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要約

接触過敏症(CHS)は、アレルギー性接触皮膚炎(ACD)のマウス実験モデルである。CHSは、胸部および腹部の剃毛された皮膚を塗ることによって反応性ハプテンによる感作に基づいており、その後の耳の皮膚の課題を希釈ハプテンで、様々な方法で評価される腫脹反応を引き起こす。

要約

接触過敏症(CHS)は、マウスで研究することができるアレルギー性接触皮膚炎(ACD)の実験モデルである。この研究は、様々な試験によって測定および定量化することができるマウスにおけるCHS反応を研究するのに役立つかもしれない客観的な実験室法を提示することを目的としている。CHSを誘導するために、「0」日目に、マウスをアセトン - エタノール混合物中のハプテン2,4,6−トリニトロクロロベンゼン(TNCB)による腹部皮膚塗装によって予め剃毛したスポット上で感作し、一方、陰性対照マウスは、ビヒクル単独 - アセトン - エタノール混合物で偽感作した。「4」日目に、試験群および対照群の両方で希釈TNCBで両耳を塗ることによってCHSの惹起(チャレンジ)の前にベースライン耳厚をマイクロメーターで測定した。24時間後、耳の腫れをマイクロメーターで測定した。CHSは、炎症を起こした組織に腫脹を引き起こすT細胞媒介性免疫応答の一例であり、同じハプテンによる皮膚チャレンジの24時間後にピークに達する。耳水腫の増加は、耳の体重の増加、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性、耳抽出物中の前炎症性サイトカイン濃度、組織学的検査における浮腫性真皮の肥厚の増加、および耳の血管透過性と相関した。対照マウスと比較した場合、試験群の血清中のTNP特異的IgG1抗体の濃度も増加した。さらに、CHSは、以前にTNCBで感作されたドナーから得られたCHSエフェクター細胞を用いて首尾よく転写することができる。CHSエフェクター細胞をナイーブレシピエントマウスに静脈内投与し、その後、同じ希釈ハプテンでチャレンジした。耳の腫れは、24時間後にマイクロメーターで測定した。

概要

アレルギー性接触皮膚炎(ACD)は、ハプテンと呼ばれる低分子量化学物質への曝露に起因するIV型過敏反応によって引き起こされる先進国における一般的な皮膚炎症性疾患である。ヒトにおける接触感作を引き起こす物質には、重金属イオン(クロム、ニッケル、鉄、コバルト)、テルペンチン、化粧品中に存在する香料、染料、および防腐剤(例えば、パラフェニレンジアミン)、いくつかの薬物(例えば、ネオマイシン、ベンゾカイン)、βラクタム系抗生物質(すなわち、ペニシリン)、植物によって産生される化学物質(ペンタデカカテコール、ポイズンツタに存在する物質)、ならびに写真産業で使用されるヒドロキノンが含まれる1,2.ACD病因薬は、産業だけで100,000以上の化学物質が使用され、毎年2,000の新しい化学物質が合成されているため、非常に高いです。現在までに、ハプテン/アレルゲンに接触している可能性のある3,700以上の分子が同定されています3。接触過敏反応(CHS)は、マウス、モルモット、ラットで研究することができ、有機溶媒に溶解した反応性化学ハプテンの局所皮膚適用によって誘発され得るACDの実験モデルである4,5,6。この研究は、様々な試験によって測定および定量化することができるマウスにおけるCHS反応を研究するのに役立つかもしれない客観的な実験室法を記述することを目的としている。

CHSは感作(誘導)相とエフェクター(チャレンジ)相からなる。動物モデルでは、ハプテンはまず体内のタンパク質に共有結合してネオ抗原を作り出します。感作期の間、活性化ケラチノサイトは、炎症誘発性サイトカイン腫瘍壊死因子α(TNF-α)およびインターロイキン1β(IL-1β)7を産生することにより、皮膚樹状細胞(sDC)の遊走および成熟を促進する7。表皮ランゲルハンス細胞(LC)は、CHS誘導およびエフェクター相8の間に抗原を提示する。感作中にハプテンに曝露されたLCは、調節細胞およびエフェクター細胞の両方の誘導を促進する9。いくつかの研究からの証拠の増加は、CHS応答が、CD4+ MHCクラスII制限性Th1細胞、特徴的な炎症性浸潤物を採用するためにインターフェロンγ(IFN-γ)を局所的に放出すること、IFN-γも放出することができるが、ほとんどがケラチノサイトへの細胞傷害性損傷を媒介するCD8+ MHCクラスI制限性Tc1リンパ球、および現在インターロイキン17(IL-17)産生Th17細胞10によって媒介され得ることを示唆している。11.

様々な種1 2、13、14およびハプテンを用いたいくつかの異なるCHSモデルが開発されている(異なるハプテン、溶媒、および適用時間の詳細な比較は表1に要約されている)。頻繁に使用される実験種であるマウスは、CHSの研究においていくつかの利点を提供する。マウスには他の種に比べて系統、ノックアウト(KO)、トランスジェニック動物が多く、非常に魅力的な動物となっています15。さらに、CHSモデルには多くの動物が必要であり、マウスはここでより経済的です。動物モデルは、すべての面でACDを模倣するわけではない。特に、彼らは人間には一般的ではない痂皮と落屑を示しています16,17。慢性疾患の特徴は、主に記載されたモデルが長期間にわたってハプテンの適用を想定していないため、再現が困難である。しかし、ACDの重要な側面の多くが再現されていることがここで確認されています。また、ヒトと同様に、これらの特徴は局所アレルギー反応と関連していることも示されている。このプロトコルで概説されているハプテン、その溶媒、およびその用途の選択は、結果が多数のインビトロ試験によって確認されており、現在のバージョンが確立されるまで長年にわたって実験室で試験および修正されたという事実によって決定された。マウスモデルは、ACDの発症に関与し、新しい治療法の前臨床評価に不可欠な細胞サブセットまたはサイトカインの分析を可能にする。

プロトコル

この記事で紹介したすべての実験は、クラクフの第1回動物実験に関する地方倫理委員会のガイドラインに従って実施されました。記載されているすべての手順は、特にケタミン/キシラジンを麻酔薬として使用すること、耳の両側を使用して物質/ハプテンを塗布すること、耳を切り落とすこと、および眼球除去による血液の採取に関して、地元の勧告に従って実施された。本研究には、生後6~12週のBALB/c(ハプロタイプH-2d)、CBA/J(H-2k)、およびC57BL/6(H-2b)雄および雌マウスが用いられた( 資料表参照)。統計的有意性のためには、マウスの各群が10〜12匹の動物からなる場合が最善である。

1. 動物用製剤

  1. すべての手順の前後に70%エタノール溶液で手術台を清掃してください。無菌条件を必要とするマウスを使用する場合は、すべての操作をバイオセーフティキャビネットで実行してください。

2. 識別のためのマーキングマウス

  1. #0 - マークなし、#2 - 右前足、#3 - 右前足、#4 - 右後足、#5 - 尾の付け根、#6 - 左後足、#7 - 左側、#8 - 左前足。
    注:誘導された反応のために、マウスは耳打ちまたはタグ付けによって古典的にマークすることができない。マウスを標識しながら麻酔をかけなかった。

3. CHSの誘導

メモ: この手順を 図 1 に示します。

  1. 以下の手順に従って感作(誘導)を行います。
    1. 「0」日目に、灰色の石鹸を水で塗り、カミソリの刃で剃ることによって、胸部と腹部(正方形2cm x 2cm)のマウスを剃る。
      注:ハプテンを塗布する前に、皮膚が刺激されないように6時間待ってください。
    2. 5%ハプテン:2,4,6-トリニトロクロロベンゼン(TNCB、 材料表を参照)をアセトン-エタノール混合物(比率1:3)またはビヒクル単独(アセトン-エタノール)で調製する。ガラスバイアルで使用する直前に溶液を調製し、バイアルをアルミニウム箔で覆って光から保護します。
    3. 同じ日に、以前に剃毛したスポットに5%ハプテンの150μLを塗布することによってマウスを感作させる。対照マウスの群において、非特異的炎症反応を評価するためにビヒクルを単独で適用する。動物をケージに戻す前に、30秒待ってハプテンを乾燥させます。
      警告: 手袋を使用してください。TNCBは、ほとんどの人に重度のアレルギー反応を引き起こす。
  2. 惹起(チャレンジ)と耳の腫れ測定を行います。
    1. 「4」日目に、アセトン - エタノール混合物(比1:1)中の0.4%ハプテン:TNCBを調製する。ガラスバイアルで使用する直前に溶液を調製し、バイアルをアルミニウム箔で覆って光から保護します。
    2. 深い麻酔のために、ケタミン(90〜120mg / kg)およびキシラジン(5〜10mg / kg)の混合物の腹腔内(すなわち)注射( 材料表を参照)でマウスを麻酔する。マウスがつま先のつまみで少なくとも5分間完全に麻酔をかけていることを確認します。
    3. 実験群を知らない観察者によってマイクロメーター( 材料表を参照)で耳の厚さ(0時間測定、ベースライン)を測定します。
    4. 両群の耳の両側に0.4%ハプテンを10μL塗布する(試験および対照)。動物をケージに戻す前に、30秒待ってからハプテンを乾燥させます。
    5. ハプテン塗布後24時間の「5」日目に、24時間の測定のためにステップ3.2.2-3.2.3を繰り返します。
    6. ハプテンによるチャレンジの前後の耳介の厚さの差を計算することによってCHS応答を評価する:24時間の耳の厚さ(μm)-0時間の耳の厚さ(μm)。各耳を別々の測定値として数えます。次に、耳の腫れをマイクロメートル(μm)±平均の標準誤差(SEM)で表した(表2、 図3)。

4. 耳生検

  1. 耳の厚さを24時間測定した直後(マウスがまだ深い麻酔下にある場合)に、はさみで頭蓋骨の近くにできるだけ耳を切り落とします。生検パンチを用いて直径6mmのパンチを作って、耳の遠位側から生検を採取する( 材料表参照)。
    1. 耳の重量を測定し(ステップ4.2)、さらに同じ耳生検で以下の試験のいずれかを実行します:ミエロペルオキシダーゼ(MPO)アッセイ(ステップ4.3)または耳抽出物中のサイトカイン濃度の インビトロ 測定(例えば、IFN-γ、IL-17A、TNF-α[ステップ4.4])。
      注:採血前に耳を切ってください。この手順の後、マウスを安楽死させなければならない(例えば、子宮頸部脱臼によって)。
  2. 分析天秤で各耳生検の重量を測定し、ミリグラム(mg)で表します(図4)。
  3. 以下のステップに従ってMPOアッセイを行う。
    1. 0.5%ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを50mmolのリン酸緩衝液KH2PO4/Na2HPO4に溶解し、pHを6.0に調整して均質化緩衝液を調製する(室温、RTで使用)。
    2. 直径5mmのステンレス製ビーズ(ビーズ/バイアルを2個追加)を備えたホモジナイザーを使用して、500 μLの調製バッファーを含む2 mLの微量遠心チューブで生検を10分間ホモジナイズします( 材料表を参照)。次に、サンプルを4°Cで15分間冷却し、さらに10分間均質化する。
      注:マイクロ遠心チューブは、ビーズが簡単に移動できるように丸い底部を備えています。
    3. ホモジネートを−20°Cで30分間凍結する。解凍と渦(サンプルが解凍されていることを確認してください)。この手順を 3 倍繰り返します。
    4. ホモジネートを3,000 x g で4°Cで30分間遠心分離する。 ピペットで上清を収穫する。MPO活性をタンパク質1mg当たりの単位(U)で表す。
      メモ: プロトコルはここで一時停止できます。サンプルは-20°Cで3ヶ月間安定しています。
    5. MPO活性を測定するには、上清20 μLとMPO基質200 μL(50 mmolのKH 2 PO 4/Na2HPO4バッファーに0.167 mg/mLのオルトジアニシン二塩酸塩を5 x 10-4%H20 2)を混合して酵素反応を行い、96ウェル平底プレートに添加します。プレートをRTで20分間インキュベートする。
    6. 200 μLのMPO基質中の0.008 Uから0.5 Uまでの濃度で20 μLのMPO標準物質を用いて標準曲線を作製する。MPO基板のみでブランクサンプルを作製する。
      警告: オルトジアニシン二塩酸塩を使用する際には、マスクを使用してください。
      注:プレートはポリプロピレン製でなければならず、タンパク質やDNAが結合しないように結合能力が低い。
    7. λ=460nmの波長における光学密度(OD)を測定する。酵素反応は10分間安定である。検量線から試験サンプル中のMPO活性を読み取ります。
    8. タンパク質濃度を測定するには、20 μLの上清を使用し、タンパク質測定用ビシンコニン酸キット( 材料表参照)で試験を行い、λ = 562 nmでODを測定します(図5)。
  4. 耳エキス中のサイトカインの インビトロ 測定を行う。
    1. 直径5 mmのステンレス製ビーズ(ビーズ/バイアルを2個追加)を備えたホモジナイザーを使用して、500 μLの組織タンパク質抽出試薬(T-PER)を含む2 mLの微量遠心チューブでRTで耳生検を10分間ホモジナイズします。次に、サンプルを4°Cで15分間冷却し、さらに10分間均質化する。
      注:マイクロ遠心チューブは、ビーズが簡単に移動できるように丸い底部を備えています。
    2. ホモジネートを3,000 x g で4°Cで30分間遠心分離する。
      メモ: プロトコルはここで一時停止できます。サンプルは−80°Cで6ヶ月間安定しています。
    3. 市販のELISAセット(例えば、IFN-γ)を用いてサイトカインレベルを評価し( 材料表を参照)、製造業者の指示に従って(図6)。

5. 耳組織の組織学

  1. 耳の厚さを24時間測定した直後に、マウスがまだ深く麻酔をかけられたら、はさみでできるだけ頭蓋骨の近くで耳を切り落とします(ステップ4.1)。
    注:この手順の後、マウスを安楽死させる必要があります(例えば、子宮頸部脱臼によって)。
  2. 以下の手順に従って組織ブロックのパラフィン包埋を行う。
    1. 除去直後に、耳を〜10mLの10%ホルマリンに入れ、24時間置く。
    2. 耳を組織処理カセットに入れます。脱水サイクル(RTでそれぞれ70%、90%、100%、30分)、クリアリングサイクル(キシレン3倍、RTで各30分)、およびワックス浸潤サイクル(パラフィン3倍、56°Cでそれぞれ30分)のために、カセットを自動プロセッサ( 材料表を参照)に入れます。
    3. 自動プロセッサーからカセットを取り外し、必要に応じて加温プレートをつかみます。ワックス型に暖かいワックス(ディスペンサーから)を充填します。
    4. 温めた鉗子でカセットからセクションを取り出し、金型に入れます。次に、カセットベースを金型の上部に置き、さらにワックスで塗ります。パラフィンが固化して試験片を含むブロックを形成するように、コールドプレート上の冷水に30分間置く。
    5. 回転ミクロトーム( 材料表を参照)を使用して、厚さ約5μmの切片を切断します。セクションを温かいお風呂に浮かべて平らにします。ガラス顕微鏡スライドに切片を拾います。RTで乾燥させて、セクションがスライドに付着していることを確認します。
      メモ:染色中の組織切片の損失を防ぐために、接着材料やタンパク質コーティングを塗布する必要がなくなるスライドを使用してください。
  3. ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色を行う。
    1. キシレン(4皿)、100%エタノール(無水アルコール)(4皿)、90%エタノール、80%エタノール、70%エタノール、50%エタノール、PBS(3皿)、ヘマトキシリン溶液、エオジン溶液で17の染色皿を準備する。以下の手順に従ってスライドを1つの皿から次の皿に移し、RTですべてを実行します。
      注:各皿の手順は約10倍繰り返すことができます(例えば、20スライドの皿を使用する場合、液体を変えずに200枚の汚れを作ることができます)。
    2. インキュベーター内で65°Cで30分間インキュベートすることにより切片を脱パラフィン化する。スライドをキシレンに30分間浸します。新しいキシレン中で1倍を30分間繰り返します。
    3. スライドを100%エタノールに5分間浸漬する。新しい100%エタノール中で1倍を5分間繰り返します。スライドをエタノール列に、90%、80%、70%、および50%、各希釈液に2分間浸漬する。
    4. スライドをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に5分間浸漬する。ティッシュの周りやスライドの裏側から余分な液体を拭き取ります。
    5. 切片をヘマトキシリン溶液( 材料表を参照)で7〜8分間染色する。断面を傷つけないように、裏側から流水で30秒間洗ってください。手順 5.3.4 を繰り返します。
    6. エオジン溶液( 材料表を参照)でセクションを30秒間染色します。手順 5.3.5 で説明したように洗浄してから、手順 5.3.4 を繰り返します。
    7. スライドを100%エタノール(無水アルコール)に2分間浸漬する。新しい100%エタノール中で1倍を2分間繰り返します。
    8. スライドをキシレンに5分間浸します。新しいキシレンで1xを5分間繰り返します。
    9. RT でセクションを 15 分間空気乾燥させます。カバースリップに取り付け用媒体 ( 材料表を参照) を 1 滴加え、セクションの上部に置きます。
  4. 倍率20倍または40倍の光学顕微鏡で断面を調べ、画像を撮影します(図7)。

6. 血管透過性試験

注:耳の厚さ測定と交互に、血管透過性試験を行うことができます。

  1. 「0」日目にマウスを感作し(ステップ3.1.1-3.1.3)、次いで「4」日目にマウスを麻酔し(ステップ3.2.2)、耳に直接ハプテンを塗布し(ステップ3.2.4)、0時間の耳測定を省略する。
  2. チャレンジ後23時間で、マウスを麻酔する(ステップ3.2.2)。
  3. 静脈内(すなわち)8.3 μL/g体重の1%エバンスブルー染料( 材料表を参照)をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に注入する。
  4. エバンスブルー注射後、マウスを再び深い麻酔(ステップ3.2.2)-1時間後に麻酔する。
  5. 耳生検を採取する(ステップ4.1)。
    注:この手順の後、マウスを安楽死させる必要があります(例えば、子宮頸部脱臼によって)。
  6. 組織から色素を抽出し、1mLのホルムアミドを含むチューブにイヤーパンチを入れ、5%CO2 の雰囲気中で37°Cで18時間インキュベートする。
  7. 生検を 3,000 x g で RT で 3 分間遠心分離します。上清をピペットで回収します。
  8. ホルムアミドを含むブランクに対して96ウェル平底プレートでλ=565nmの波長でODを測定する。色は24時間安定しています。標準曲線から試験サンプルの濃度を読み取ります(0.2~30 μgの色素/mLホルムアミドの範囲のエバンスブルーの濃度を使用)(図8)。
    注:プレートはポリプロピレン製でなければならず、タンパク質やDNAが結合しないように結合能力が低い。

血清採取および抗TNP免疫グロブリン(IgG1)抗体測定

  1. 耳生検を採取した後(ステップ4.1)、マウスがまだ深い麻酔下にあるときは、ピンセットで眼球を取り出し、マウスに穏やかな圧力をかけ、眼窩後洞からチューブに血液を採取する(血清を得るためのゲル付きバイアル、 材料表を参照)。血液を採取する別の方法は、注射器で心臓を穿刺し、血液を収集することである。
    注:耳を取り外した後、血液を採取する必要があります。血液パラメータの潜在的な違いのために、同じ出血方法が研究全体にわたって使用されなければならない18。この手順の後、マウスを安楽死させなければならない(例えば、子宮頸部脱臼によって)。
  2. 最低6倍に反転させ、血液が凝固するまで30分待ってから、RTで1,300-2,000 x g で10分間遠心分離します。
    メモ: プロトコルはここで一時停止できます。サンプルは−20°Cで6ヶ月間安定です。
  3. 96ウェル平底プレートを、10 μg/mLの協奏でDPBSに溶解した2,4,6-トリニトロフェニル(TNP-BSA)と結合させた50 μLのウシ血清アルブミンでコーティングします。次に、DPBS(バックグラウンド)に溶解したウシ血清アルブミン(BSA)のみを10μg/mLの濃度で2枚目のプレートをコーティングします。4°Cで一晩インキュベートする。
    注:マウス血清にはBSAに対する抗体(Abs)が含まれているため、サンプルを両方のプレートでテストする必要があり、次に計算を行う必要があります(OD TNP-BSA - OD BSA)。
  4. プレートを0.05%Tween 20を含む300μLのDPBSで洗浄します。3 倍繰り返します。
  5. アッセイ希釈剤(AD)を調製する:1%BSAを含むDPBS。RT で 1 時間 AD でウェルをブロックし、もう一度洗浄します (ステップ 7.4)。
  6. 内部標準物質(iSTD)を調製する:マウスをTNCBで感作し(ステップ3.1.1-3.1.3)、感作後10日目にすべてのドナーから血清を収集してポーリングする(ステップ7.1およびステップ7.2)。
  7. 標準曲線を作製するためにADで希釈した段階的な濃度のiSTDの50μLをプレートに加える( 表3に記載)。50 μLの血清サンプルをプレートに加える。両方のプレート(TNP−BSAおよびBSAコーティング)で各サンプルおよび標準曲線を試験する。RTで2時間インキュベートし、プレートを洗浄します(ステップ7.4)。
  8. ADで1:250に希釈したビオチン化抗マウスIgG1モノクローナル抗体(mAb、 材料表を参照)を50μL加え、RTで1時間インキュベートする(ステップ7.4)。
  9. ADで1:2000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼストレプトアビジン(HRDストレプトアビジン、 材料表参照)50μLを加え、暗所でRTで30分間インキュベートする。プレートを洗う(ステップ7.4)。
  10. 50 μLのTMB基質( 材料表を参照)を加え、暗所でRTで30分間インキュベートします。
  11. 25 μLの1 MH2SO4を添加することによって酵素反応を停止させる;反応は30分間安定である。
  12. 波長λ = 450 nm、バックグラウンド570 nmでODを測定します(バックグラウンドは450 nmの測定ごとに差し引く必要があります)。結果を提示するときは、サンプルおよび標準曲線のTNP-BSAからBSA測定値を差し引く。そして、標準曲線に従って抗体の単位(U)を算出する(図9)。

8. CHSエフェクター細胞の養子移入

メモ: この手順を 図 2 に示します。

  1. ドナー(1人のドナー:1レシピエントの比率で):「0」日目にTNCBでマウスを感作する(ステップ3.1.1-3.1.3)。
  2. 「4」日目に、マウスの深い麻酔を麻酔する(ステップ3.2.2)。
  3. 腋窩および鼠径リンパ節(ALN)および脾臓(SPL)を鉗子で単離する。1 つのバイアルの ALN と別のバイアルの SPL を一緒にプールします。
    注:各腋窩の胸筋の後ろに1つの腋窩リンパ節があります。股関節領域の1つの鼠径リンパ節は、3つの血管の隣に位置している。脾臓は、腸と胃の後ろの体の左側に位置しています19.バイオセーフティキャビネット内の滅菌ツールを使用して、滅菌状態を維持します。この手順の後、マウスを安楽死させなければならない(例えば、子宮頸部脱臼によって)。
  4. 2つの顕微鏡スライドのつや消し端の間のマッシュ組織。細胞懸濁液を孔径70μmのセルストレーナーに通します( 材料表を参照)。
  5. 1%ウシ胎児血清(FBS)を添加したDPBSで細胞を洗浄する。遠心分離機を300 x g で4°Cで10分間遠心分離する。 上清をデカントし、残りの細胞ペレットを1〜5.0mLのDPBSに再懸濁する。
  6. 血球計数器20 を用いて生細胞をトリパンブルーで計数し、10 μLの細胞懸濁液を90〜990 μL(細胞数に応じて)のトリパンブルーと混合する。細胞数を計算する際には希釈率を考慮に入れてください(10x-100x)。
  7. ALNとSPLの混合物(比1:1):200μLのDPBS中で8.0 x106 〜7.0 x 107 /マウスを調製する。
  8. レシピエント(ナイーブ同系マウス):ナイーブレシピエントマウスを麻酔し(ステップ3.2.2)、CHSエフェクター細胞の調製混合物をi.v.に注射する(ステップ8.7)。対照群のマウスでは、細胞を注入しないでください。
  9. チャレンジの前(0時間)と後(24時間)に耳の厚さを測定します(ステップ3.2.1-3.2.6)(図10)。
  10. さらに、単離されたCHSエフェクター細胞について試験を実施する(例えば、細胞表現型決定またはフローサイトメトリーによるCHSエフェクター細胞による産生サイトカインの測定)。細胞培養物も確立することができ、抗原の存在下で増殖するCHSエフェクター細胞の能力、または培養上清中に分泌されたサイトカインの量を21、22 (データは提示されていない)評価することができる。
    注:追加のテストを実行するには、それに応じてより多くの細胞ドナーが必要です。

結果

CHS誘導のために、動物を、150μLの5%TNCBまたは偽物を用いて、ビヒクル単独で感作した皮膚塗装(腹部) を介して 感作した。「4」日目に、TNCBで以前に接触感作したマウス(試験群)および対照群マウス(偽感作)の両マウスにおいて、0.4%TNCBの10 μLによる接触塗装(チャレンジ)により両耳の耳膨潤応答を誘導した。提示されたデータは、TNCBで感作し、4日後にチャレンジしたマウスが、同様にチ...

ディスカッション

CHSは、皮膚中の自己タンパク質抗原に結合し、ネオ抗原を生成するハプテン を介して 誘導される。CHSは、循環抗原特異的CHSエフェクターT細胞の局所的な血管外動員によって媒介され、これは、チャレンジ組織において腫脹をもたらし、二次皮膚を同じハプテンに曝露してから24時間後にピークに達する6。組織の腫脹は、主に、白血球および白血球依存性フィブリン?...

開示事項

著者らには開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、subvention SUBZによって支持された。ヴロツワフの医科大学のA020.22.060, ポーランド, 科学高等教育省からの助成金によって N N401 545940 MSとIP2012 0443 72 MMSに.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
70% ethanolMerck KGaA, Darmstadt, Germany65350-Mfor surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropyleneGreiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria655101for MPO and Evans blue measurement - plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%)Merck KGaA, Darmstadt, Germany179124
Aluminum foilMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ185140
Analytical balanceSartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, GermanyPRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processorMediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, IndiaMTP-E-212automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum)Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USABD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determinationMerck KGaA, Darmstadt, GermanyBCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA553441
BSA (bovine serum albumine)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyA9418protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μmBIOLOGIX, China15-1070suitable for 50 mL tubes
CoverslipVWR, Radnor, Pennsylvania, United States631-158324 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA14190144no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histologyMerck KGaA, Darmstadt, Germany6522mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers - straightAnimalab, Poznan, Poland11251-10FSTsurgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers - bentAnimalab, Poznan, Poland11272-50FSTsurgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholicMerck KGaA, Darmstadt, GermanyHT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppenforf, Germany3,01,20,086polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mLEppenforf, Germany3,01,20,094polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol)Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.07017
Ethanol 96%Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.59010
Evans blueMerck KGaA, Darmstadt, GermanyE2129
FBS (fetal bovine serum)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAA3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10%Merck KGaA, Darmstadt, GermanyHT501128
Formamide 99.5% (GC)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyF7503
Freezer -20 °CBosch, GermanyGSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °CBosch, GermanyKGV36V10mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost PlusVWR, Radnor, Pennsylvania, United States631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad PrismGraphPad Software Inc.v. 9.4.0
Grey soapPollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., PolandBialy jelen soap bargrey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M)Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.60313
Harris hematoxylin solutionMerck KGaA, Darmstadt, GermanyHHS16
HemocytometerVWR, Avantor, U.S.A612-5719manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromideMerck KGaA, Darmstadt, GermanyH5882
HomogenizerQIAGEN Hilden, GermanyTissue Lyser LT, SN 23.1001/05234homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin)Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USASA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyH1009
Incubator Heracell 150iThermo Electron LED Gmbh, Germany4107106837 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injectionBiowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Polandcat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basisMerck KGaA, Darmstadt, Germany1.05108
Laboratory CentrifugeHeraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, GermanyB00013899speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory CentrifugeHeraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany75002425speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2)VWR, Radnor, Pennsylvania, United States111-0917for working with ortho-dianisine dihydrochloride
MiceBreeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, PolandCBA/J, C57BL/6
MicrometerMitutoyo, Tokyo, Japan193-111digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test)Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria655061with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectivesLeica Microsystems CMS GmbH, GermanyDM1000, 294011-082007histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyM6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyS9390
Olive-oilMerck KGaA, Darmstadt, Germany75343pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA SetBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA555138
Ortho-dianisine dihydrochlorideMerck KGaA, Darmstadt, GermanyD3252
Paraffin waxMerck KGaA, Darmstadt, Germany76242beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA20012027pH 7.2, mammalian cell culture
ph meterElmetron, PolandCP-401
Pipettes, variable volume with tipsMerck KGaA, Darmstadt, GermanyEP3123000900-1EA3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor bladeVWR, Radnor, Pennsylvania, United StatesPERS94-0462scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtomeMRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UKHIS-202A
Scissors - straight, sharp / sharpAnimalab, Poznan, Poland14060-10FSTSurgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top)Merck KGaA, Darmstadt, Germany27056black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
SpectrophotometerBioTek Instruments, U.S.A201446universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 - 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 - 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rackMerck KGaA, Darmstadt, GermanyS6141e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mmIntegra LifeSciences, Princeton, NJ, USA33-36
Surgical scissorsAnimalab, Poznan, Poland52138-46surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettesMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ672122tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent SetBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene)Tokyo Chemical Industry CO., LTD, JapanC0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl)Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USAT-5050
T-PER (tissue protein extration reagent)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA78510
Tubes 15 mL sterileMerck KGaA, Darmstadt, GermanyCLS430055 (Corning)polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterileMerck KGaA, Darmstadt, GermanyCLS430290 (Corning)polypropylene, conical bottom
Tween 20Merck KGaA, Darmstadt, GermanyP1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Germany27173for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bathAJL Electronic, PolandLW102
Wax (paraffin) dispenserVWR, Radnor, Pennsylvania, United States114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injectionVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Polandcat.# not avaliable
Xylene (histological grade)Merck KGaA, Darmstadt, Germany534056

参考文献

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