Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kontakt aşırı duyarlılık (CHS), alerjik kontakt dermatitin (AKB) murin deneysel bir modelidir. CHS, göğüs ve karın bölgesinin traş edilmiş cildini boyayarak reaktif hapten ile hassaslaşmaya dayanır, daha sonra seyreltilmiş bir hapten ile kulak derisi meydan okuması ile çeşitli şekillerde değerlendirilen bir şişlik reaksiyonuna neden olur.

Özet

Kontakt aşırı duyarlılık (CHS), farelerde incelenebilen deneysel bir alerjik kontakt dermatit (ACD) modelidir. Bu çalışma, farelerde CHS reaksiyonunu incelemeye yardımcı olabilecek, çeşitli testlerle ölçülebilen ve ölçülebilen objektif bir laboratuvar yöntemi sunmayı amaçlamaktadır. CHS'yi indüklemek için, "0" gününde, fareler bir aseton-etanol karışımında hapten 2,4,6-trinitroklorobenzen (TNCB) ile abdominal cilt boyaması ile daha önce traş edilmiş bir noktaya duyarlılaştırılırken, negatif kontrol fareleri tek başına araç-aseton-etanol karışımı ile düzmece duyarlılaştırıldı. "4" gününde, temel kulak kalınlığı, CHS'nin (meydan okuma) ortaya çıkmasından önce, her iki kulağın hem test hem de kontrol gruplarında seyreltilmiş TNCB ile boyanmasıyla bir mikrometre ile ölçüldü. 24 saat sonra, kulak şişmesi bir mikrometre ile ölçüldü. CHS, iltihaplı dokuda şişmeye neden olan ve aynı hapten ile cilt mücadelesinden 24 saat sonra zirveye ulaşan T hücresi aracılı bir bağışıklık tepkisinin bir örneğidir. Kulak ödeminde artış, artmış kulak ağırlığı, miyeloperoksidaz (MPO) aktivitesi, kulak ekstrelerinde pro-inflamatuar sitokin konsantrasyonu, histolojik incelemede ödemli dermisin kalınlaşmasının artması ve kulak vasküler geçirgenliği ile korelasyon gösterdi. Test grubunun serumlarında TNP-spesifik IgG1 antikorlarının konsantrasyonunda, kontrol fareleri ile karşılaştırıldığında bir artış vardı. Ek olarak, CHS, daha önce TNCB ile duyarlılaştırılmış donörlerden elde edilen CHS-efektör hücrelerle başarılı bir şekilde aktarılabilir. CHS-efektör hücreler, daha sonra aynı seyreltilmiş hapten ile zorlanan naif alıcı farelere intravenöz olarak uygulandı. Kulak şişmesi 24 saat sonra mikrometre ile ölçüldü.

Giriş

Alerjik kontakt dermatit (AKB), sanayileşmiş ülkelerde, hapten adı verilen düşük moleküler ağırlıklı kimyasallara maruz kalmaktan kaynaklanan tip IV aşırı duyarlılık reaksiyonunun neden olduğu yaygın bir deri enflamatuar hastalığıdır. İnsanlarda temas duyarlılaşmasına neden olan maddeler arasında ağır metal iyonları (krom, nikel, demir, kobalt), terebentin, kokular, boyalar ve kozmetiklerde bulunan koruyucular (örneğin, p-fenilendiamin), bazı ilaçlar (örneğin, neomisin, benzokain), β-laktam antibiyotikler (yani penisilin), bitkiler tarafından üretilen kimyasallar (pentadekakatekol, zehirli sarmaşıklarda bulunan bir madde) ve fotoğraf endüstrisinde kullanılan hidrokinonbulunur 1,2 . ACD etiyolojik ajanları çok yüksektir, çünkü sadece endüstride 100.000'den fazla kimyasal kullanılmaktadır ve her yıl 2.000 yenisi sentezlenmektedir. Bugüne kadar, temas haptenleri / alerjenleri olabilecek 3.700'den fazla molekül tanımlanmıştır3. Temas aşırı duyarlılık reaksiyonu (CHS), farelerde, kobaylarda ve sıçanlarda çalışılabilen deneysel bir ACD modelidir ve organik çözücülerde çözünmüş reaktif kimyasal haptenlerin topikal cilt uygulaması ile indüklenebilir 4,5,6. Bu çalışma, farelerde CHS reaksiyonunu incelemeye yardımcı olabilecek ve çeşitli testlerle ölçülebilen ve ölçülebilen objektif bir laboratuvar yöntemini tanımlamayı amaçlamaktadır.

CHS, sensitizasyon (indüksiyon) ve efektör (meydan okuma) aşamalarından oluşur. Hayvan modellerinde, haptenler ilk önce neoantijenler oluşturmak için vücuttaki proteinlere kovalent olarak bağlanır. Sensitizasyon aşamasında, aktive keratinositler, pro-inflamatuar sitokinler-tümör nekroz faktör α (TNF-α) ve interlökin 1β (IL-1β)7 üreterek deri dendritik hücrelerinin (sDC'ler) göçünü ve olgunlaşmasını teşvik eder. Epidermal Langerhans hücreleri (LC'ler) CHS indüksiyonu ve efektör fazları8 sırasında antijenler sunar. Duyarlılaşma sırasında hapten'e maruz kalan LC'ler hem düzenleyici hem de efektör hücrelerin indüksiyonunu teşvik eder9. Birkaç çalışmadan elde edilen kanıtların artması, CHS yanıtlarının CD4 + MHC sınıf II ile kısıtlanmış Th1 hücreleri tarafından aracılık edilebildiğini, karakteristik bir enflamatuar infiltrasyon kullanmak için lokal olarak interferon-γ (IFN-γ), IFN-γ serbest bırakabilen, ancak çoğunlukla keratinositlere sitotoksik hasara aracılık edebilen CD8 + MHC sınıf I-kısıtlı Tc1 lenfositleri ve şimdi de interlökin 17 (IL-17) üreten Th17 hücreleri10, 11.

Çeşitli türler 12,13,14 ve haptenleri kullanan birkaç farklı CHS modeli geliştirilmiştir (farklı haptenlerin, çözücülerin ve uygulama zamanlarının ayrıntılı bir karşılaştırması Tablo 1'de özetlenmiştir). Sık kullanılan bir laboratuvar türü olan fare, CHS'yi incelemede birkaç avantaj sunar. Fareler arasında diğer türlere kıyasla daha fazla suş, nakavt (KO) ve transgenik hayvan vardır, bu da onları çok çekici bir hayvan yapar15. Ek olarak, CHS modeli birçok hayvan gerektirir ve fareler burada daha ekonomiktir. Hayvan modelleri ACD'yi her açıdan taklit etmez; özellikle, insanlar için yaygın olmayan kabuklanma ve deskuamasyon gösterirler16,17. Kronik hastalığın özelliklerinin çoğaltılması zordur, çünkü tarif edilen model haptenin uzun süre uygulanmasını üstlenmez. Bununla birlikte, burada ACD'nin önemli yönlerinin çoğunun çoğaltıldığı doğrulanmıştır. İnsanlarda olduğu gibi, bu özelliklerin lokal alerjik reaksiyonlarla ilişkili olduğu da gösterilmiştir. Bu protokolde özetlenen hapten seçimi, çözücüsü ve uygulaması, sonuçların çok sayıda in vitro testle doğrulanması ve mevcut versiyon kurulana kadar uzun yıllar laboratuvarda test edilmesi ve modifiye edilmesi gerçeğiyle belirlendi. Murin modelleri, ACD'nin gelişiminde rol oynayan ve yeni tedavilerin klinik öncesi değerlendirmeleri için gerekli olan hücre alt kümelerinin veya sitokinlerin analizine izin verir.

Protokol

Bu makalede sunulan tüm deneyler, Krakow'daki 1. Hayvan Deneyleri Yerel Etik Komitesi'nin yönergelerine göre yürütülmüştür. Açıklanan tüm prosedürler, özellikle ketamin / ksilazinin anestezik olarak kullanılması, madde / hapten uygulamak için kulakların her iki tarafının kullanılması, kulağın kesilmesi ve göz küresinin çıkarılmasıyla kan toplanması ile ilgili olarak yerel önerilere göre gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada 6-12 haftalık BALB/c (haplotip H-2d), CBA/J (H-2k) ve C57BL/6 (H-2b) erkek ve dişi fareler kullanılmıştır (bkz. İstatistiksel anlamlılık için, her fare grubunun 10-12 hayvandan oluşması en iyisidir.

1. Hayvan hazırlığı

  1. Tüm işlemlerden önce ve sonra ameliyat masasını% 70 etanol çözeltisi ile temizleyin. Steril koşullar gerektiren fareler kullanıyorsanız, tüm işlemleri bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.

2. Tanımlama için fareleri işaretleme

  1. Cildi bir tıraş bıçağı ile tıraş ederek fareleri etiketleyin: #0 - işaretsiz, #2 - sağ ön pençede, #3 - sağ tarafta, #4 - sağ arka pençede, #5 - kuyruğun tabanında, #6 - sol arka pençede, #7 - sol tarafta, #8 - sol ön pençede.
    NOT: İndüklenen reaksiyon nedeniyle, fareler klasik olarak kulak delme veya etiketleme ile işaretlenemez. Fareler etiketlenirken anestezi yapılmadı.

3. CHS'nin İndüksiyonu

NOT: Bu yordam Şekil 1'de gösterilmiştir.

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek hassaslaştırmayı (indüksiyon) gerçekleştirin.
    1. "0" gününde, su ile gri sabun uygulayarak ve bir tıraş bıçağı ile tıraş ederek göğüs ve karın bölgesinde (kare 2 cm x 2 cm) fareleri tıraş edin.
      NOT: Hapten uygulamadan önce, cildin tahriş olmaması için 6 saat bekleyin.
    2. % 5 hapten hazırlayın: 2,4,6-trinitroklorobenzen (TNCB, bakınız Malzeme Tablosu) bir aseton-etanol karışımında (oran 1: 3) veya tek başına araç (aseton-etanol). Bir cam şişede kullanmadan hemen önce çözeltiler hazırlayın ve şişeyi alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan koruyun.
    3. Aynı gün, daha önce tıraş edilen noktaya 150 μL% 5 hapten uygulayarak fareleri hassaslaştırın. Kontrol fareleri grubunda, spesifik olmayan enflamatuar reaksiyonu değerlendirmek için aracı tek başına uygulayın. Hayvanı tekrar kafese koymadan önce, haptenin kurumasına izin vererek 30 s bekleyin.
      DİKKAT: Eldiven kullanın; TNCB çoğu insanda ciddi bir alerjik reaksiyona neden olur.
  2. Uyarılma (meydan okuma) ve kulak şişmesi ölçümü yapın.
    1. "4" gününde,% 0.4 hapten hazırlayın: Bir aseton-etanol karışımında TNCB (oran 1: 1). Çözeltiyi bir cam şişede kullanmadan hemen önce hazırlayın ve şişeyi alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan koruyun.
    2. Derin anestezi için fareleri ketamin (90-120 mg / kg) ve ksilazin (5-10 mg / kg) karışımının intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu ile anestezi altına alın. Farenin ayak parmağını kıstırarak en az 5 dakika boyunca tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
    3. Kulak kalınlığını (0 saatlik ölçüm, taban çizgisi) deney gruplarından habersiz bir gözlemci tarafından bir mikrometre ile (bakınız Malzeme Tablosu) ölçün.
    4. Her iki grupta da kulakların her iki tarafına 10 μL% 0.4 hapten uygulayın (test ve kontrol). Hayvanı tekrar kafese koymadan önce, 30 s bekleyin ve haptenin kurumasına izin verin.
    5. "5" gününde, hapten uygulamasından 24 saat sonra, 24 saatlik ölçüm için 3.2.2-3.2.3 adımlarını tekrarlayın.
    6. CHS yanıtını, hapten ile mücadeleden önce ve sonra kulak kepçesi kalınlığındaki farkı hesaplayarak değerlendirin: 24 saat kulak kalınlığı (μm) - 0 saat kulak kalınlığı (μm). Her kulağı ayrı bir ölçüm olarak sayın. Daha sonra, ortalamanın (SEM) standart hatası ± mikrometre (μm) cinsinden kulak şişmesini ifade edin (Tablo 2, Şekil 3).

4. Kulak biyopsileri

  1. Kulak kalınlığının 24 saatlik ölçümünden hemen sonra (fare hala derin anestezi altındayken), kulakları kafatasına mümkün olduğunca yakın makasla kesin. Biyopsi punch kullanarak 6 mm çapında bir punch yaparak kulakların distal tarafından biyopsileri toplayın (bkz.
    1. Kulak ağırlığını ölçün (adım 4.2) ve ayrıca aynı kulak biyopsisinde aşağıdaki testlerden birini yapın: miyeloperoksidaz (MPO) testi (adım 4.3) veya kulak ekstrelerindeki sitokin konsantrasyonunun in vitro ölçümü (örneğin, IFN-γ, IL-17A, TNF-α [adım 4.4]).
      NOT: Kan toplanmadan önce kulakları kesin. Bu işlemden sonra, fareler ötenazi yapılmalıdır (örneğin, servikal çıkık yoluyla).
  2. Her bir kulak biyopsisinin ağırlığını analitik terazide ölçün ve miligram (mg) cinsinden ifade edin (Şekil 4).
  3. Aşağıdaki adımları izleyerek bir MPO testi gerçekleştirin.
    1. 50 mmol fosforat tamponu KH 2 PO4/Na2HPO4 içinde %0,5 hekzadediltrimetilamonyum bromür çözerek ve pH'ı 6,0'a ayarlayarak homojenizasyon tamponunu hazırlayın (oda sıcaklığında kullanın, RT).
    2. 5 mm çapında paslanmaz çelik boncuklu bir homojenizatör kullanarak 500 μL hazırlanmış tamponlu 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde biyopsileri 10 dakika boyunca homojenize edin (iki boncuk/şişe ekleyin) (bkz. Ardından, numuneyi 4 ° C'de 15 dakika soğutun ve 10 dakika daha homojenleştirin.
      NOT: Mikrosantrifüj tüpleri, boncukların kolayca hareket edebilmesi için yuvarlak bir tabana sahiptir.
    3. Homojenatları −20 °C'de 30 dakika boyunca dondurun. Çözülme ve vorteks (numunelerin çözüldüğünden emin olun). Bu prosedürü 3 kat tekrarlayın.
    4. Homojenatları 3.000 x g'de 4 °C'de 30 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantları bir pipetle hasat edin. MPO aktivitesini 1 mg protein başına birim (U) cinsinden ifade edin.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Numuneler 3 ay boyunca -20 ° C'de stabildir.
    5. MPO aktivitesini ölçmek için, 20 μL süpernatant ve 200 μL MPO substratını (50 mmol KH 2 PO 4 / Na2HPO4 tamponunda 0.167 mg / mL orto-dianisin dihidroklorür içinde 5 x 10−4% H 2 0 2) karıştırarak enzimatik bir reaksiyon gerçekleştirin ve 96 delikli düz tabanlı plakalara ekleyin. RT'de plakaları 20 dakika boyunca inkübe edin.
    6. MPO substratının 200 μL'sinde 0,008 U'dan 0,5 U'ya kadar konsantrasyonlarda MPO standardının 20 μL'sini kullanarak standart eğriyi hazırlayın. Boş numuneyi yalnızca MPO substratı ile hazırlayın.
      DİKKAT: Orto-dianisin dihidroklorür ile çalışırken bir maske kullanın.
      NOT: Plakalar, proteinlerin veya DNA'nın bağlanmaması için daha düşük bir bağlanma kapasitesine sahip polipropilenden yapılmalıdır.
    7. Optik yoğunluğu (OD) λ = 460 nm dalga boyunda ölçün. Enzimatik reaksiyon 10 dakika boyunca kararlıdır. Standart eğriden test edilen numunelerdeki MPO aktivitesini okuyun.
    8. Protein konsantrasyonunu ölçmek için, süpernatanın 20 μL'sini kullanın, protein tayini için bir Bicinchoninic asit kiti ile bir test yapın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve OD'yi λ = 562 nm'de ölçün (Şekil 5).
  4. Kulak ekstraktındaki sitokinlerin in vitro ölçümünü gerçekleştirin.
    1. RT'deki kulak biyopsilerini, 5 mm çapında paslanmaz çelik boncuklu bir homojenizatör kullanarak 500 μL doku protein ekstraksiyon reaktifi (T-PER) içeren 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde 10 dakika boyunca homojenize edin (iki boncuk/flakon ekleyin). Ardından, numuneyi 4 ° C'de 15 dakika soğutun ve 10 dakika daha homojenleştirin.
      NOT: Mikrosantrifüj tüpleri, boncukların kolayca hareket edebilmesi için yuvarlak bir tabana sahiptir.
    2. Homojenatları 3.000 x g'de 4 °C'de 30 dakika boyunca santrifüj yapın.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Numuneler 6 ay boyunca -80 ° C'de stabildir.
    3. Sitokin seviyelerini, üreticinin talimatlarını izleyerek ticari olarak temin edilebilen bir ELISA seti (örneğin, IFN-γ) kullanarak değerlendirin (Malzeme Tablosuna bakınız) (Şekil 6).

5. Kulak dokusunun histolojisi

  1. Kulak kalınlığının 24 saatlik ölçümünden hemen sonra, fare hala derin anestezi altındayken, kulakları makasla kafatasına mümkün olduğunca yakın bir şekilde kesin (adım 4.1).
    NOT: Bu işlemden sonra, fareler ötenazi yapılmalıdır (örneğin, servikal çıkık yoluyla).
  2. Aşağıdaki adımları izleyerek doku bloklarının parafin gömmesini gerçekleştirin.
    1. Çıkarıldıktan hemen sonra, kulağı 24 saat boyunca ~ 10 mL% 10 formalin içine yerleştirin.
    2. Kulakları bir doku işleme kasetine yerleştirin. Kasetleri, dehidrasyon döngüleri (RT'de her biri %70, %90, %100, 30 dakika alkol), temizleme döngüleri (RT'de her biri 30 dakika ksilen 3x, 30 dakika) ve balmumu infiltrasyon döngüleri (56 ° C'de her biri 3x, 30 dakika olmak üzere parafin 3x) için otomatik bir işlemciye ( Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
    3. Kasetleri otomatik işlemciden çıkarın ve gerekli olana kadar ısıtma plakasına tutun. Balmumu kalıbını ılık balmumu ile doldurun (dağıtıcıdan).
    4. Bölümleri ısıtılmış forseps ile kasetten çıkarın ve kalıba yerleştirin; Daha sonra, kaset tabanını kalıbın üstüne yerleştirin ve ardından daha fazla balmumu ile doldurun. 30 dakika boyunca soğuk bir tabak üzerinde soğutulmuş suya koyun, böylece parafin numuneyi içeren bir blok oluşturmak için katılaşır.
    5. ~5 μm kalınlığındaki bölümleri kesmek için döner bir mikrotom kullanın (bkz. Bölümleri düzleştirmek için ılık bir banyoda yüzdürün. Bölümleri bir cam mikroskop slaytına alın. Bölümlerin slayda yapışmasını sağlamak için RT'de kurumasını bekleyin.
      NOT: Boyama sırasında doku kesitlerinin kaybını önlemek için yapışkan malzemeler veya protein kaplamalar uygulama ihtiyacını ortadan kaldıran slaytlar kullanın.
  3. Hematoksilin ve eozin (H & E) boyama işlemini gerçekleştirin.
    1. Aşağıdakilerle 17 boyama kabı hazırlayın: ksilen (dört tabak),% 100 etanol (mutlak alkol) (dört tabak), % 90 etanol,% 80 etanol,% 70 etanol,% 50 etanol, PBS (üç tabak), hematoksilin çözeltisi, eozin çözeltisi. Aşağıdaki adımlara göre slaytları bir çanaktan diğerine aktarın ve hepsini RT'de gerçekleştirin.
      NOT: Her bir çanaktaki prosedür yaklaşık 10x tekrarlanabilir (örneğin, 20 slaytlı bir tabak kullanılıyorsa, sıvıları değiştirmeden 200 leke yapılabilir).
    2. İnkübatörde 30 dakika boyunca 65 ° C'de inkübasyon yaparak bölümleri deparaffinize edin. Slaytları 30 dakika boyunca ksilene batırın. Yeni ksilende 30 dakika boyunca 1x'i tekrarlayın.
    3. Slaytları 5 dakika boyunca% 100 etanol içine batırın. Yeni% 100 etanolde 5 dakika boyunca 1x'i tekrarlayın. Slaytları her seyreltmede 2 dakika boyunca etanol sırasına,% 90,% 80,% 70 ve% 50 batırın.
    4. Slaytları 5 dakika boyunca fosfat tamponlu salin (PBS) içine batırın. Fazla sıvıyı dokunun etrafından ve slaytların arka tarafından silin.
    5. Hematoksilin çözeltisindeki bölümleri 7-8 dakika boyunca sabitleyin (bakınız Malzeme Tablosu). Bölümlere zarar vermemek için ters taraftan 30 s akan suda yıkayın. Adım 5.3.4'ü yineleyin.
    6. Bölümleri 30 sn boyunca eozin çözeltisi ile sabitleyin (bakınız Malzeme Tablosu). Adım 5.3.5'te belirtildiği gibi yıkayın ve ardından adım 5.3.4'ü tekrarlayın.
    7. Slaytları 2 dakika boyunca %100 etanol (mutlak alkol) içine batırın. Yeni% 100 etanolde 2 dakika boyunca 1x'i tekrarlayın.
    8. Slaytları 5 dakika boyunca ksilene batırın. Yeni ksilende 5 dakika boyunca 1x'i tekrarlayın.
    9. Bölümlerin RT'de 15 dakika boyunca kurumasını bekleyin. Bir kapak kapağına bir damla montaj ortamı ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve ardından bölümün üstüne yerleştirin.
  4. Bölümü ışık mikroskobu altında 20x veya 40x büyütme altında inceleyin ve görüntüler yakalayın (Şekil 7).

6. Vasküler geçirgenlik testi

NOT: Kulak kalınlığı ölçümüne alternatif olarak, vasküler geçirgenlik testi yapılabilir.

  1. Fareleri "0" gününde (adım 3.1.1-3.1.3) hassaslaştırın ve ardından "4" gününde, fareleri uyuşturun (adım 3.2.2) ve 0 saatlik kulak ölçümünü atlayarak doğrudan kulaklara hapten uygulayın (adım 3.2.4).
  2. Meydan okuma sonrası 23 saatte, fareleri anestezi altına alın (adım 3.2.2).
  3. İntravenöz olarak (i.v.) 8.3 μL/g vücut ağırlığında% 1 Evans mavi boyası enjekte edin (bakınız Malzeme Tablosu) Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salinine (DPBS) enjekte edin.
  4. Evans mavi enjeksiyonundan 1 saat sonra fareleri tekrar derin anestezi (adım 3.2.2) ile anestezi altına alın.
  5. Kulak biyopsilerini toplayın (adım 4.1).
    NOT: Bu işlemden sonra, fareler ötenazi yapılmalıdır (örneğin, servikal çıkık yoluyla).
  6. Boyayı dokudan çıkarın, kulak yumruklarını 1 mL formamid içeren tüplere yerleştirin ve 18 saat boyunca% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe edin.
  7. Biyopsileri RT'de 3 dakika boyunca 3.000 x g'de santrifüj edin.
  8. OD'yi, 96 kuyucuklu düz tabanlı plakalarda λ = 565 nm dalga boyunda, formamid içeren boş bir formamide karşı ölçün. Renk 24 saat boyunca kararlıdır. Test numunelerinin konsantrasyonunu standart eğriden okuyun (Evans mavisinin 0.2-30 μg boya / mL formamid arasında değişen konsantrasyonlarını kullanın) (Şekil 8).
    NOT: Plakalar, proteinlerin veya DNA'nın bağlanmaması için daha düşük bir bağlanma kapasitesine sahip polipropilenden yapılmalıdır.

7. Serum toplama ve anti-TNP immünoglobulin (IgG1) antikor ölçümü

  1. Kulak biyopsilerini topladıktan sonra (adım 4.1), fare hala derin anestezi altındayken, göz küresini cımbızla çıkarın, fareye hafif bir baskı uygulayın ve retro-orbital sinüsten tüpe kan toplayın (serum elde etmek için jelli şişe , bkz. Kan toplamanın alternatif bir yöntemi, kalbi bir şırınga ile delmek ve kanı toplamak olabilir.
    NOT: Kulaklar çıkarıldıktan sonra kan toplanmalıdır. Kan parametrelerindeki potansiyel farklılıklar nedeniyle tüm çalışma boyunca aynı kanama yöntemi kullanılmalıdır18. Bu işlemden sonra, fareler ötenazi yapılmalıdır (örneğin, servikal çıkık yoluyla).
  2. En az 6x ters çevirin, kanın pıhtılaşması için 30 dakika bekleyin ve ardından RT'de 10 dakika boyunca 1.300-2.000 x g'de santrifüj yapın.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Numune 6 ay boyunca -20 ° C'de stabildir.
  3. DPBS'de 10 μg / mL'lik bir konçersiyonda çözünmüş 2,4,6-trinitrofenil (TNP-BSA) ile konjuge edilmiş 50 μL sığır serum albümini içeren 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakayı kaplayın. Daha sonra, ikinci plakayı DPBS'de (arka plan) 10 μg / mL'lik bir konsantrasyonda çözünmüş sığır serum albümini (BSA) ile kaplayın. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Fare serumu BSA'ya karşı antikorlar (Abs) içerir, bu nedenle numunelerin her iki plakada da test edilmesi gerekir ve daha sonra bir hesaplama yapılmalıdır (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. Plakaları% 0.05 Ara 20 içeren 300 μL DPBS ile yıkayın. 3x tekrarlayın.
  5. Tahlil seyrelticisini hazırlayın (AD): %1 BSA içeren DPBS. Kuyucukları RT'de 1 saat boyunca AD ile bloke edin. tekrar yıkayın (adım 7.4).
  6. Dahili bir standart (iSTD) hazırlayın: fareleri TNCB ile hassaslaştırın (adım 3.1.1-3.1.3) ve duyarlılaştırmadan 10 gün sonra, serumu tüm donörlerden toplayın ve yoklayın (adım 7.1 ve adım 7.2).
  7. Standart eğriyi yapmak için plakaya 50 μL derecelendirilmiş iSTD konsantrasyonları ekleyin ( Tablo 3'te açıklanmıştır). Tabağa 50 μL serum örnekleri ekleyin. Her numuneyi ve standart eğriyi her iki plakada da test edin (TNP-BSA ve BSA kaplamalı). RT'de 2 saat boyunca inkübe edin. plakaları yıkayın (adım 7.4).
  8. AD ile 1:250 seyreltilmiş 50 μL biyotinile anti-fare IgG1 monoklonal antikoru (mAb, bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin ve RT'de 1 saat inkübe edin. tekrar yıkayın (adım 7.4).
  9. AD ile 1:2000 seyreltilmiş 50 μL yaban turpu peroksidaz strepttavidin (HRD streptavidin, bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin ve karanlıkta RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın. Plakayı yıkayın (adım 7.4).
  10. 50 μL TMB substratı ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve karanlıkta RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  11. 1M H2S04'ün 25 μL'sini ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun; reaksiyon 30 dakika boyunca kararlıdır.
  12. OD'yi λ = 450 nm dalga boyunda ve 570 nm arka planda ölçün (arka plan her 450 nm ölçümden çıkarılmalıdır). Sonuçları sunarken, numuneler için BSA ölçümlerini TNP-BSA'dan ve standart eğriden çıkarın. Ardından, standart eğriye göre antikorların birimini (U) hesaplayın (Şekil 9).

8. CHS-efektör hücrelerin evlat edinilmiş transferi

NOT: Bu yordam Şekil 2'de gösterilmiştir.

  1. Donörler (bir donör oranında: 1 alıcı): "0" gününde TNCB ile fareleri hassaslaştırın (adım 3.1.1-3.1.3).
  2. "4" gününde, farelerin derin anestezisini anestezi altına alın (adım 3.2.2).
  3. Forseps ile aksiller ve inguinal lenf nodlarını (ALN'ler) ve dalakları (SPL'ler) izole edin. ALN'leri bir şişede ve SPL'leri başka bir şişede bir araya getirin.
    NOT: Her aksillada pektoral kasının arkasında bir aksiller lenf nodu vardır. Kalça bölgesindeki bir inguinal lenf nodu üç kan damarının yanında bulunur. Dalak, vücudun sol tarafında bağırsak ve midenin arkasında bulunur19. Steril koşulları korumak için bir biyogüvenlik kabininde steril aletlerle çalışın. Bu işlemden sonra, fareler ötenazi yapılmalıdır (örneğin, servikal çıkık yoluyla).
  4. İki mikroskop slaytının buzlu uçları arasındaki dokuyu püre haline getirin. Hücre süspansiyonunu gözenek boyutu 70 μm olan bir hücre süzgecinden geçirin (bkz.
  5. Hücreleri% 1 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DPBS ile yıkayın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Süpernatantı boşaltın ve kalan hücre peletini 1-5.0 mL DPBS içinde yeniden askıya alın.
  6. Trypan mavisi ile bir hemositometre20 kullanarak canlı hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunun 10 μL'sini Trypan mavisinin 90-990 μL (hücre sayısına bağlı olarak) ile karıştırın. Hücre numarasını hesaplarken seyreltmeyi dikkate alın (10x-100x).
  7. ALN'ler ve SPL'lerin bir karışımını hazırlayın (oran 1:1): 200 μL DPBS'de 8,0 x 106'dan 7,0 x 107/fareye kadar.
  8. Alıcılar (naif sinjenik fareler): naif alıcı fareleri anestezi altına alın (adım 3.2.2) ve i.v.'yi CHS-efektör hücrelerinin hazırlanmış bir karışımı ile enjekte edin (adım 8.7). Farelerin kontrol grubunda, herhangi bir hücre enjekte etmeyin.
  9. Kulak kalınlığını meydan okumadan önce (0 saat) ve sonra (24 saat) ölçün (adım 3.2.1-3.2.6) (Şekil 10).
  10. Ek olarak, izole CHS-efektör hücreler üzerinde testler yapın (örneğin, hücre fenotiplemesi veya üretilen sitokinlerin CHS-efektör hücreler tarafından akış sitometrisi ile ölçülmesi). Hücre kültürleri de kurulabilir ve CHS-efektör hücrelerin antijen varlığında çoğalma kabiliyeti veya kültür süpernatantlarında salgılanan sitokinlerin miktarı21,22 olarak değerlendirilebilir (veriler sunulmamıştır).
    NOT: Ek testler yapmak, buna bağlı olarak daha fazla hücre bağışçısı gerektirir.

Sonuçlar

CHS indüksiyonu için, hayvanlar cilt boyama (karın) yoluyla 150 μL% 5 TNCB ile hassaslaştırıldı veya sadece araçla hassaslaştırıldı. "4" gününde, her iki kulağın kulak şişmesi tepkileri, daha önce TNCB (test grubu) ve kontrol grubu fareleri (sahte duyarlılaştırılmış) ile daha önce temas halinde olan her iki farede de% 0.4 TNCB'nin 10 μL'si ile temas boyama (meydan okuma) ile indüklendi. Sunulan veriler, TNCB ile duyarlılaşan ve 4 gün sonra meydan okuyan farelerin, benzer şekilde ...

Tartışmalar

CHS, derideki kendi kendine protein antijenlerine bağlanan ve neoantijenler yaratan haptenler yoluyla indüklenir. CHS, dolaşımdaki antijene özgü CHS-efektör T hücrelerinin lokal ekstravasküler alımı ile aracılık eder, bu da meydan okunan dokuda şişmeye neden olur ve sekonder cildin aynı hapten6'ya maruz kalmasından 24 saat sonra zirveye ulaşır. Dokunun şişmesi esas olarak lökositlerin infiltrasyonundan ve lökosit bağımlı fibrin birikiminden kaynaklanır

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma subvention SUBZ tarafından desteklenmiştir. Polonya, Wroclaw'daki Tıp Üniversitesi'nin A020.22.060 ve Bilim ve Yüksek Öğretim Bakanlığı'ndan N N401 545940'tan MS'ye ve IP2012 0443 72'den MMS'ye hibelerle.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
70% ethanolMerck KGaA, Darmstadt, Germany65350-Mfor surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropyleneGreiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria655101for MPO and Evans blue measurement - plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%)Merck KGaA, Darmstadt, Germany179124
Aluminum foilMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ185140
Analytical balanceSartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, GermanyPRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processorMediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, IndiaMTP-E-212automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum)Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USABD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determinationMerck KGaA, Darmstadt, GermanyBCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA553441
BSA (bovine serum albumine)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyA9418protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μmBIOLOGIX, China15-1070suitable for 50 mL tubes
CoverslipVWR, Radnor, Pennsylvania, United States631-158324 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA14190144no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histologyMerck KGaA, Darmstadt, Germany6522mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers - straightAnimalab, Poznan, Poland11251-10FSTsurgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers - bentAnimalab, Poznan, Poland11272-50FSTsurgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholicMerck KGaA, Darmstadt, GermanyHT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppenforf, Germany3,01,20,086polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mLEppenforf, Germany3,01,20,094polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol)Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.07017
Ethanol 96%Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.59010
Evans blueMerck KGaA, Darmstadt, GermanyE2129
FBS (fetal bovine serum)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAA3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10%Merck KGaA, Darmstadt, GermanyHT501128
Formamide 99.5% (GC)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyF7503
Freezer -20 °CBosch, GermanyGSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °CBosch, GermanyKGV36V10mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost PlusVWR, Radnor, Pennsylvania, United States631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad PrismGraphPad Software Inc.v. 9.4.0
Grey soapPollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., PolandBialy jelen soap bargrey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M)Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.60313
Harris hematoxylin solutionMerck KGaA, Darmstadt, GermanyHHS16
HemocytometerVWR, Avantor, U.S.A612-5719manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromideMerck KGaA, Darmstadt, GermanyH5882
HomogenizerQIAGEN Hilden, GermanyTissue Lyser LT, SN 23.1001/05234homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin)Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USASA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyH1009
Incubator Heracell 150iThermo Electron LED Gmbh, Germany4107106837 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injectionBiowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Polandcat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basisMerck KGaA, Darmstadt, Germany1.05108
Laboratory CentrifugeHeraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, GermanyB00013899speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory CentrifugeHeraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany75002425speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2)VWR, Radnor, Pennsylvania, United States111-0917for working with ortho-dianisine dihydrochloride
MiceBreeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, PolandCBA/J, C57BL/6
MicrometerMitutoyo, Tokyo, Japan193-111digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test)Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria655061with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectivesLeica Microsystems CMS GmbH, GermanyDM1000, 294011-082007histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyM6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyS9390
Olive-oilMerck KGaA, Darmstadt, Germany75343pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA SetBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA555138
Ortho-dianisine dihydrochlorideMerck KGaA, Darmstadt, GermanyD3252
Paraffin waxMerck KGaA, Darmstadt, Germany76242beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA20012027pH 7.2, mammalian cell culture
ph meterElmetron, PolandCP-401
Pipettes, variable volume with tipsMerck KGaA, Darmstadt, GermanyEP3123000900-1EA3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor bladeVWR, Radnor, Pennsylvania, United StatesPERS94-0462scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtomeMRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UKHIS-202A
Scissors - straight, sharp / sharpAnimalab, Poznan, Poland14060-10FSTSurgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top)Merck KGaA, Darmstadt, Germany27056black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
SpectrophotometerBioTek Instruments, U.S.A201446universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 - 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 - 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rackMerck KGaA, Darmstadt, GermanyS6141e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mmIntegra LifeSciences, Princeton, NJ, USA33-36
Surgical scissorsAnimalab, Poznan, Poland52138-46surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettesMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ672122tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent SetBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene)Tokyo Chemical Industry CO., LTD, JapanC0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl)Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USAT-5050
T-PER (tissue protein extration reagent)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA78510
Tubes 15 mL sterileMerck KGaA, Darmstadt, GermanyCLS430055 (Corning)polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterileMerck KGaA, Darmstadt, GermanyCLS430290 (Corning)polypropylene, conical bottom
Tween 20Merck KGaA, Darmstadt, GermanyP1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Germany27173for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bathAJL Electronic, PolandLW102
Wax (paraffin) dispenserVWR, Radnor, Pennsylvania, United States114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injectionVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Polandcat.# not avaliable
Xylene (histological grade)Merck KGaA, Darmstadt, Germany534056

Referanslar

  1. Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. Allergic and irritant contact dermatitis. European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).
  2. Hertl, M., et al. Predominance of epidermal CD8+ T lymphocytes in bullous cutaneous reactions caused by beta-lactam antibiotics. The Journal of Investigative Dermatology. 101 (6), 794-799 (1993).
  3. Martin, S. F. T lymphocyte-mediated immune responses to chemical haptens and metal ions: implications for allergic and autoimmune disease. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (3), 186-198 (2004).
  4. Takeyoshi, M., Iida, K., Suzuki, K., Yamazaki, S. Skin sensitization potency of isoeugenol and its dimers evaluated by a non-radioisotopic modification of the local lymph node assay and guinea pig maximization test. Journal of Applied Toxicology. 28 (4), 530-534 (2008).
  5. Nakamura, K., Aizawa, M. Studies on the genetic control of picryl chloride contact hypersensitivity reaction in inbred rats. Transplantation Proceedings. 13 (2), 1400-1403 (1981).
  6. Asherson, G. L., Ptak, W. Contact and delayed hypersensitivity in the mouse. I. Active sensitization and passive transfer. Immunology. 15 (3), 405-416 (1968).
  7. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 133 (2), 303-315 (2013).
  8. Kaplan, D. H., Jenison, M. C., Saeland, S., Shlomchik, W. D., Shlomchik, M. J. Epidermal langerhans cell-deficient mice develop enhanced contact hypersensitivity. Immunity. 23 (6), 611-620 (2005).
  9. Wang, L., et al. Langerin expressing cells promote skin immune responses under defined conditions. Journal of Immunology. 180 (7), 4722-4727 (2008).
  10. Wang, B., et al. CD4+ Th1 and CD8+ type 1 cytotoxic T cells both play a crucial role in the full development of contact hypersensitivity. Journal of Immunology. 165 (12), 6783-6790 (2000).
  11. Mori, T., et al. Cutaneous hypersensitivities to hapten are controlled by IFN-gamma-upregulated keratinocyte Th1 chemokines and IFN-gamma-downregulated langerhans cell Th2 chemokines. The Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1719-1727 (2008).
  12. Peszkowski, M. J., Warfvinge, G., Larsson, A. Allergic and irritant contact responses to DNFB in BN and LEW rat strains with different TH1/TH2 profiles. Acta Dermato-Venereologica. 74 (5), 371-374 (1994).
  13. Henningsen, S. J., Mickell, J., Zachariae, H. Plasma kinins in dinitrochlorobenzene contact dermatitis of guinea-pigs. Acta Allergologica. 25 (5), 327-331 (1970).
  14. Maibach, H. I., Maguire, H. C. Elicitation of delayed hypersensitivity (DNCB contact dermatitis) in markedly panleukopenic guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 41, 123-127 (1963).
  15. Martel, B. C., Lovato, P., Bäumer, W., Olivry, T. Translational animal models of atopic dermatitis for preclinical studies. The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (3), 389-402 (2017).
  16. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 129 (1), 31-40 (2009).
  17. Li, Y. Z., Lu, X. Y., Jiang, W., Li, L. F. Anti-inflammatory effect of qingpeng ointment in atopic dermatitis-like murine model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2013, 907016 (2013).
  18. Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Experimental Hematology. 44 (2), 132-137 (2016).
  19. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50765 (2013).
  20. Hemocytometer - Counting of Cells. Amrita University Available from: https://www.youtube.com/watch?v=MKS0KM3lr90 (2011)
  21. Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A. International Archives of Allergy and Immunology. 164 (2), 122-136 (2014).
  22. Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS. Immunology and Cell Biology. 90 (8), 784-795 (2012).
  23. Directive 2010/63 / EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union Available from: https://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:En:PDF (2010)
  24. Colvin, R. B., Dvorak, H. F. Role of the clotting system in cell-mediated hypersensitivity. II. Kinetics of fibrinogen/fibrin accumulation and vascular permeability changes in tuberculin and cutaneous basophil hypersensitivity reactions. Journal of Immunology. 114, 377-387 (1975).
  25. Szczepanik, M., et al. Regulation of contact sensitivity in non-obese diabetic (NOD) mice by innate immunity. Contact Dermatitis. 79 (4), 197-207 (2018).
  26. Askenase, P. W., Majewska-Szczepanik, M., Kerfoot, S., Szczepanik, M. Participation of iNKT cells in the early and late components of Tc1-mediated DNFB contact sensitivity: Cooperative role of γδ-T cells. Scandinavian Journal of Immunology. 73 (5), 465-477 (2011).
  27. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity. Pharmacological Reports. 64 (6), 1485-1496 (2012).
  28. Van Loveren, H., et al. Use of micrometers and calipers to measure various components of delayed-type hypersensitivity ear swelling reactions in mice. Journal of Immunological Methods. 67 (2), 311-319 (1984).
  29. Tsuji, R. F., et al. B cell-dependent T cell responses: IgM antibodies are required to elicit contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 196 (10), 1277-1290 (2002).
  30. Campos, R. A., et al. Cutaneous immunization rapidly activates liver invariant Valpha14 NKT cells stimulating B-1 B cells to initiate T cell recruitment for elicitation of contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1785-1796 (2003).
  31. Rühl-Muth, A. C., Maler, M. D., Esser, P. R., Martin, S. F. Feeding of a fat-enriched diet causes the loss of resistance to contact hypersensitivity. Contact Dermatitis. 85 (4), 398-406 (2021).
  32. Bour, H., et al. histocompatibility complex class I-restricted CD8+ T cells and class II-restricted CD4+ T cells, respectively, mediate and regulate contact sensitivity to dinitrofluorobenzene. European Journal of Immunology. 25 (11), 3006-3010 (1995).
  33. Majewska-Szczepanik, M., et al. Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice. Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).
  34. Katagiri, K., Arakawa, S., Kurahashi, R., Hatano, Y. Impaired contact hypersensitivity in diet-induced obese mice. Journal of Dermatological Science. 46 (2), 117-126 (2007).
  35. Bouloc, A., Cavani, A., Katz, S. I. Contact hypersensitivity in MHC class II-deficient mice depends on CD8 T lymphocytes primed by immunostimulating Langerhans cells. The Journal of Investigative Dermatology. 111 (1), 44-49 (1998).
  36. Martin, S., et al. Peptide immunization indicates that CD8+ T cells are the dominant effector cells in trinitrophenyl-specific contact hypersensitivity. The Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 260-266 (2000).
  37. Vennegaard, M. T., et al. Epicutaneous exposure to nickel induces nickel allergy in mice via a MyD88-dependent and interleukin-1-dependent pathway. Contact Dermatitis. 71 (4), 224-232 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 187Murin modelialerjik kontakt dermatit AKBkontakt a r duyarl l k CHSkulak i mesivask ler ge irgenlikmiyeloperoksidaz MPOsitokinler246 trinitroklorobenzen TNCBhapten

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır