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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Kontaktüberempfindlichkeit (CHS) ist ein murines experimentelles Modell der allergischen Kontaktdermatitis (ACD). CHS basiert auf der Sensibilisierung mit reaktivem Hapten durch Lackieren der rasierten Haut von Brust und Bauch, mit einer anschließenden Ohrhautherausforderung mit einem verdünnten Hapten, was eine Schwellungsreaktion verursacht, die auf verschiedene Arten beurteilt wird.

Zusammenfassung

Kontaktüberempfindlichkeit (CHS) ist ein experimentelles Modell der allergischen Kontaktdermatitis (ACD), das an Mäusen untersucht werden kann. Diese Studie zielt darauf ab, eine objektive Labormethode vorzustellen, die helfen kann, die CHS-Reaktion in Mäusen zu untersuchen, die durch verschiedene Tests gemessen und quantifiziert werden kann. Um CHS zu induzieren, wurden Mäuse am Tag "0" an einer zuvor rasierten Stelle durch Bauchhautmalerei mit dem hapten 2,4,6-Trinitrochlorbenzol (TNCB) in einem Aceton-Ethanol-Gemisch sensibilisiert, während Negativkontrollmäuse mit Vehikel-Alone-Aceton-Ethanol-Gemisch scheinsensibilisiert wurden. Am Tag "4" wurde die Grundohrendicke mit einem Mikrometer vor der Auslösung von CHS (Challenge) gemessen, indem beide Ohren mit verdünntem TNCB sowohl in der Test- als auch in der Kontrollgruppe lackiert wurden. Nach 24 h wurde die Ohrschwellung mit einem Mikrometer gemessen. CHS ist ein Beispiel für eine T-Zell-vermittelte Immunantwort, die Schwellungen in entzündetem Gewebe verursacht und 24 Stunden nach der Hautherausforderung mit der gleichen Hapten ihren Höhepunkt erreicht. Eine Zunahme des Ohrödems korrelierte mit erhöhtem Ohrgewicht, Myeloperoxidase (MPO) -Aktivität, entzündungsfördernder Zytokinkonzentration in den Ohrextrakten, erhöhter Verdickung der ödematösen Dermis in der histologischen Untersuchung und Ohrvaskulärpermeabilität. Es gab auch einen Anstieg der Konzentration von TNP-spezifischen IgG1-Antikörpern in den Seren der Testgruppe im Vergleich zu den Kontrollmäusen. Darüber hinaus kann CHS erfolgreich mit den CHS-Effektorzellen übertragen werden, die von Spendern erhalten wurden, die zuvor mit TNCB sensibilisiert wurden. Die CHS-Effektorzellen wurden intravenös in naive Empfängermäuse verabreicht, die anschließend mit dem gleichen verdünnten Hapten herausgefordert wurden. Die Ohrschwellung wurde 24 Stunden später mit einem Mikrometer gemessen.

Einleitung

Allergische Kontaktdermatitis (ACD) ist eine häufige entzündliche Hauterkrankung in Industrieländern, die durch eine Typ-IV-Überempfindlichkeitsreaktion verursacht wird, die sich aus der Exposition gegenüber niedermolekularen Chemikalien, den sogenannten Hapenten, ergibt. Zu den Substanzen, die beim Menschen eine Kontaktsensibilisierung verursachen, gehören Schwermetallionen (Chrom, Nickel, Eisen, Kobalt), Terpentin, Duftstoffe, Farbstoffe und Konservierungsstoffe, die in Kosmetika enthalten sind (z. B. p-Phenylendiamin), einige Medikamente (z. B. Neomycin, Benzocain), β-Lactam-Antibiotika (dh Penicillin), von Pflanzen hergestellte Chemikalien (Penadecacatechol, eine Substanz, die in Giftefeu vorhanden ist) sowie Hydrochinon, das in der Fotoindustrie verwendet wird1,2 . Die ätiologischen Wirkstoffe der ACD sind sehr hoch, da allein in der Industrie über 100.000 Chemikalien verwendet werden und jedes Jahr 2.000 neue synthetisiert werden. Bis heute wurden mehr als 3.700 Moleküle identifiziert, bei denen es sich um Kontakthapten/Allergene handelnkönnte 3. Die Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion (CHS) ist ein experimentelles Modell von ACD, das an Mäusen, Meerschweinchen und Ratten untersucht werden kann und durch die topische Hautanwendung von reaktiven chemischen Hapten, die in organischen Lösungsmitteln gelöst sind, induziert werdenkann 4,5,6. Diese Studie zielt darauf ab, eine objektive Labormethode zu beschreiben, die helfen kann, die CHS-Reaktion in Mäusen zu untersuchen, die durch verschiedene Tests gemessen und quantifiziert werden kann.

Das CHS besteht aus Sensibilisierungs- (Induktions-) und Effektor- (Challenge) Phasen. In Tiermodellen binden Hapten zunächst kovalent an Proteine im Körper, um Neoantigene zu bilden. Während der Sensibilisierungsphase fördern aktivierte Keratinozyten die Migration und Reifung von dendritischen Hautzellen (sDCs), indem sie proinflammatorische Zytokine-Tumornekrosefaktor α (TNF-α) und Interleukin 1β (IL-1β)7 produzieren. Epidermale Langerhans-Zellen (LCs) präsentieren Antigene während der CHS-Induktions- und Effektorphase8. LCs, die während der Sensibilisierung Hapten ausgesetzt sind, fördern die Induktion von Regulations- und Effektorzellen9. Zunehmende Beweise aus mehreren Studien deuten darauf hin, dass CHS-Reaktionen entweder durch CD4 + MHC-Klasse II-eingeschränkte Th1-Zellen vermittelt werden können, die lokal Interferon-γ (IFN-γ) freisetzen, um ein charakteristisches entzündliches Infiltrat, CD8 + MHC-Klasse I-eingeschränkte Tc1-Lymphozyten zu verwenden, die auch IFN-γ freisetzen können, aber hauptsächlich zytotoxische Schäden an Keratinozyten vermitteln, und jetzt auch Interleukin 17 (IL-17) produzierendeTh17-Zellen 10, 11 .

Es wurden mehrere verschiedene CHS-Modelle mit verschiedenen Spezies 1 2,13,14 und Hatagen entwickelt (ein detaillierter Vergleich der verschiedenen Halate, Lösungsmittel und des Anwendungszeitpunkts ist in Tabelle 1 zusammengefasst). Die Maus, eine häufig verwendete Laborart, bietet einige Vorteile bei der Untersuchung von CHS. Es gibt mehr Stämme, Knockouts (KO) und transgene Tiere unter Mäusen im Vergleich zu anderen Arten, was sie zu einem sehr attraktiven Tier15 macht. Darüber hinaus erfordert das CHS-Modell viele Tiere, und Mäuse sind hier sparsamer. Tiermodelle ahmen ACD nicht in allen Aspekten nach; Insbesondere zeigen sie Krustenbildung und Desquamation, was für Menschen nicht üblich ist16,17. Die Merkmale chronischer Erkrankungen sind schwierig zu reproduzieren, vor allem, weil das beschriebene Modell die Anwendung des Hapten über einen längeren Zeitraum nicht annimmt. Es wurde hier jedoch bestätigt, dass viele der wesentlichen Aspekte von ACD reproduziert werden. Es wurde auch gezeigt, dass diese Merkmale, wie beim Menschen, mit lokalen allergischen Reaktionen verbunden sind. Die Wahl des Hapten, seines Lösungsmittels und seiner Anwendung, die in diesem Protokoll beschrieben sind, wurden durch die Tatsache bestimmt, dass die Ergebnisse durch zahlreiche In-vitro-Tests bestätigt wurden und dass es viele Jahre lang im Labor getestet und modifiziert wurde, bis die aktuelle Version etabliert wurde. Murine Modelle ermöglichen die Analyse der Zelluntergruppen oder Zytokine, die an der Entwicklung von ACD beteiligt sind und für die präklinische Bewertung neuer Behandlungen unerlässlich sind.

Protokoll

Alle in diesem Artikel vorgestellten Experimente wurden nach den Richtlinien des 1. Lokalen Ethikkomitees für Tierversuche in Krakau durchgeführt. Alle beschriebenen Verfahren wurden gemäß den lokalen Empfehlungen durchgeführt, insbesondere in Bezug auf die Verwendung von Ketamin / Xylazin als Anästhetikum, die Verwendung beider Seiten der Ohren zum Auftragen der Substanz / des Hapten, das Abschneiden des Ohrs und das Sammeln von Blut durch Augapfelentfernung. BALB/c (Haplotyp H-2d), CBA/J (H-2 k) und C57BL/6 (H-2b) männliche und weibliche Mäuse, 6-12 Wochen alt, wurden für die vorliegende Studie verwendet (siehe Materialtabelle). Für die statistische Signifikanz ist es am besten, wenn jede Gruppe von Mäusen aus 10-12 Tieren besteht.

1. Tierpräparation

  1. Reinigen Sie den Operationstisch vor und nach allen Verfahren mit einer 70% igen Ethanollösung. Wenn Sie Mäuse verwenden, die sterile Bedingungen erfordern, führen Sie alle Operationen in einer Biosicherheitskabine durch.

2. Markieren von Mäusen zur Identifizierung

  1. Beschriften Sie die Mäuse, indem Sie die Haut mit einer Rasierklinge rasieren: #0 - unmarkiert, #2 - auf der rechten Vorderpfote, #3 - auf der rechten Seite, #4 - auf der rechten Hinterpfote, #5 - an der Basis des Schwanzes, #6 - auf der linken Hinterpfote, #7 - auf der linken Seite, #8 - auf der linken Vorderpfote.
    HINWEIS: Aufgrund der induzierten Reaktion können Mäuse nicht klassisch durch Ohrstanzen oder -markieren markiert werden. Die Mäuse wurden während der Beschriftung nicht betäubt.

3. Induktion von CHS

HINWEIS: Dieses Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt.

  1. Führen Sie die Sensibilisierung (Induktion) gemäß den folgenden Schritten durch.
    1. Rasieren Sie am Tag "0" Mäuse auf Brust und Bauch (quadratisch 2 cm x 2 cm), indem Sie graue Seife mit Wasser auftragen und mit einer Rasierklinge rasieren.
      HINWEIS: Warten Sie vor dem Auftragen von Hapten 6 h, damit die Haut nicht gereizt wird.
    2. 5% Hapten: 2,4,6-Trinitrochlorbenzol (TNCB, siehe Materialtabelle) in einem Aceton-Ethanol-Gemisch (Verhältnis 1:3) oder Vehikel allein (Aceton-Ethanol) herstellen. Bereiten Sie Lösungen kurz vor dem Gebrauch in einer Durchstechflasche aus Glas vor und schützen Sie sie vor Licht, indem Sie die Durchstechflasche mit Aluminiumfolie abdecken.
    3. Sensibilisieren Sie die Mäuse am selben Tag, indem Sie 150 μL 5% Hapten auf die zuvor rasierte Stelle auftragen. Wenden Sie in der Gruppe der Kontrollmäuse das Vehikel allein an, um die unspezifische Entzündungsreaktion zu beurteilen. Bevor Sie das Tier wieder in den Käfig stecken, warten Sie 30 Sekunden und lassen Sie das Hapten trocknen.
      ACHTUNG: Verwenden Sie Handschuhe; TNCB verursacht bei den meisten Menschen eine schwere allergische Reaktion.
  2. Führen Sie eine Auslöse- (Herausforderung) und Ohrschwellungsmessung durch.
    1. Am Tag "4" bereiten Sie 0,4% Hapten zu: TNCB in einem Aceton-Ethanol-Gemisch (Verhältnis 1: 1). Bereiten Sie die Lösung kurz vor der Verwendung in einer Durchstechflasche aus Glas vor und schützen Sie sie vor Licht, indem Sie die Durchstechflasche mit Aluminiumfolie abdecken.
    2. Anästhesieren Sie die Mäuse mit einer intraperitonealen (i.p.) Injektion einer Mischung aus Ketamin (90-120 mg/kg) und Xylazin (5-10 mg/kg) (siehe Materialtabelle) für die Tiefenanästhesie. Stellen Sie sicher, dass die Maus mindestens 5 Minuten lang vollständig betäubt ist.
    3. Messen Sie die Ohrdicke (0 h Messung, Basislinie) mit einem Mikrometer (siehe Tabelle der Materialien) von einem Beobachter, der die experimentellen Gruppen nicht kennt.
    4. Tragen Sie 10 μL 0,4% Hapten auf beiden Seiten der Ohren in beiden Gruppen auf (Test und Kontrolle) auf. Bevor Sie das Tier wieder in den Käfig stecken, warten Sie 30 Sekunden und lassen Sie das Hapten trocknen.
    5. Wiederholen Sie am Tag "5", 24 h nach der hapten Anwendung, die Schritte 3.2.2-3.2.3 für die 24-Stunden-Messung.
    6. Bewerten Sie die CHS-Antwort, indem Sie die Differenz der Ohrmuscheldicke vor und nach der Herausforderung mit dem Hapten berechnen: 24 h Ohrdicke (μm) - 0 h Ohrdicke (μm). Zählen Sie jedes Ohr als separate Messung. Als nächstes drücken Sie die Ohrschwellung in Mikrometern (μm) ± Standardfehler des Mittelwerts (REM) aus (Tabelle 2, Abbildung 3).

4. Ohrbiopsien

  1. Schneiden Sie direkt nach der 24-Stunden-Messung der Ohrdicke (wenn die Maus noch unter Tiefnarkose steht) die Ohren so nah wie möglich am Schädel mit einer Schere ab. Sammeln Sie die Biopsien von der distalen Seite der Ohren, indem Sie einen Stempel mit einem Durchmesser von 6 mm mit einem Biopsiestempel herstellen (siehe Materialtabelle).
    1. Messen Sie das Ohrgewicht (Schritt 4.2) und führen Sie zusätzlich einen der folgenden Tests an derselben Ohrbiopsie durch: Myeloperoxidase (MPO)-Assay (Schritt 4.3) oder In-vitro-Messung der Zytokinkonzentration in den Ohrenextrakten (z. B. IFN-γ, IL-17A, TNF-α [Schritt 4.4]).
      HINWEIS: Schneiden Sie die Ohren vor der Blutentnahme ab. Nach diesem Eingriff müssen die Mäuse eingeschläfert werden (z.B. durch Zervixdislokation).
  2. Messen Sie das Gewicht jeder Ohrbiopsie auf der Analysenwaage und drücken Sie es in Milligramm (mg) aus (Abbildung 4).
  3. Führen Sie einen MPO-Assay durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Homogenisierungspuffer werden hergestellt, indem 0,5% Hexadecyltrimethylammoniumbromid in 50 mmol Phosphoratpuffer KH 2 PO 4 / Na2HPO4 gelöst und der pH-Wert auf 6,0 eingestellt wird (Verwendung bei Raumtemperatur, RT).
    2. Homogenisieren Sie die Biopsien in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 μL vorbereitetem Puffer für 10 min mit einem Homogenisator mit Edelstahlperlen mit einem Durchmesser von 5 mm (fügen Sie zwei Perlen / Durchstechflaschen hinzu) (siehe Materialtabelle). Als nächstes kühlen Sie die Probe für 15 min bei 4 °C ab und homogenisieren sie für weitere 10 min.
      HINWEIS: Mikrozentrifugenröhrchen haben einen runden Boden, so dass sich die Perlen leicht bewegen können.
    3. Die Homogenate bei −20 °C 30 min einfrieren. Tauwetter und Wirbel (stellen Sie sicher, dass die Proben aufgetaut sind). Wiederholen Sie diesen Vorgang 3x.
    4. Zentrifugieren Sie die Homogenate bei 3.000 x g für 30 min bei 4 °C. Die Überstände mit einer Pipette ernten. Drücken Sie die MPO-Aktivität in Einheiten (U) pro 1 mg Protein aus.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Proben sind 3 Monate lang bei −20 °C stabil.
    5. Um die MPO-Aktivität zu messen, führen Sie eine enzymatische Reaktion durch, indem Sie 20 μL Überstand und 200 μL MPO-Substrat (0,167 mg/ml Ortho-Dianisin-Dihydrochlorid in 50 mmol KH 2 PO4 / Na 2 HPO 4-Puffer mit 5 x 10-4% H 202) mischen und in 96-Well-Flachbodenplatten geben. Inkubieren Sie die Platten für 20 min bei RT.
    6. Bereiten Sie die Standardkurve vor, indem Sie 20 μL des MPO-Standards bei Konzentrationen von 0,008 U bis 0,5 U in 200 μL des MPO-Substrats verwenden. Bereiten Sie die leere Probe allein mit dem MPO-Substrat vor.
      ACHTUNG: Verwenden Sie eine Maske, während Sie mit Ortho-Dianisin-Dihydrochlorid arbeiten.
      HINWEIS: Die Platten müssen aus Polypropylen bestehen, das eine geringere Bindungskapazität hat, so dass Proteine oder DNA nicht binden.
    7. Messen Sie die optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von λ = 460 nm. Die enzymatische Reaktion ist 10 min stabil. Lesen Sie die MPO-Aktivität in getesteten Stichproben aus der Standardkurve.
    8. Um die Proteinkonzentration zu messen, verwenden Sie 20 μL des Überstandes, führen Sie einen Test mit einem Bicinchoninsäure-Kit zur Proteinbestimmung durch (siehe Materialtabelle) und messen Sie die OD bei λ = 562 nm (Abbildung 5).
  4. Führen Sie eine In-vitro-Messung von Zytokinen im Ohrenextrakt durch.
    1. Homogenisieren Sie die Ohrbiopsien bei RT in 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 μL Gewebeproteinextraktionsreagenz (T-PER) für 10 min mit einem Homogenisator mit Edelstahlperlen mit 5 mm Durchmesser (fügen Sie zwei Perlen / Durchstechflasche hinzu). Als nächstes kühlen Sie die Probe für 15 min bei 4 °C ab und homogenisieren sie für weitere 10 min.
      HINWEIS: Mikrozentrifugenröhrchen haben einen runden Boden, so dass sich die Perlen leicht bewegen können.
    2. Zentrifugieren Sie die Homogenate bei 3.000 x g für 30 min bei 4 °C.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Proben sind 6 Monate lang bei −80 °C stabil.
    3. Bewerten Sie die Zytokinwerte mit einem handelsüblichen ELISA-Set (z. B. IFN-γ) (siehe Materialverzeichnis) gemäß den Anweisungen des Herstellers (Abbildung 6).

5. Histologie des Ohrgewebes

  1. Direkt nach der 24-Stunden-Messung der Ohrdicke, wenn die Maus noch tief betäubt ist, schneiden Sie die Ohren mit der Schere so nah wie möglich am Schädel ab (Schritt 4.1).
    HINWEIS: Nach diesem Eingriff müssen die Mäuse eingeschläfert werden (z.B. durch Zervixdislokation).
  2. Führen Sie eine Paraffineinbettung der Gewebeblöcke durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Legen Sie das Ohr direkt nach der Entfernung für 24 Stunden in ~ 10 ml 10% Formalin.
    2. Legen Sie die Ohren in eine Gewebeverarbeitungskassette. Legen Sie die Kassetten in einen automatisierten Prozessor (siehe Tabelle der Materialien) für Dehydratisierungszyklen (Alkohol 70%, 90%, 100%, jeweils 30 min bei RT), Reinigungszyklen (Xylol 3x, jeweils 30 min bei RT) und Wachsinfiltrationszyklen (Paraffin 3x, jeweils 30 min bei 56 ° C).
    3. Entfernen Sie die Kassetten aus dem automatisierten Prozessor und halten Sie die Warmhalteplatte fest, bis dies erforderlich ist. Füllen Sie die Wachsform mit warmem Wachs (aus dem Spender).
    4. Entfernen Sie die Abschnitte von der Kassette mit der erwärmten Pinzette und legen Sie sie in die Form; Als nächstes legen Sie den Kassettenboden auf die Oberseite der Form und füllen Sie ihn dann mit mehr Wachs. Legen Sie es in gekühltem Wasser auf eine kalte Platte für 30 Minuten, so dass das Paraffin erstarrt und einen Block bildet, der die Probe enthält.
    5. Verwenden Sie ein rotierendes Mikrotom (siehe Materialtabelle), um Abschnitte mit einer Dicke von ~ 5 μm zu schneiden. Schweben Sie die Abschnitte in einem warmen Bad, um sie abzuflachen. Nehmen Sie die Abschnitte auf einem Glasmikroskopobjektträger auf. Lassen Sie sie bei RT trocknen, um sicherzustellen, dass die Abschnitte an der Folie haften.
      HINWEIS: Verwenden Sie Objektträger, die das Auftragen von Klebematerialien oder Proteinbeschichtungen überflüssig machen, um den Verlust von Gewebeabschnitten während der Färbung zu verhindern.
  3. Führen Sie Hämatoxylin und Eosin (H & E) -Färbung durch.
    1. Bereiten Sie 17 Färbegerichte mit den folgenden zu: Xylol (vier Schüsseln), 100% Ethanol (absoluter Alkohol) (vier Schalen), 90% Ethanol, 80% Ethanol, 70% Ethanol, 50% Ethanol, PBS (drei Gerichte), Hämatoxylinlösung, Eosinlösung. Übertragen Sie die Folien gemäß den folgenden Schritten von einer Schüssel zur nächsten und führen Sie alle bei RT aus.
      HINWEIS: Der Vorgang in jeder Schale kann ungefähr 10x wiederholt werden (z. B. wenn eine 20-Objektträger-Schale verwendet wird, können 200 Flecken gemacht werden, ohne die Flüssigkeiten zu wechseln).
    2. Deparaffinisieren Sie die Abschnitte durch Inkubation bei 65 °C für 30 min im Inkubator. Tauchen Sie die Dias 30 min in Xylol ein. Wiederholen Sie 1x in neuem Xylol für 30 min.
    3. Tauchen Sie die Objektträger 5 min in 100% Ethanol ein. Wiederholen Sie 1x in neuem 100% Ethanol für 5 min. Tauchen Sie die Objektträger in die Ethanolreihe, 90%, 80%, 70% und 50%, für 2 Minuten in jeder Verdünnung.
    4. Tauchen Sie die Objektträger 5 min in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ein. Wischen Sie überschüssige Flüssigkeit um das Gewebe und die Rückseite von Objektträgern ab.
    5. Färben Sie die Abschnitte in Hämatoxylinlösung (siehe Materialtabelle) für 7-8 min. Waschen Sie fließendes Wasser für 30 s von der Rückseite ein, um die Abschnitte nicht zu beschädigen. Wiederholen Sie Schritt 5.3.4.
    6. Färben Sie die Abschnitte mit Eosinlösung (siehe Materialverzeichnis) für 30 s. Waschen Sie wie in Schritt 5.3.5 erwähnt und wiederholen Sie dann Schritt 5.3.4.
    7. Tauchen Sie die Objektträger für 2 min in 100 % Ethanol (absoluter Alkohol) ein. Wiederholen Sie 1x in neuem 100% Ethanol für 2 min.
    8. Tauchen Sie die Dias für 5 min in Xylol ein. Wiederholen Sie 1x in neuem Xylol für 5 min.
    9. Lassen Sie die Abschnitte bei RT 15 min an der Luft trocknen. Fügen Sie einen Tropfen Montagemedium (siehe Materialtabelle) auf ein Deckglas und legen Sie es dann an den oberen Rand des Abschnitts.
  4. Untersuchen Sie den Schnitt unter einem Lichtmikroskop unter einer Vergrößerung von 20x oder 40x und nehmen Sie Bilder auf (Abbildung 7).

6. Gefäßpermeabilitätstest

HINWEIS: Alternativ zur Messung der Ohrdicke kann ein Gefäßpermeabilitätstest durchgeführt werden.

  1. Sensibilisieren Sie die Mäuse am Tag "0" (Schritte 3.1.1-3.1.3) und betäuben Sie dann am Tag "4" die Mäuse (Schritt 3.2.2) und tragen Sie Hapten direkt auf die Ohren auf (Schritt 3.2.4), wobei die 0-h-Ohrmessung weggelassen wird.
  2. Um 23 Uhr nach der Herausforderung die Mäuse betäuben (Schritt 3.2.2).
  3. Injizieren Sie intravenös (i.v.) 8,3 μL/g Körpergewicht von 1% Evans blauem Farbstoff (siehe Materialtabelle) in Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS).
  4. Betäuben Sie die Mäuse erneut-Tiefenanästhesie (Schritt 3.2.2)-1 h nach der blauen Injektion von Evans.
  5. Ohrbiopsien sammeln (Schritt 4.1).
    HINWEIS: Nach diesem Eingriff müssen die Mäuse eingeschläfert werden (z.B. durch Zervixdislokation).
  6. Extrahieren Sie den Farbstoff aus dem Gewebe, legen Sie Ohrstempel in die Röhrchen mit 1 ml Formamid und inkubieren Sie bei 37 ° C in der Atmosphäre von 5% CO2 für 18 h.
  7. Zentrifugieren Sie die Biopsien bei 3.000 x g für 3 min bei RT. Sammeln Sie die Überstände mit einer Pipette.
  8. Messen Sie die OD bei einer Wellenlänge von λ = 565 nm in 96-Well-Flat-Bottom-Platten gegen einen Rohling, der Formamid enthält. Die Farbe ist 24 h stabil. Lesen Sie die Konzentration der Testproben aus der Standardkurve ab (verwenden Sie die Konzentrationen von Evans blue im Bereich von 0,2-30 μg Farbstoff/ml Formamid) (Abbildung 8).
    HINWEIS: Die Platten müssen aus Polypropylen bestehen, das eine geringere Bindungskapazität hat, so dass Proteine oder DNA nicht binden.

7. Serumentnahme und Anti-TNP-Immunglobulin (IgG1)-Antikörpermessung

  1. Nach dem Sammeln von Ohrbiopsien (Schritt 4.1), wenn die Maus noch unter tiefer Betäubung steht, entfernen Sie den Augapfel mit einer Pinzette, üben Sie sanften Druck auf die Maus aus und sammeln Sie Blut aus dem retro-orbitalen Sinus in die Röhre (Durchstechflasche mit Gel zur Gewinnung von Serum, siehe Materialtabelle). Eine alternative Methode zum Sammeln von Blut könnte darin bestehen, das Herz mit einer Spritze zu punktieren und das Blut zu sammeln.
    HINWEIS: Das Blut muss nach dem Entfernen der Ohren gesammelt werden. Die gleiche Blutungsmethode muss aufgrund möglicher Unterschiede in den Blutparametern18 über eine gesamte Studie hinweg angewendet werden. Nach diesem Verfahren müssen Mäuse eingeschläfert werden (z. B. durch Zervixdislokation).
  2. Kehren Sie ein Minimum von 6x um, warten Sie 30 Minuten, bis das Blut gerinnt, und zentrifugieren Sie dann bei 1.300-2.000 x g für 10 Minuten bei RT.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Probe ist 6 Monate lang bei −20 °C stabil.
  3. Beschichten Sie eine 96-Well-Flachbodenplatte mit 50 μL Rinderserumalbumin, konjugiert mit 2,4,6-Trinitrophenyl (TNP-BSA), gelöst in DPBS bei einer Konzertierung von 10 μg/ml. Als nächstes beschichten Sie die zweite Platte mit Rinderserumalbumin (BSA), das allein in DPBS (Hintergrund) in einer Konzentration von 10 μg/ml gelöst ist. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    HINWEIS: Mausserum enthält Antikörper (Abs) gegen BSA, daher müssen die Proben auf beiden Platten getestet werden, und als nächstes muss eine Berechnung durchgeführt werden (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. Waschen Sie die Platten mit 300 μL DPBS, die 0,05% Tween 20 enthalten. 3x wiederholen.
  5. Assay-Verdünnungsmittel (AD) vorbereiten: DPBS mit 1% BSA. Blockieren Sie die Bohrlöcher mit AD für 1 h bei RT. Waschen Sie erneut (Schritt 7.4).
  6. Bereiten Sie einen internen Standard (iSTD) vor: Sensibilisieren Sie die Mäuse mit TNCB (Schritte 3.1.1-3.1.3) und sammeln und befragen Sie 10 Tage nach der Sensibilisierung das Serum von allen Spendern (Schritt 7.1 und Schritt 7.2).
  7. Der Platte sind 50 μL abgestufte iSTD-Konzentrationen zugesetzt, die mit AD verdünnt sind, um die Standardkurve zu bilden (beschrieben in Tabelle 3). Auf die Platte 50 μL Serumproben geben. Testen Sie jede Probe und Standardkurve auf beiden Platten (TNP-BSA- und BSA-beschichtet). Inkubieren Sie für 2 Stunden bei RT. Waschen Sie die Platten (Schritt 7.4).
  8. 50 μL biotinylierter monoklonaler Anti-Maus-IgG1-Antikörper (mAb, siehe Materialtabelle) zugeben, der 1:250 mit AD verdünnt wurde, und 1 h bei RT inkubieren. Erneut waschen (Schritt 7.4).
  9. Fügen Sie 50 μL Meerrettichperoxidase-Streptavidin (HRD-Streptavidin, siehe Materialtabelle) hinzu, verdünnt 1:2000 mit AD, und inkubieren Sie für 30 Minuten bei RT im Dunkeln. Waschen Sie die Platte (Schritt 7.4).
  10. Fügen Sie 50 μL TMB-Substrat hinzu (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie für 30 Minuten bei RT im Dunkeln.
  11. Stoppen Sie die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 25 μL von 1 MH2SO4; Die Reaktion ist 30 min stabil.
  12. Messen Sie die OD bei einer Wellenlänge von λ = 450 nm und einem Hintergrund von 570 nm (der Hintergrund muss von jeder 450-nm-Messung subtrahiert werden). Subtrahieren Sie bei der Präsentation der Ergebnisse die BSA-Messungen von der TNP-BSA für Proben und der Standardkurve. Berechnen Sie dann die Einheit (U) der Antikörper gemäß der Standardkurve (Abbildung 9).

8. Adoptiver Transfer der CHS-Effektorzellen

HINWEIS: Dieses Verfahren ist in Abbildung 2 dargestellt.

  1. Spender (im Verhältnis eines Spenders:1 Empfänger): Sensibilisieren Sie Mäuse mit TNCB am Tag "0" (Schritte 3.1.1-3.1.3).
  2. Betäuben Sie am Tag "4" die Tiefenanästhesie der Mäuse (Schritt 3.2.2).
  3. Isolieren Sie mit einer Pinzette die axillären und inguinalen Lymphknoten (ALNs) und Milz (SPLs). Fassen Sie die ALNs in einer Durchstechflasche und die SPLs in einer anderen zusammen.
    HINWEIS: In jeder Achselhöhle befindet sich ein axillärer Lymphknoten hinter dem Brustmuskel. Ein Leistenlymphknoten in der Hüftregion befindet sich neben drei Blutgefäßen. Die Milz befindet sich auf der linken Seite des Körpers hinter Darm und Magen19. Arbeiten Sie mit sterilen Werkzeugen in einer Biosicherheitskabine, um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten. Nach diesem Eingriff müssen die Mäuse eingeschläfert werden (z.B. durch Zervixdislokation).
  4. Maische Gewebe zwischen den mattierten Enden zweier Objektträger. Führen Sie die Zellsuspension durch ein Zellsieb mit einer Porengröße von 70 μm (siehe Materialtabelle).
  5. Waschen Sie die Zellen mit DPBS, ergänzt mit 1% fetalem Rinderserum (FBS). Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei 4 °C. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das verbleibende Zellpellet in 1-5,0 ml DPBS.
  6. Zählen Sie die lebenden Zellen mit einem Hämozytometer20 mit Trypanblau und mischen Sie 10 μL der Zellsuspension mit 90-990 μL (abhängig von der Zellzahl) Trypanblau. Berücksichtigen Sie die Verdünnung bei der Berechnung der Zellzahl (10x-100x).
  7. Bereiten Sie eine Mischung aus ALNs und SPLs (Verhältnis 1:1) vor: 8,0 x 106 bis zu 7,0 x 107/Maus in 200 μL DPBS.
  8. Empfänger (naive syngene Mäuse): Betäubung naiver Empfängermäuse (Schritt 3.2.2) und Injektion i.v. mit einer vorbereiteten Mischung der CHS-Effektorzellen (Schritt 8.7). Injizieren Sie in der Kontrollgruppe der Mäuse keine Zellen.
  9. Messen Sie die Ohrdicke vor (0 h) und nach (24 h) der Herausforderung (Schritte 3.2.1-3.2.6) (Abbildung 10).
  10. Zusätzlich werden Tests an isolierten CHS-Effektorzellen durchgeführt (z. B. Zellphänotypisierung oder die Messung der produzierten Zytokine durch die CHS-Effektorzellen durch Durchflusszytometrie). Es können auch Zellkulturen etabliert werden, und die Fähigkeit der CHS-Effektorzellen, sich in Gegenwart des Antigens oder der Menge an sezernierten Zytokinen in den Kulturüberständen zu vermehren, kann beurteilt werden21,22 (Daten nicht dargestellt).
    HINWEIS: Die Durchführung zusätzlicher Tests erfordert entsprechend mehr Zellspender.

Ergebnisse

Für die CHS-Induktion wurden die Tiere durch Hautmalerei (abdominal) mit 150 μL von 5% TNCB sensibilisiert oder mit dem Vehikel allein scheinsensibilisiert. Am Tag "4" wurden die Ohrschwellungsreaktionen beider Ohren durch Kontaktmalerei (Challenge) mit 10 μL von 0,4% TNCB in beiden Mäusen induziert, die zuvor mit TNCB (Testgruppe) und den Kontrollgruppenmäusen (scheinsensibilisiert) sensibilisiert waren. Die vorgestellten Daten zeigen, dass die mit TNCB sensibilisierten und 4 Tage später herausgeforderten...

Diskussion

CHS wird über Hapten induziert, die an Selbstproteinantigene in der Haut binden und Neoantigene bilden. CHS wird durch lokale extravaskuläre Rekrutierung von zirkulierenden antigenspezifischen CHS-Effektor-T-Zellen vermittelt, was zu einer Schwellung im herausgeforderten Gewebe führt, die 24 Stunden nach der Exposition der Sekundärhaut gegenüber dem gleichen Hapten6 ihren Höhepunkt erreicht. Die Schwellung des Gewebes wird hauptsächlich durch die Infiltration von Leukozyten und die...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch die Subvention SUBZ unterstützt. A020.22.060 der Medizinischen Universität in Breslau, Polen, und durch Zuschüsse des Ministeriums für Wissenschaft und Hochschulbildung N N401 545940 an MS und IP2012 0443 72 an MMS.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
70% ethanolMerck KGaA, Darmstadt, Germany65350-Mfor surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropyleneGreiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria655101for MPO and Evans blue measurement - plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%)Merck KGaA, Darmstadt, Germany179124
Aluminum foilMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ185140
Analytical balanceSartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, GermanyPRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processorMediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, IndiaMTP-E-212automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum)Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USABD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determinationMerck KGaA, Darmstadt, GermanyBCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA553441
BSA (bovine serum albumine)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyA9418protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μmBIOLOGIX, China15-1070suitable for 50 mL tubes
CoverslipVWR, Radnor, Pennsylvania, United States631-158324 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA14190144no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histologyMerck KGaA, Darmstadt, Germany6522mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers - straightAnimalab, Poznan, Poland11251-10FSTsurgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers - bentAnimalab, Poznan, Poland11272-50FSTsurgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholicMerck KGaA, Darmstadt, GermanyHT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppenforf, Germany3,01,20,086polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mLEppenforf, Germany3,01,20,094polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol)Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.07017
Ethanol 96%Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.59010
Evans blueMerck KGaA, Darmstadt, GermanyE2129
FBS (fetal bovine serum)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAA3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10%Merck KGaA, Darmstadt, GermanyHT501128
Formamide 99.5% (GC)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyF7503
Freezer -20 °CBosch, GermanyGSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °CBosch, GermanyKGV36V10mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost PlusVWR, Radnor, Pennsylvania, United States631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad PrismGraphPad Software Inc.v. 9.4.0
Grey soapPollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., PolandBialy jelen soap bargrey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M)Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.60313
Harris hematoxylin solutionMerck KGaA, Darmstadt, GermanyHHS16
HemocytometerVWR, Avantor, U.S.A612-5719manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromideMerck KGaA, Darmstadt, GermanyH5882
HomogenizerQIAGEN Hilden, GermanyTissue Lyser LT, SN 23.1001/05234homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin)Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USASA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyH1009
Incubator Heracell 150iThermo Electron LED Gmbh, Germany4107106837 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injectionBiowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Polandcat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basisMerck KGaA, Darmstadt, Germany1.05108
Laboratory CentrifugeHeraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, GermanyB00013899speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory CentrifugeHeraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany75002425speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2)VWR, Radnor, Pennsylvania, United States111-0917for working with ortho-dianisine dihydrochloride
MiceBreeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, PolandCBA/J, C57BL/6
MicrometerMitutoyo, Tokyo, Japan193-111digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test)Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria655061with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectivesLeica Microsystems CMS GmbH, GermanyDM1000, 294011-082007histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyM6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyS9390
Olive-oilMerck KGaA, Darmstadt, Germany75343pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA SetBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA555138
Ortho-dianisine dihydrochlorideMerck KGaA, Darmstadt, GermanyD3252
Paraffin waxMerck KGaA, Darmstadt, Germany76242beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA20012027pH 7.2, mammalian cell culture
ph meterElmetron, PolandCP-401
Pipettes, variable volume with tipsMerck KGaA, Darmstadt, GermanyEP3123000900-1EA3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor bladeVWR, Radnor, Pennsylvania, United StatesPERS94-0462scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtomeMRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UKHIS-202A
Scissors - straight, sharp / sharpAnimalab, Poznan, Poland14060-10FSTSurgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top)Merck KGaA, Darmstadt, Germany27056black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
SpectrophotometerBioTek Instruments, U.S.A201446universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 - 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 - 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rackMerck KGaA, Darmstadt, GermanyS6141e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mmIntegra LifeSciences, Princeton, NJ, USA33-36
Surgical scissorsAnimalab, Poznan, Poland52138-46surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettesMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ672122tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent SetBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene)Tokyo Chemical Industry CO., LTD, JapanC0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl)Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USAT-5050
T-PER (tissue protein extration reagent)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA78510
Tubes 15 mL sterileMerck KGaA, Darmstadt, GermanyCLS430055 (Corning)polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterileMerck KGaA, Darmstadt, GermanyCLS430290 (Corning)polypropylene, conical bottom
Tween 20Merck KGaA, Darmstadt, GermanyP1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Germany27173for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bathAJL Electronic, PolandLW102
Wax (paraffin) dispenserVWR, Radnor, Pennsylvania, United States114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injectionVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Polandcat.# not avaliable
Xylene (histological grade)Merck KGaA, Darmstadt, Germany534056

Referenzen

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