بروبيلين ، والتي لديها قدرة ربط أقل حتى لا ترتبط البروتينات أو الحمض النووي.

7. جمع المصل وقياس الأجسام المضادة للغلوبولين المناعي المضاد ل TNP (IgG1)

  1. بعد جمع خزعات الأذن (الخطوة 4.1) ، عندما لا يزال الماوس تحت التخدير العميق ، قم بإزالة مقلة العين باستخدام ملاقط ، ووضع ضغط لطيف على الماوس ، وجمع الدم من الجيوب الأنفية المدارية الرجعية إلى الأنبوب (قارورة مع هلام للحصول على مصل ، انظر جدول المواد). قد تكون الطريقة البديلة لجمع الدم هي ثقب القلب بحقنة وجمع الدم.
    ملاحظة: يجب جمع الدم بعد إزالة الأذنين. يجب استخدام نفس طريقة النزيف عبر دراسة كاملة بسبب الاختلافات المحتملة في معلمات الدم18. بعد هذا الإجراء ، يجب قتل الفئران الرحيم (على سبيل المثال ، عن طريق خلع عنق الرحم).
  2. عكس ما لا يقل عن 6x ، وانتظر 30 دقيقة حتى يتجلط الدم ، ثم قم بجهاز طرد مركزي عند 1,300-2,000 x g لمدة 10 دقائق في RT.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. العينة مستقرة عند -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.
  3. قم بتغطية صفيحة مسطحة القاع من 96 بئرا مع 50 ميكرولتر من ألبومين مصل البقر المقترن ب 2,4,6-trinitrophenyl (TNP-BSA) المذاب في DPBS عند تنسيق 10 ميكروغرام / مل. بعد ذلك ، قم بتغطية اللوحة الثانية بألبومين مصل البقر (BSA) وحده المذاب في DPBS (الخلفية) بتركيز 10 ميكروغرام / مل. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يحتوي مصل الماوس على أجسام مضادة (ABS) ضد BSA ، لذلك يجب اختبار العينات على كلا اللوحتين ، وبعد ذلك ، يجب إجراء عملية حسابية (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. اغسل الألواح ب 300 ميكرولتر من DPBS تحتوي على 0.05٪ Tween 20. كرر 3x.
  5. تحضير مخفف المقايسة (AD): DPBS يحتوي على 1٪ BSA. سد الآبار مع AD لمدة 1 ساعة في RT. غسل مرة أخرى (الخطوة 7.4).
  6. إعداد معيار داخلي (iSTD): توعية الفئران باستخدام TNCB (الخطوات 3.1.1-3.1.3) ، وبعد 10 أيام من التوعية ، جمع واستطلاع المصل من جميع المانحين (الخطوة 7.1 والخطوة 7.2).
  7. أضف إلى اللوحة 50 ميكرولتر من التركيزات المتدرجة من iSTD المخفف باستخدام AD لصنع المنحنى القياسي (الموضح في الجدول 3). أضف إلى اللوحة 50 ميكرولتر من عينات المصل. اختبر كل عينة ومنحنى قياسي على كلا اللوحتين (TNP-BSA و BSA مغلفة). احتضان لمدة 2 ساعة في RT. اغسل الألواح (الخطوة 7.4).
  8. أضف 50 ميكرولتر من الجسم المضاد للماوس الحيوي IgG1 أحادي النسيلة (mAb ، انظر جدول المواد) المخفف 1:250 مع AD واحتضنه لمدة ساعة واحدة في RT. اغسل مرة أخرى (الخطوة 7.4).
  9. أضف 50 ميكرولتر من الفجل بيروكسيديز ستربتافيدين (HRD streptavidin ، انظر جدول المواد) المخفف 1:2000 مع AD ، واحتضن لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام. اغسل اللوحة (الخطوة 7.4).
  10. أضف 50 ميكرولتر من ركيزة TMB (انظر جدول المواد) واحتضنها لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
  11. أوقف التفاعل الأنزيمي بإضافة 25 ميكرولتر من 1 M H2SO4 ؛ التفاعل مستقر لمدة 30 دقيقة.
  12. قم بقياس OD بطول موجي λ = 450 نانومتر وخلفية 570 نانومتر (يجب طرح الخلفية من كل قياس 450 نانومتر). عند عرض النتائج، اطرح قياسات BSA من TNP-BSA للعينات والمنحنى القياسي. ثم احسب الوحدة (U) للأجسام المضادة وفقا للمنحنى القياسي (الشكل 9).

8. النقل بالتبني للخلايا المستجيبة ل CHS

ملاحظة: يبين الشكل 2 هذا الإجراء.

  1. الجهات المانحة (بنسبة متبرع واحد: متلق واحد): توعية الفئران ب TNCB في اليوم "0" (الخطوات 3-1-1-3-3).
  2. في اليوم "4" ، قم بتخدير التخدير العميق للفئران (الخطوة 3.2.2).
  3. عزل الغدد الليمفاوية الإبطية والإربية (ALNs) والطحال (SPLs) باستخدام الملقط. قم بتجميع ALNs معا في قارورة واحدة و SPLs في قارورة أخرى.
    ملاحظة: هناك عقدة ليمفاوية إبطية واحدة خلف العضلة الصدرية في كل إبطين. تقع إحدى العقدة الليمفاوية الإربية في منطقة الورك بجوار ثلاثة أوعية دموية. يقع الطحال على الجانب الأيسر من الجسم خلف الأمعاء والمعدة19. العمل باستخدام أدوات معقمة في خزانة السلامة الأحيائية للحفاظ على ظروف معقمة. بعد هذا الإجراء ، يجب قتل الفئران الرحيم (على سبيل المثال ، عن طريق خلع عنق الرحم).
  4. اهرسي الأنسجة بين الأطراف المتجمدة لشريحتين مجهريتين. مرر تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية بحجم مسام 70 ميكرومتر (انظر جدول المواد).
  5. اغسل الخلايا باستخدام DPBS المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 1٪ (FBS). جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بتزيين السوبرناتانت وإعادة تعليق حبيبات الخلايا المتبقية في 1-5.0 مل من DPBS.
  6. عد الخلايا الحية باستخدام مقياس الدم20 مع أزرق تريبان ، وامزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 90-990 ميكرولتر (اعتمادا على رقم الخلية) من أزرق تريبان. ضع في اعتبارك التخفيف عند حساب رقم الخلية (10x-100x).
  7. تحضير خليط من ALNs و SPLs (نسبة 1: 1): 8.0 × 106 حتى 7.0 × 107 / الماوس في 200 ميكرولتر من DPBS.
  8. المتلقين (الفئران المتجانسة الساذجة): تخدير الفئران المتلقية الساذجة (الخطوة 3.2.2) وحقن i.v. بمزيج محضر من الخلايا المستجيبة ل CHS (الخطوة 8.7). في المجموعة الضابطة من الفئران ، لا تحقن أي خلايا.
  9. قياس سمك الأذن قبل (0 ساعة) وبعد (24 ساعة) التحدي (الخطوات 3.2.1-3.2.6) (الشكل 10).
  10. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإجراء اختبارات على الخلايا المستجيبة المعزولة ل CHS (على سبيل المثال ، النمط الظاهري للخلية أو قياس السيتوكينات المنتجة بواسطة الخلايا المستجيبة ل CHS عن طريق قياس التدفق الخلوي). يمكن أيضا إنشاء مزارع الخلايا ، ويمكن تقييم قدرة الخلايا المستجيبة ل CHS على التكاثر في وجود المستضد أو كمية السيتوكينات المفرزة في supernatants المستزرعة21,22 (البيانات غير المقدمة).
    ملاحظة: يتطلب إجراء اختبارات إضافية المزيد من المتبرعين بالخلايا.

النتائج

بالنسبة لتحريض CHS ، تم تحسس الحيوانات عن طريق طلاء الجلد (البطن) مع 150 ميكرولتر من 5٪ TNCB أو تحسس زائف مع السيارة وحدها. في اليوم "4" ، تم تحفيز استجابات تورم الأذن لكلتا الأذنين عن طريق الطلاء بالاتصال (التحدي) مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ TNCB في كل من الفئران التي كانت على اتصال سابق مع TNCB (مجموعة اخت...

Discussion

يتم تحفيز CHS عن طريق haptens ، والتي ترتبط بمستضدات البروتين الذاتي في الجلد ، مما يخلق مستضدات جديدة. يتم التوسط في CHS من خلال التوظيف المحلي خارج الأوعية الدموية للخلايا التائية المستجيبة ل CHS المستجيبة للمستضد ، مما يؤدي إلى تورم في الأنسجة المتحدية ، ويبلغ ذروته بعد 24 ساعة من تعرض الجل?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من خلال الإعانة SUBZ. A020.22.060 من الجامعة الطبية في فروتسواف ، بولندا ، ومن خلال منح من وزارة العلوم والتعليم العالي N N401 545940 إلى MS و IP2012 0443 72 إلى MMS.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
70% ethanolMerck KGaA, Darmstadt, Germany65350-Mfor surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropyleneGreiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria655101for MPO and Evans blue measurement - plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%)Merck KGaA, Darmstadt, Germany179124
Aluminum foilMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ185140
Analytical balanceSartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, GermanyPRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processorMediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, IndiaMTP-E-212automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum)Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USABD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determinationMerck KGaA, Darmstadt, GermanyBCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA553441
BSA (bovine serum albumine)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyA9418protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μmBIOLOGIX, China15-1070suitable for 50 mL tubes
CoverslipVWR, Radnor, Pennsylvania, United States631-158324 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA14190144no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histologyMerck KGaA, Darmstadt, Germany6522mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers - straightAnimalab, Poznan, Poland11251-10FSTsurgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers - bentAnimalab, Poznan, Poland11272-50FSTsurgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholicMerck KGaA, Darmstadt, GermanyHT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppenforf, Germany3,01,20,086polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mLEppenforf, Germany3,01,20,094polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol)Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.07017
Ethanol 96%Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.59010
Evans blueMerck KGaA, Darmstadt, GermanyE2129
FBS (fetal bovine serum)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAA3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10%Merck KGaA, Darmstadt, GermanyHT501128
Formamide 99.5% (GC)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyF7503
Freezer -20 °CBosch, GermanyGSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °CBosch, GermanyKGV36V10mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost PlusVWR, Radnor, Pennsylvania, United States631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad PrismGraphPad Software Inc.v. 9.4.0
Grey soapPollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., PolandBialy jelen soap bargrey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M)Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.60313
Harris hematoxylin solutionMerck KGaA, Darmstadt, GermanyHHS16
HemocytometerVWR, Avantor, U.S.A612-5719manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromideMerck KGaA, Darmstadt, GermanyH5882
HomogenizerQIAGEN Hilden, GermanyTissue Lyser LT, SN 23.1001/05234homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin)Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USASA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyH1009
Incubator Heracell 150iThermo Electron LED Gmbh, Germany4107106837 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injectionBiowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Polandcat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basisMerck KGaA, Darmstadt, Germany1.05108
Laboratory CentrifugeHeraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, GermanyB00013899speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory CentrifugeHeraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany75002425speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2)VWR, Radnor, Pennsylvania, United States111-0917for working with ortho-dianisine dihydrochloride
MiceBreeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, PolandCBA/J, C57BL/6
MicrometerMitutoyo, Tokyo, Japan193-111digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test)Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria655061with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectivesLeica Microsystems CMS GmbH, GermanyDM1000, 294011-082007histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyM6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyS9390
Olive-oilMerck KGaA, Darmstadt, Germany75343pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA SetBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA555138
Ortho-dianisine dihydrochlorideMerck KGaA, Darmstadt, GermanyD3252
Paraffin waxMerck KGaA, Darmstadt, Germany76242beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA20012027pH 7.2, mammalian cell culture
ph meterElmetron, PolandCP-401
Pipettes, variable volume with tipsMerck KGaA, Darmstadt, GermanyEP3123000900-1EA3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor bladeVWR, Radnor, Pennsylvania, United StatesPERS94-0462scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtomeMRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UKHIS-202A
Scissors - straight, sharp / sharpAnimalab, Poznan, Poland14060-10FSTSurgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top)Merck KGaA, Darmstadt, Germany27056black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
SpectrophotometerBioTek Instruments, U.S.A201446universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 - 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 - 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rackMerck KGaA, Darmstadt, GermanyS6141e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mmIntegra LifeSciences, Princeton, NJ, USA33-36
Surgical scissorsAnimalab, Poznan, Poland52138-46surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettesMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ672122tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent SetBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene)Tokyo Chemical Industry CO., LTD, JapanC0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl)Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USAT-5050
T-PER (tissue protein extration reagent)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA78510
Tubes 15 mL sterileMerck KGaA, Darmstadt, GermanyCLS430055 (Corning)polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterileMerck KGaA, Darmstadt, GermanyCLS430290 (Corning)polypropylene, conical bottom
Tween 20Merck KGaA, Darmstadt, GermanyP1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Germany27173for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bathAJL Electronic, PolandLW102
Wax (paraffin) dispenserVWR, Radnor, Pennsylvania, United States114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injectionVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Polandcat.# not avaliable
Xylene (histological grade)Merck KGaA, Darmstadt, Germany534056

References

  1. Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. Allergic and irritant contact dermatitis. European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).
  2. Hertl, M., et al. Predominance of epidermal CD8+ T lymphocytes in bullous cutaneous reactions caused by beta-lactam antibiotics. The Journal of Investigative Dermatology. 101 (6), 794-799 (1993).
  3. Martin, S. F. T lymphocyte-mediated immune responses to chemical haptens and metal ions: implications for allergic and autoimmune disease. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (3), 186-198 (2004).
  4. Takeyoshi, M., Iida, K., Suzuki, K., Yamazaki, S. Skin sensitization potency of isoeugenol and its dimers evaluated by a non-radioisotopic modification of the local lymph node assay and guinea pig maximization test. Journal of Applied Toxicology. 28 (4), 530-534 (2008).
  5. Nakamura, K., Aizawa, M. Studies on the genetic control of picryl chloride contact hypersensitivity reaction in inbred rats. Transplantation Proceedings. 13 (2), 1400-1403 (1981).
  6. Asherson, G. L., Ptak, W. Contact and delayed hypersensitivity in the mouse. I. Active sensitization and passive transfer. Immunology. 15 (3), 405-416 (1968).
  7. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 133 (2), 303-315 (2013).
  8. Kaplan, D. H., Jenison, M. C., Saeland, S., Shlomchik, W. D., Shlomchik, M. J. Epidermal langerhans cell-deficient mice develop enhanced contact hypersensitivity. Immunity. 23 (6), 611-620 (2005).
  9. Wang, L., et al. Langerin expressing cells promote skin immune responses under defined conditions. Journal of Immunology. 180 (7), 4722-4727 (2008).
  10. Wang, B., et al. CD4+ Th1 and CD8+ type 1 cytotoxic T cells both play a crucial role in the full development of contact hypersensitivity. Journal of Immunology. 165 (12), 6783-6790 (2000).
  11. Mori, T., et al. Cutaneous hypersensitivities to hapten are controlled by IFN-gamma-upregulated keratinocyte Th1 chemokines and IFN-gamma-downregulated langerhans cell Th2 chemokines. The Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1719-1727 (2008).
  12. Peszkowski, M. J., Warfvinge, G., Larsson, A. Allergic and irritant contact responses to DNFB in BN and LEW rat strains with different TH1/TH2 profiles. Acta Dermato-Venereologica. 74 (5), 371-374 (1994).
  13. Henningsen, S. J., Mickell, J., Zachariae, H. Plasma kinins in dinitrochlorobenzene contact dermatitis of guinea-pigs. Acta Allergologica. 25 (5), 327-331 (1970).
  14. Maibach, H. I., Maguire, H. C. Elicitation of delayed hypersensitivity (DNCB contact dermatitis) in markedly panleukopenic guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 41, 123-127 (1963).
  15. Martel, B. C., Lovato, P., Bäumer, W., Olivry, T. Translational animal models of atopic dermatitis for preclinical studies. The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (3), 389-402 (2017).
  16. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 129 (1), 31-40 (2009).
  17. Li, Y. Z., Lu, X. Y., Jiang, W., Li, L. F. Anti-inflammatory effect of qingpeng ointment in atopic dermatitis-like murine model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2013, 907016 (2013).
  18. Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Experimental Hematology. 44 (2), 132-137 (2016).
  19. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50765 (2013).
  20. Hemocytometer - Counting of Cells. Amrita University Available from: https://www.youtube.com/watch?v=MKS0KM3lr90 (2011)
  21. Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A. International Archives of Allergy and Immunology. 164 (2), 122-136 (2014).
  22. Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS. Immunology and Cell Biology. 90 (8), 784-795 (2012).
  23. Directive 2010/63 / EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union Available from: https://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:En:PDF (2010)
  24. Colvin, R. B., Dvorak, H. F. Role of the clotting system in cell-mediated hypersensitivity. II. Kinetics of fibrinogen/fibrin accumulation and vascular permeability changes in tuberculin and cutaneous basophil hypersensitivity reactions. Journal of Immunology. 114, 377-387 (1975).
  25. Szczepanik, M., et al. Regulation of contact sensitivity in non-obese diabetic (NOD) mice by innate immunity. Contact Dermatitis. 79 (4), 197-207 (2018).
  26. Askenase, P. W., Majewska-Szczepanik, M., Kerfoot, S., Szczepanik, M. Participation of iNKT cells in the early and late components of Tc1-mediated DNFB contact sensitivity: Cooperative role of γδ-T cells. Scandinavian Journal of Immunology. 73 (5), 465-477 (2011).
  27. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity. Pharmacological Reports. 64 (6), 1485-1496 (2012).
  28. Van Loveren, H., et al. Use of micrometers and calipers to measure various components of delayed-type hypersensitivity ear swelling reactions in mice. Journal of Immunological Methods. 67 (2), 311-319 (1984).
  29. Tsuji, R. F., et al. B cell-dependent T cell responses: IgM antibodies are required to elicit contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 196 (10), 1277-1290 (2002).
  30. Campos, R. A., et al. Cutaneous immunization rapidly activates liver invariant Valpha14 NKT cells stimulating B-1 B cells to initiate T cell recruitment for elicitation of contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1785-1796 (2003).
  31. Rühl-Muth, A. C., Maler, M. D., Esser, P. R., Martin, S. F. Feeding of a fat-enriched diet causes the loss of resistance to contact hypersensitivity. Contact Dermatitis. 85 (4), 398-406 (2021).
  32. Bour, H., et al. histocompatibility complex class I-restricted CD8+ T cells and class II-restricted CD4+ T cells, respectively, mediate and regulate contact sensitivity to dinitrofluorobenzene. European Journal of Immunology. 25 (11), 3006-3010 (1995).
  33. Majewska-Szczepanik, M., et al. Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice. Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).
  34. Katagiri, K., Arakawa, S., Kurahashi, R., Hatano, Y. Impaired contact hypersensitivity in diet-induced obese mice. Journal of Dermatological Science. 46 (2), 117-126 (2007).
  35. Bouloc, A., Cavani, A., Katz, S. I. Contact hypersensitivity in MHC class II-deficient mice depends on CD8 T lymphocytes primed by immunostimulating Langerhans cells. The Journal of Investigative Dermatology. 111 (1), 44-49 (1998).
  36. Martin, S., et al. Peptide immunization indicates that CD8+ T cells are the dominant effector cells in trinitrophenyl-specific contact hypersensitivity. The Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 260-266 (2000).
  37. Vennegaard, M. T., et al. Epicutaneous exposure to nickel induces nickel allergy in mice via a MyD88-dependent and interleukin-1-dependent pathway. Contact Dermatitis. 71 (4), 224-232 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

187 ACD CHS MPO 2 4 6 TNCB

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved