АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Контактная гиперчувствительность (СГС) является мышиной экспериментальной моделью аллергического контактного дерматита (АКД). CHS основан на сенсибилизации реактивным гаптеном путем окрашивания бритой кожи грудной клетки и живота, с последующим вызовом кожи уха с разбавленным гаптеном, вызывая реакцию отека, которая оценивается различными способами.

Аннотация

Контактная гиперчувствительность (CHS) является экспериментальной моделью аллергического контактного дерматита (ACD), которая может быть изучена на мышах. Это исследование направлено на представление объективного лабораторного метода, который может помочь изучить реакцию CHS у мышей, которая может быть измерена и количественно определена различными тестами. Чтобы индуцировать CHS, в день «0» мышей сенсибилизировали на ранее выбритом месте путем окрашивания брюшной кожи гаптеном 2,4,6-тринитрохлорбензолом (TNCB) в смеси ацетона-этанола, тогда как отрицательные контрольные мыши были фиктивно сенсибилизированы смесью транспортного средства-ацетона-этанола. На день «4» базовую толщину уха измеряли микрометром до выявления CHS (вызова) путем окрашивания обоих ушей разбавленным TNCB как в тестовой, так и в контрольной группах. Через 24 ч отек уха измеряли микрометром. CHS является примером Опосредованного Т-клетками иммунного ответа, который вызывает отек в воспаленной ткани, достигая пика через 24 ч после того, как кожа бросает вызов с тем же гаптеном. Увеличение отека уха коррелировало с увеличением веса уха, активностью миелопероксидазы (МПО), провоспалительной концентрацией цитокинов в экстрактах уха, повышенным утолщением отечной дермы при гистологическом исследовании и проницаемостью сосудов уха. Также наблюдалось увеличение концентрации TNP-специфических антител IgG1 в сыворотках тестовой группы по сравнению с контрольными мышами. Кроме того, CHS может быть успешно передан с CHS-эффекторными клетками, полученными от доноров, ранее сенсибилизированных TNCB. CHS-эффекторные клетки вводили внутривенно наивным мышам-реципиентам, которым впоследствии бросали вызов тем же разбавленным гаптеном. Отек уха измеряли микрометром через 24 часа.

Введение

Аллергический контактный дерматит (ACD) является распространенным воспалительным заболеванием кожи в промышленно развитых странах, вызванным реакцией гиперчувствительности IV типа, возникающей в результате воздействия низкомолекулярных химических веществ, называемых гаптенами. Вещества, вызывающие контактную сенсибилизацию у людей, включают ионы тяжелых металлов (хром, никель, железо, кобальт), скипидар, ароматизаторы, красители и консерванты, присутствующие в косметике (например,-фенилендиамин), некоторые лекарства (например, неомицин, бензокаин), β-лактамные антибиотики (т.е. пенициллин), химические вещества, производимые растениями (пентадекакатехол, вещество, присутствующее в ядовитом плюще), а также гидрохинон, используемый в фотографической промышленности 1,2 . Этиологические агенты ACD очень высоки, так как более 100 000 химических веществ используются только в промышленности, и 2000 новых синтезируются каждый год. На сегодняшний день идентифицировано более 3 700 молекул, которые могут быть контактными гаптенами/аллергенами3. Реакция контактной гиперчувствительности (CHS) представляет собой экспериментальную модель ACD, которая может быть изучена на мышах, морских свинках и крысах и может быть индуцирована местным применением в кожу реактивных химических гаптенов, растворенных в органических растворителях 4,5,6. Это исследование направлено на описание объективного лабораторного метода, который может помочь изучить реакцию CHS у мышей, которая может быть измерена и количественно определена различными тестами.

CHS состоит из фаз сенсибилизации (индукции) и эффекторной (вызов). На животных моделях гаптены сначала связываются ковалентно с белками в организме для создания неоантигенов. Во время фазы сенсибилизации активированные кератиноциты способствуют миграции и созреванию дендритных клеток кожи (sDC), продуцируя провоспалительные цитокины-фактор некроза опухоли α (TNF-α) и интерлейкин 1β (IL-1β)7. Эпидермальные клетки Лангерганса (LC) представляют антигены во время индукционной и эффекторной фазCHS 8. ЛК, подвергающиеся воздействию гаптена во время сенсибилизации, способствуют индукции как регуляторных, так и эффекторных клеток9. Растущие данные нескольких исследований свидетельствуют о том, что ответы CHS могут быть опосредованы либо CD4 + MHC клетками Th1 класса II, локально высвобождающими интерферон-γ (IFN-γ) для использования характерного воспалительного инфильтрата, CD8 + MHC класса I-ограниченных лимфоцитов Tc1, которые также могут высвобождать IFN-γ но в основном опосредуют цитотоксическое повреждение кератиноцитов, а теперь также интерлейкин 17 (IL-17), продуцирующие клетки Th1710, 11.

Разработано несколько различных моделей CHS, использующих различные виды1 2,13,14 и гаптены (подробное сравнение различных гаптенов, растворителей и времени применения обобщено в таблице 1). Мышь, часто используемый лабораторный вид, предлагает несколько преимуществ в изучении CHS. Среди мышей больше штаммов, нокаутов (КО) и трансгенных животных по сравнению с другими видами, что делает их очень привлекательным животным15. Кроме того, модель CHS требует много животных, и мыши здесь более экономичны. Животные модели не имитируют ACD во всех аспектах; в частности, они показывают корку и шелушение, что не характерно для человека 16,17. Признаки хронического заболевания сложно воспроизвести, главным образом потому, что описанная модель не предполагает применения гаптена в течение длительного периода времени. Однако здесь было подтверждено, что многие из важных аспектов ACD воспроизводятся. Также было показано, что, как и у человека, эти особенности связаны с местными аллергическими реакциями. Выбор гаптена, его растворителя и его применение, изложенное в этом протоколе, были продиктованы тем фактом, что результаты были подтверждены многочисленными тестами in vitro и что он был протестирован и модифицирован в лаборатории в течение многих лет, пока не была установлена текущая версия. Мышиные модели позволяют анализировать подмножества клеток или цитокины, которые участвуют в развитии ACD и необходимы для доклинических оценок новых методов лечения.

протокол

Все эксперименты, представленные в этой статье, были проведены в соответствии с руководящими принципами 1-го Местного этического комитета по испытаниям на животных в Кракове. Все описанные процедуры были выполнены в соответствии с местными рекомендациями, особенно в отношении использования кетамина / ксилазина в качестве анестетика, использования обеих сторон ушей для нанесения вещества / гаптена, отрезания уха и сбора крови путем удаления глазного яблока. Для настоящего исследования использовались BALB/c (гаплотип H-2d), CBA/J (H-2k) и C57BL/6 (H-2b) самцы и самки мышей в возрасте 6-12 недель (см. Таблицу материалов). Для статистической значимости лучше всего, если каждая группа мышей состоит из 10-12 животных.

1. Подготовка животных

  1. Очистите операционный стол 70% раствором этанола до и после всех процедур. При использовании мышей, требующих стерильных условий, выполните все операции в шкафу биобезопасности.

2. Маркировка мышей для идентификации

  1. Пометьте мышей, сбрив кожу лезвием бритвы: #0 - без опознавательных знаков, #2 - на правой передней лапе, #3 - на правой стороне, #4 - на правой задней лапе, #5 - у основания хвоста, #6 - на левой задней лапе, #7 - на левой стороне, #8 - на левой передней лапе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за индуцированной реакции мыши не могут быть классически помечены ударами по уху или маркировкой. Мышей не анестезировали во время маркировки.

3. Индукция CHS

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура показана на рисунке 1.

  1. Выполните сенсибилизацию (индукцию), выполнив следующие действия.
    1. В день «0» побрить мышей на груди и животе (квадрат 2 см х 2 см) нанеся серое мыло с водой и побрив лезвием бритвы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед нанесением гаптена подождите 6 ч, чтобы кожа не раздражалась.
    2. Готовят 5% гаптена: 2,4,6-тринитрохлорбензол (TNCB, см. Таблицу материалов) в смеси ацетон-этанол (соотношение 1:3) или только в транспортном средстве (ацетон-этанол). Подготовьте растворы непосредственно перед использованием в стеклянном флаконе и защитите его от света, накрыв флакон алюминиевой фольгой.
    3. В тот же день сенсибилизируйте мышей, нанеся 150 мкл 5% гаптена на ранее выбритое место. В группе контрольных мышей применяют только транспортное средство для оценки неспецифической воспалительной реакции. Прежде чем поместить животное обратно в клетку, подождите 30 секунд, дав гаптену высохнуть.
      ВНИМАНИЕ: Используйте перчатки; TNCB вызывает тяжелую аллергическую реакцию у большинства людей.
  2. Выполните выявление (вызов) и измерение отека уха.
    1. На день «4» готовят 0,4% гаптена: ТНКБ в ацетон-этаноловой смеси (соотношение 1:1). Подготовьте раствор непосредственно перед использованием в стеклянном флаконе и защитите его от света, накрыв флакон алюминиевой фольгой.
    2. Обезболивают мышей внутрибрюшинной (т..) инъекцией смеси кетамина (90-120 мг/кг) и ксилазина (5-10 мг/кг) (см. Таблицу материалов) для глубокой анестезии. Убедитесь, что мышь полностью обезболена в течение не менее 5 минут.
    3. Измерьте толщину уха (измерение 0 ч, базовая линия) микрометром (см. Таблицу материалов) наблюдателем, не знающим об экспериментальных группах.
    4. Применяют 10 мкл 0,4% гаптена на обе стороны ушей в обеих группах (тестовая и контрольная). Прежде чем поместить животное обратно в клетку, подождите 30 секунд и дайте гаптену высохнуть.
    5. На днем "5", через 24 ч после нанесения гаптена, повторите шаги 3.2.2-3.2.3 для измерения в течение 24 ч.
    6. Оцените реакцию CHS, рассчитав разницу в толщине ушной раковины до и после вызова с гаптеном: толщина уха 24 ч (мкм) - толщина уха 0 ч (мкм). Подсчитывайте каждое ухо как отдельное измерение. Далее выражают отек уха в микрометрах (мкм) ± стандартной погрешности среднего значения (SEM) (таблица 2, рисунок 3).

4. Биопсия уха

  1. Непосредственно после 24-часового измерения толщины уха (когда мышь еще находится под глубоким наркозом) ножницами отрежьте уши как можно ближе к черепу. Соберите биопсию с дистальной стороны ушей, сделав перфоратор диаметром 6 мм с помощью биопсийного перфоратора (см. Таблицу материалов).
    1. Измерить вес уха (этап 4.2) и дополнительно выполнить один из следующих тестов на той же биопсии уха: анализ миелопероксидазы (MPO) (этап 4.3) или измерение in vitro концентрации цитокинов в ушных экстрактах (например, IFN-γ, IL-17A, TNF-α [этап 4.4]).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрежьте уши перед забором крови. После этой процедуры мыши должны быть усыплены (например, при вывихе шейки матки).
  2. Измерьте вес каждой биопсии уха на аналитических весах и выразите его в миллиграммах (мг) (рисунок 4).
  3. Выполните анализ MPO, выполнив следующие действия.
    1. Получают буфер гомогенизации путем растворения 0,5% гексадецилтриметиламмония бромида в 50 ммоль фосфоратном буфереKH2PO4/Na2HPO4 и регулировки рН до 6,0 (используют при комнатной температуре, RT).
    2. Гомогенизируйте биопсию в микроцентрифужных пробирках объемом 2 мл с 500 мкл подготовленного буфера в течение 10 мин с помощью гомогенизатора с шариками из нержавеющей стали диаметром 5 мм (добавьте два шарика на флакон) (см. Таблицу материалов). Затем охладите образец в течение 15 мин при 4 °C и гомогенизируйте его еще на 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микроцентрифужные трубки имеют круглое дно, так что бусины могут легко двигаться.
    3. Заморозить гомогенаты при −20 °C в течение 30 мин. Оттепель и вихрь (убедитесь, что образцы разморожены). Повторите эту процедуру 3x.
    4. Центрифугировать гомогенаты при 3 000 х г в течение 30 мин при 4 °C. Собирайте супернатанты с помощью пипетки. Экспрессируют активность МПО в единицах (U) на 1 мг белка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Образцы стабильны при температуре −20 °C в течение 3 месяцев.
    5. Для измерения активности МПО проводят ферментативную реакцию путем смешивания 20 мкл супернатанта и 200 мкл субстрата МПО (0,167 мг/мл орто-дианизина дигидрохлорида в 50 ммоль буфера KH2PO4/Na2HPO4 с 5 x 10−4% H202) и добавляют в 96-луночные плоскодонные пластины. Инкубировать пластины в течение 20 мин на RT.
    6. Подготовьте стандартную кривую, используя 20 мкл стандарта MPO в концентрациях от 0,008 U до 0,5 U в 200 мкл подложки MPO. Подготовьте пустой образец только с помощью подложки MPO.
      ВНИМАНИЕ: Используйте маску во время работы с орто-дианизин дигидрохлоридом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины должны быть изготовлены из полипропилена, который имеет более низкую связывающую способность, поэтому белки или ДНК не будут связываться.
    7. Измерьте оптическую плотность (OD) на длине волны λ = 460 нм. Ферментативная реакция стабильна в течение 10 мин. Считывание активности MPO в тестируемых образцах со стандартной кривой.
    8. Чтобы измерить концентрацию белка, используйте 20 мкл надосадочного вещества, выполните тест с набором бицинхониновой кислоты для определения белка (см. Таблицу материалов) и измерьте OD при λ = 562 нм (рисунок 5).
  4. Выполните in vitro измерение цитокинов в экстракте уха.
    1. Гомогенизируйте биопсию уха при RT в микроцентрифужных трубках объемом 2 мл с реагентом экстракции тканевого белка (T-PER) в течение 10 минут с использованием гомогенизатора с шариками из нержавеющей стали диаметром 5 мм (добавьте две бусины / флакон). Затем охладите образец в течение 15 мин при 4 °C и гомогенизируйте его еще на 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микроцентрифужные трубки имеют круглое дно, так что бусины могут легко двигаться.
    2. Центрифугировать гомогенаты при 3 000 х г в течение 30 мин при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Образцы стабильны при −80 °C в течение 6 месяцев.
    3. Оцените уровни цитокинов с помощью коммерчески доступного набора ИФА (например, IFN-γ) (см. Таблицу материалов) следуя инструкциям производителя (рисунок 6).

5. Гистология ткани уха

  1. Непосредственно после 24-часового измерения толщины уха, когда мышь еще глубоко обезболена, ножницами отрезают уши как можно ближе к черепу (шаг 4.1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После этой процедуры мыши должны быть усыплены (например, при вывихе шейки матки).
  2. Выполните парафиновое встраивание тканевых блоков, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Непосредственно после удаления поместите ухо в ~10 мл 10% формалина в течение 24 ч.
    2. Поместите уши в кассету для обработки тканей. Поместите кассеты в автоматизированный процессор (см. Таблицу материалов) для циклов обезвоживания (спирт 70%, 90%, 100%, 30 мин каждый при RT), циклов очистки (ксилол 3x, 30 мин каждый при RT) и циклов инфильтрации воска (парафин 3x, 30 мин каждый при 56 °C).
    3. Извлеките кассеты из автоматизированного процессора и держитесь за нагревательную пластину до тех пор, пока это потребуется. Наполните восковую форму теплым воском (из дозатора).
    4. Снимите секции с кассеты с подогретыми щипцами и поместите их в форму; Затем поместите кассетную основу на верхнюю часть формы, а затем заполните ее большим количеством воска. Поместите его в охлажденную воду на холодную пластину на 30 минут, чтобы парафин затвердел и образовал блок, содержащий образец.
    5. Используйте вращающийся микротом (см. Таблицу материалов) для резки срезов толщиной ~ 5 мкм. Поместите секции в теплую ванну, чтобы выровнять их. Поднимите секции на предметное стекло микроскопа. Дайте им высохнуть в RT, чтобы секции прилипли к слайду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте слайды, которые устраняют необходимость наносить адгезивные материалы или белковые покрытия, чтобы предотвратить потерю участков ткани во время окрашивания.
  3. Выполните окрашивание гематоксилином и эозином (H&E).
    1. Приготовьте 17 окрашивающих блюд следующим: ксилол (четыре блюда), 100% этанол (абсолютный спирт) (четыре блюда), 90% этанол, 80% этанол, 70% этанол, 50% этанол, PBS (три блюда), раствор гематоксилина, раствор эозина. Перенесите слайды с одного блюда на другое в соответствии с приведенными ниже шагами и выполните все на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура в каждом блюде может быть повторена примерно в 10 раз (например, если используется блюдо с 20 слайдами, можно сделать 200 пятен без замены жидкости).
    2. Депарафинизируют срезы путем инкубации при 65 °C в течение 30 мин в инкубаторе. Погрузите слайды в ксилол на 30 мин. Повторите 1 раз в новом ксилоле в течение 30 мин.
    3. Погрузите слайды в 100% этанол на 5 мин. Повторяют 1 раз в новом 100% этаноле в течение 5 мин. Погружайте слайды в ряд этанола, 90%, 80%, 70% и 50%, в течение 2 мин в каждом разведении.
    4. Погрузите слайды в фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) на 5 минут. Протрите лишнюю жидкость вокруг ткани и обратной стороны слайдов.
    5. Окрашивают срезы в раствор гематоксилина (см. Таблицу материалов) в течение 7-8 мин. Промывайте в проточной воде в течение 30 с обратной стороны, чтобы не повредить секции. Повторите шаг 5.3.4.
    6. Окрашивают срезы раствором эозина (см. Таблицу материалов) на 30 с. Вымойте, как указано на этапе 5.3.5, а затем повторите этап 5.3.4.
    7. Погрузите слайды в 100% этанол (абсолютный спирт) на 2 мин. Повторяют 1 раз в новом 100% этаноле в течение 2 мин.
    8. Погрузите слайды в ксилол на 5 минут. Повторите 1 раз в новом ксилоле в течение 5 мин.
    9. Дайте секциям высохнуть на воздухе в течение 15 минут на RT. Добавьте каплю монтажного материала (см. Таблицу материалов) на крышку, а затем поместите ее в верхнюю часть секции.
  4. Осмотрите участок под световым микроскопом под увеличением в 20 или 40 раз и захватите изображения (рисунок 7).

6. Тест на проницаемость сосудов

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы измерению толщины уха может быть выполнен тест на проницаемость сосудов.

  1. Сенсибилизируйте мышей в день «0» (шаги 3.1.1-3.1.3), а затем, в день «4», обезболивайте мышей (шаг 3.2.2) и непосредственно наносите гаптен на уши (шаг 3.2.4), пропуская измерение уха за 0 ч.
  2. Через 23 ч после вызова обезболивают мышей (шаг 3.2.2).
  3. Вводят внутривенно (т.е.в.) 8,3 мкл/г массы тела 1% синего красителя Эванса (см. Таблицу материалов) в фосфатно-буферном физиологическом растворе Dulbecco(DPBS).
  4. Обезболивают мышей снова глубокой анестезией (шаг 3.2.2)-1 ч после синей инъекции Эванса.
  5. Соберите биопсию уха (шаг 4.1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После этой процедуры мыши должны быть усыплены (например, при вывихе шейки матки).
  6. Извлеките краситель из ткани, поместите ушные пунши в пробирки, содержащие 1 мл формамида, и инкубируйте при 37 °C в атмосфере 5% CO2 в течение 18 ч.
  7. Центрифугируйте биопсию при 3000 х г в течение 3 мин при RT. Соберите супернатанты с помощью пипетки.
  8. Измерьте OD на длине волны λ = 565 нм в 96-луночных плоскодонных пластинах по заготовке, содержащей формамид. Цвет стабилен в течение 24 ч. Считывание концентрации испытуемых образцов со стандартной кривой (используйте концентрации эвансовского синего цвета в диапазоне от 0,2 до 30 мкг красителя/мл формамида) (рисунок 8).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины должны быть изготовлены из полипропилена, который имеет более низкую связывающую способность, поэтому белки или ДНК не будут связываться.

7. Сывороточный сбор и измерение антител к иммуноглобулину tNP (IgG1)

  1. После сбора биопсии уха (шаг 4.1), когда мышь еще находится под глубоким наркозом, удаляют глазное яблоко пинцетом, мягко давят на мышь, а также собирают кровь из ретроорбитального синуса в трубку (флакон с гелем для получения сыворотки, см. Таблицу материалов). Альтернативным методом сбора крови может быть прокол сердца шприцем и сбор крови.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь должна быть собрана после удаления ушей. Один и тот же метод кровотечения должен использоваться во всем исследовании из-за потенциальных различий в параметрах крови18. После этой процедуры мышей необходимо усыпить (например, при вывихе шейки матки).
  2. Инвертировать минимум 6x, подождать 30 мин, пока кровь свернется, а затем центрифугировать при 1,300-2,000 x g в течение 10 мин при RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Образец стабилен при −20 °C в течение 6 месяцев.
  3. Покрыть 96-луночную плоскодонную пластину 50 мкл бычьего сывороточного альбумина, конъюгированного с 2,4,6-тринитрофенилом (TNP-BSA), растворенным в DPBS при согласовании 10 мкг/мл. Далее покрывают вторую пластинку только бычьим сывороточным альбумином (BSA), растворенным в DPBS (фон) в концентрации 10 мкг/мл. Инкубировать в течение ночи при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сыворотка мыши содержит антитела (Abs) против BSA, поэтому образцы должны быть проверены на обеих пластинах, а затем должен быть сделан расчет (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. Вымойте пластины с 300 мкл DPBS, содержащим 0,05% анимации 20. Повторите 3x.
  5. Приготовьте разбавитель (AD): DPBS, содержащий 1% BSA. Заблокируйте скважины с АД на 1 ч на РТ. Снова промывайте (шаг 7.4).
  6. Подготовьте внутренний стандарт (iSTD): сенсибилизируйте мышей с помощью TNCB (этапы 3.1.1-3.1.3), а через 10 дней после сенсибилизации соберите и опрашивайте сыворотку у всех доноров (этап 7.1 и шаг 7.2).
  7. Добавьте к пластине 50 мкл градуированных концентраций iSTD, разбавленных AD, для получения стандартной кривой (описанной в таблице 3). Добавьте к пластине 50 мкл образцов сыворотки. Протестируйте каждый образец и стандартную кривую на обеих пластинах (с покрытием TNP-BSA и BSA). Инкубировать в течение 2 ч на RT. Промыть пластины (шаг 7.4).
  8. Добавьте 50 мкл биотинилированного антимышечного моноклонального антитела IgG1 (mAb, см. Таблицу материалов), разведенного 1:250 с AD, и инкубируйте в течение 1 ч при RT. Снова промыть (этап 7.4).
  9. Добавьте 50 мкл хрена пероксидазы стрептавидина (HRD стрептавидин, см. Таблицу материалов), разбавленное 1:2000 с AD, и инкубируйте в течение 30 мин при RT в темноте. Вымойте пластину (шаг 7.4).
  10. Добавьте 50 мкл субстрата TMB (см. Таблицу материалов) и инкубируйте в течение 30 мин при RT в темноте.
  11. Прекращают ферментативную реакцию добавлением 25 мкл 1 МН2SO4; реакция стабильна в течение 30 мин.
  12. Измерьте OD на длине волны λ = 450 нм и фоне 570 нм (фон должен быть вычтен из каждых 450 нм измерения). При представлении результатов вычтите измерения BSA из TNP-BSA для образцов и стандартной кривой. Затем рассчитайте единицу (U) антител согласно стандартной кривой (рисунок 9).

8. Приемный перенос CHS-эффекторных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура показана на рисунке 2.

  1. Доноры (в соотношении один донор:1 реципиент): сенсибилизировать мышей с TNCB в день «0» (шаги 3.1.1-3.1.3).
  2. На день «4» обезболивают мышей – глубокой анестезией (шаг 3.2.2).
  3. Изолируют щипцами подмышечные и паховые лимфатические узлы (ALNs) и селезенку (SPLs). Объедините ALN в одном флаконе и SPL в другом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В каждой подмышечной подмышечной мышце есть один подмышечный лимфатический узел. Один паховый лимфатический узел в области тазобедренного сустава расположен рядом с тремя кровеносными сосудами. Селезенка расположена с левой стороны тела за кишечником и желудком19. Работа со стерильными инструментами в шкафу биобезопасности для поддержания стерильных условий. После этой процедуры мыши должны быть усыплены (например, при вывихе шейки матки).
  4. Размять ткань между матовыми концами двух слайдов микроскопа. Пропустите клеточную суспензию через клеточный сетчатый фильтр с размером пор 70 мкм (см. Таблицу материалов).
  5. Промывайте клетки DPBS, дополненным 1% фетальной бычьей сывороткой (FBS). Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин при 4 °C. Декантировать супернатант и повторно суспендировать оставшуюся клеточную гранулу в 1-5,0 мл DPBS.
  6. Подсчитайте живые клетки с помощью гемоцитометра20 с трипановым синим, и смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 90-990 мкл (в зависимости от количества клеток) трипанового синего. Учитывайте разбавление при вычислении количества клеток (10х-100х).
  7. Приготовьте смесь ALNs и SPLs (соотношение 1:1): от 8,0 x 106 до 7,0 x 107/мышь в 200 мкл DPBS.
  8. Реципиенты (наивные сингенные мыши): обезболивают наивных мышей-реципиентов (этап 3.2.2) и вводят в/в приготовленную смесь CHS-эффекторных клеток (этап 8.7). В контрольную группу мышей не вводят никаких клеток.
  9. Измерьте толщину уха до (0 ч) и после (24 ч) вызова (этапы 3.2.1-3.2.6) (рисунок 10).
  10. Кроме того, проводят тесты на изолированных CHS-эффекторных клетках (например, фенотипирование клеток или измерение продуцируемых цитокинов CHS-эффекторными клетками с помощью проточной цитометрии). Также могут быть установлены клеточные культуры, а способность CHS-эффекторных клеток к пролиферации в присутствии антигена или количества секретируемых цитокинов в культуре супернатантов может быть оценена21,22 (данные не представлены).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение дополнительных тестов требует соответственно большего количества доноров клеток.

Результаты

Для индукции CHS животных сенсибилизировали с помощью окраски кожи (брюшной полости) 150 мкл 5% TNCB или фиктивной сенсибилизации только с помощью транспортного средства. На день «4» реакции на отек ушей обоих ушей были вызваны контактной покраской (вызов) 10 мкл 0,4% TNCB у обеих мышей, ранее ?...

Обсуждение

CHS индуцируется через гаптены, которые связываются с собственными белковыми антигенами в коже, создавая неоантигены. CHS опосредован локальным внесосудистым рекрутированием циркулирующих антиген-специфических CHS-эффекторных Т-клеток, что приводит к отеку в проблемной ткани, дости...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано субвенцией SUBZ. A020.22.060 Медицинского университета во Вроцлаве, Польша, и по грантам Министерства науки и высшего образования N N401 545940 для MS и IP2012 0443 72 для MMS.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
70% ethanolMerck KGaA, Darmstadt, Germany65350-Mfor surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropyleneGreiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria655101for MPO and Evans blue measurement - plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%)Merck KGaA, Darmstadt, Germany179124
Aluminum foilMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ185140
Analytical balanceSartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, GermanyPRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processorMediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, IndiaMTP-E-212automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum)Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USABD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determinationMerck KGaA, Darmstadt, GermanyBCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA553441
BSA (bovine serum albumine)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyA9418protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μmBIOLOGIX, China15-1070suitable for 50 mL tubes
CoverslipVWR, Radnor, Pennsylvania, United States631-158324 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA14190144no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histologyMerck KGaA, Darmstadt, Germany6522mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers - straightAnimalab, Poznan, Poland11251-10FSTsurgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers - bentAnimalab, Poznan, Poland11272-50FSTsurgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholicMerck KGaA, Darmstadt, GermanyHT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppenforf, Germany3,01,20,086polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mLEppenforf, Germany3,01,20,094polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol)Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.07017
Ethanol 96%Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.59010
Evans blueMerck KGaA, Darmstadt, GermanyE2129
FBS (fetal bovine serum)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAA3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10%Merck KGaA, Darmstadt, GermanyHT501128
Formamide 99.5% (GC)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyF7503
Freezer -20 °CBosch, GermanyGSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °CBosch, GermanyKGV36V10mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost PlusVWR, Radnor, Pennsylvania, United States631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad PrismGraphPad Software Inc.v. 9.4.0
Grey soapPollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., PolandBialy jelen soap bargrey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M)Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.60313
Harris hematoxylin solutionMerck KGaA, Darmstadt, GermanyHHS16
HemocytometerVWR, Avantor, U.S.A612-5719manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromideMerck KGaA, Darmstadt, GermanyH5882
HomogenizerQIAGEN Hilden, GermanyTissue Lyser LT, SN 23.1001/05234homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin)Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USASA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyH1009
Incubator Heracell 150iThermo Electron LED Gmbh, Germany4107106837 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injectionBiowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Polandcat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basisMerck KGaA, Darmstadt, Germany1.05108
Laboratory CentrifugeHeraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, GermanyB00013899speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory CentrifugeHeraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany75002425speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2)VWR, Radnor, Pennsylvania, United States111-0917for working with ortho-dianisine dihydrochloride
MiceBreeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, PolandCBA/J, C57BL/6
MicrometerMitutoyo, Tokyo, Japan193-111digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test)Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria655061with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectivesLeica Microsystems CMS GmbH, GermanyDM1000, 294011-082007histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyM6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyS9390
Olive-oilMerck KGaA, Darmstadt, Germany75343pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA SetBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA555138
Ortho-dianisine dihydrochlorideMerck KGaA, Darmstadt, GermanyD3252
Paraffin waxMerck KGaA, Darmstadt, Germany76242beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA20012027pH 7.2, mammalian cell culture
ph meterElmetron, PolandCP-401
Pipettes, variable volume with tipsMerck KGaA, Darmstadt, GermanyEP3123000900-1EA3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor bladeVWR, Radnor, Pennsylvania, United StatesPERS94-0462scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtomeMRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UKHIS-202A
Scissors - straight, sharp / sharpAnimalab, Poznan, Poland14060-10FSTSurgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top)Merck KGaA, Darmstadt, Germany27056black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
SpectrophotometerBioTek Instruments, U.S.A201446universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 - 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 - 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rackMerck KGaA, Darmstadt, GermanyS6141e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mmIntegra LifeSciences, Princeton, NJ, USA33-36
Surgical scissorsAnimalab, Poznan, Poland52138-46surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettesMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ672122tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent SetBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene)Tokyo Chemical Industry CO., LTD, JapanC0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl)Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USAT-5050
T-PER (tissue protein extration reagent)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA78510
Tubes 15 mL sterileMerck KGaA, Darmstadt, GermanyCLS430055 (Corning)polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterileMerck KGaA, Darmstadt, GermanyCLS430290 (Corning)polypropylene, conical bottom
Tween 20Merck KGaA, Darmstadt, GermanyP1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Germany27173for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bathAJL Electronic, PolandLW102
Wax (paraffin) dispenserVWR, Radnor, Pennsylvania, United States114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injectionVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Polandcat.# not avaliable
Xylene (histological grade)Merck KGaA, Darmstadt, Germany534056

Ссылки

  1. Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. Allergic and irritant contact dermatitis. European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).
  2. Hertl, M., et al. Predominance of epidermal CD8+ T lymphocytes in bullous cutaneous reactions caused by beta-lactam antibiotics. The Journal of Investigative Dermatology. 101 (6), 794-799 (1993).
  3. Martin, S. F. T lymphocyte-mediated immune responses to chemical haptens and metal ions: implications for allergic and autoimmune disease. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (3), 186-198 (2004).
  4. Takeyoshi, M., Iida, K., Suzuki, K., Yamazaki, S. Skin sensitization potency of isoeugenol and its dimers evaluated by a non-radioisotopic modification of the local lymph node assay and guinea pig maximization test. Journal of Applied Toxicology. 28 (4), 530-534 (2008).
  5. Nakamura, K., Aizawa, M. Studies on the genetic control of picryl chloride contact hypersensitivity reaction in inbred rats. Transplantation Proceedings. 13 (2), 1400-1403 (1981).
  6. Asherson, G. L., Ptak, W. Contact and delayed hypersensitivity in the mouse. I. Active sensitization and passive transfer. Immunology. 15 (3), 405-416 (1968).
  7. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 133 (2), 303-315 (2013).
  8. Kaplan, D. H., Jenison, M. C., Saeland, S., Shlomchik, W. D., Shlomchik, M. J. Epidermal langerhans cell-deficient mice develop enhanced contact hypersensitivity. Immunity. 23 (6), 611-620 (2005).
  9. Wang, L., et al. Langerin expressing cells promote skin immune responses under defined conditions. Journal of Immunology. 180 (7), 4722-4727 (2008).
  10. Wang, B., et al. CD4+ Th1 and CD8+ type 1 cytotoxic T cells both play a crucial role in the full development of contact hypersensitivity. Journal of Immunology. 165 (12), 6783-6790 (2000).
  11. Mori, T., et al. Cutaneous hypersensitivities to hapten are controlled by IFN-gamma-upregulated keratinocyte Th1 chemokines and IFN-gamma-downregulated langerhans cell Th2 chemokines. The Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1719-1727 (2008).
  12. Peszkowski, M. J., Warfvinge, G., Larsson, A. Allergic and irritant contact responses to DNFB in BN and LEW rat strains with different TH1/TH2 profiles. Acta Dermato-Venereologica. 74 (5), 371-374 (1994).
  13. Henningsen, S. J., Mickell, J., Zachariae, H. Plasma kinins in dinitrochlorobenzene contact dermatitis of guinea-pigs. Acta Allergologica. 25 (5), 327-331 (1970).
  14. Maibach, H. I., Maguire, H. C. Elicitation of delayed hypersensitivity (DNCB contact dermatitis) in markedly panleukopenic guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 41, 123-127 (1963).
  15. Martel, B. C., Lovato, P., Bäumer, W., Olivry, T. Translational animal models of atopic dermatitis for preclinical studies. The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (3), 389-402 (2017).
  16. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 129 (1), 31-40 (2009).
  17. Li, Y. Z., Lu, X. Y., Jiang, W., Li, L. F. Anti-inflammatory effect of qingpeng ointment in atopic dermatitis-like murine model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2013, 907016 (2013).
  18. Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Experimental Hematology. 44 (2), 132-137 (2016).
  19. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50765 (2013).
  20. Hemocytometer - Counting of Cells. Amrita University Available from: https://www.youtube.com/watch?v=MKS0KM3lr90 (2011)
  21. Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A. International Archives of Allergy and Immunology. 164 (2), 122-136 (2014).
  22. Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS. Immunology and Cell Biology. 90 (8), 784-795 (2012).
  23. Directive 2010/63 / EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union Available from: https://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:En:PDF (2010)
  24. Colvin, R. B., Dvorak, H. F. Role of the clotting system in cell-mediated hypersensitivity. II. Kinetics of fibrinogen/fibrin accumulation and vascular permeability changes in tuberculin and cutaneous basophil hypersensitivity reactions. Journal of Immunology. 114, 377-387 (1975).
  25. Szczepanik, M., et al. Regulation of contact sensitivity in non-obese diabetic (NOD) mice by innate immunity. Contact Dermatitis. 79 (4), 197-207 (2018).
  26. Askenase, P. W., Majewska-Szczepanik, M., Kerfoot, S., Szczepanik, M. Participation of iNKT cells in the early and late components of Tc1-mediated DNFB contact sensitivity: Cooperative role of γδ-T cells. Scandinavian Journal of Immunology. 73 (5), 465-477 (2011).
  27. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity. Pharmacological Reports. 64 (6), 1485-1496 (2012).
  28. Van Loveren, H., et al. Use of micrometers and calipers to measure various components of delayed-type hypersensitivity ear swelling reactions in mice. Journal of Immunological Methods. 67 (2), 311-319 (1984).
  29. Tsuji, R. F., et al. B cell-dependent T cell responses: IgM antibodies are required to elicit contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 196 (10), 1277-1290 (2002).
  30. Campos, R. A., et al. Cutaneous immunization rapidly activates liver invariant Valpha14 NKT cells stimulating B-1 B cells to initiate T cell recruitment for elicitation of contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1785-1796 (2003).
  31. Rühl-Muth, A. C., Maler, M. D., Esser, P. R., Martin, S. F. Feeding of a fat-enriched diet causes the loss of resistance to contact hypersensitivity. Contact Dermatitis. 85 (4), 398-406 (2021).
  32. Bour, H., et al. histocompatibility complex class I-restricted CD8+ T cells and class II-restricted CD4+ T cells, respectively, mediate and regulate contact sensitivity to dinitrofluorobenzene. European Journal of Immunology. 25 (11), 3006-3010 (1995).
  33. Majewska-Szczepanik, M., et al. Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice. Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).
  34. Katagiri, K., Arakawa, S., Kurahashi, R., Hatano, Y. Impaired contact hypersensitivity in diet-induced obese mice. Journal of Dermatological Science. 46 (2), 117-126 (2007).
  35. Bouloc, A., Cavani, A., Katz, S. I. Contact hypersensitivity in MHC class II-deficient mice depends on CD8 T lymphocytes primed by immunostimulating Langerhans cells. The Journal of Investigative Dermatology. 111 (1), 44-49 (1998).
  36. Martin, S., et al. Peptide immunization indicates that CD8+ T cells are the dominant effector cells in trinitrophenyl-specific contact hypersensitivity. The Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 260-266 (2000).
  37. Vennegaard, M. T., et al. Epicutaneous exposure to nickel induces nickel allergy in mice via a MyD88-dependent and interleukin-1-dependent pathway. Contact Dermatitis. 71 (4), 224-232 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

187ACDCHSMPO246 TNCB

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены