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  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

La hipersensibilidad de contacto (CHS) es un modelo experimental murino de dermatitis alérgica de contacto (ACD). El CHS se basa en la sensibilización con hapteno reactivo mediante la pintura de la piel afeitada del pecho y el abdomen, con un posterior desafío de la piel del oído con un hapteno diluido, causando una reacción de hinchazón que se evalúa de varias maneras.

Resumen

La hipersensibilidad de contacto (CHS) es un modelo experimental de dermatitis alérgica de contacto (ACD) que se puede estudiar en ratones. Este estudio tiene como objetivo presentar un método de laboratorio objetivo que pueda ayudar a estudiar la reacción chS en ratones, que puede medirse y cuantificarse mediante diversas pruebas. Para inducir CHS, en el día "0", los ratones fueron sensibilizados en un punto previamente afeitado por pintura de piel abdominal con el hapteno 2,4,6-trinitroclorobenceno (TNCB) en una mezcla de acetona-etanol, mientras que los ratones de control negativo fueron sensibilizados simuladamente con la mezcla de vehículo solo de acetona-etanol. En el día "4", el grosor basal del oído se midió con un micrómetro antes de la elicitación de CHS (desafío) pintando ambos oídos con TNCB diluido tanto en el grupo de prueba como en el de control. Después de 24 h, la hinchazón del oído se midió con un micrómetro. CHS es un ejemplo de una respuesta inmune mediada por células T que causa hinchazón en el tejido inflamado, alcanzando su punto máximo 24 horas después del desafío de la piel con el mismo hapteno. Un aumento en el edema del oído se correlacionó con el aumento del peso del oído, la actividad de la mieloperoxidasa (MPO), la concentración de citoquinas proinflamatorias en los extractos de oído, el aumento del engrosamiento de la dermis edematosa en el examen histológico y la permeabilidad vascular del oído. También hubo un aumento en la concentración de anticuerpos IgG1 específicos de TNP en los sueros del grupo de prueba en comparación con los ratones de control. Además, el CHS se puede transferir con éxito con las células efectoras de CHS obtenidas de donantes previamente sensibilizados con TNCB. Las células efectoras de CHS se administraron por vía intravenosa en ratones receptores ingenuos, que posteriormente fueron desafiados con el mismo hapteno diluido. La hinchazón del oído se midió con un micrómetro 24 h más tarde.

Introducción

La dermatitis alérgica de contacto (ACD) es una enfermedad inflamatoria común de la piel en los países industrializados causada por una reacción de hipersensibilidad tipo IV resultante de la exposición a sustancias químicas de bajo peso molecular llamadas haptenos. Las sustancias que causan sensibilización por contacto en los seres humanos incluyen iones de metales pesados (cromo, níquel, hierro, cobalto), trementina, fragancias, colorantes y conservantes presentes en cosméticos (por ejemplo, p-fenilendiamina), algunos medicamentos (por ejemplo, neomicina, benzocaína), antibióticos β-lactámicos (es decir, penicilina), productos químicos producidos por las plantas (pentadecacacecol, una sustancia presente en la hiedra venenosa), así como hidroquinona utilizada en la industria fotográfica 1,2 . Los agentes etiológicos acD son muy altos, ya que solo en la industria se utilizan más de 100,000 productos químicos, y se sintetizan 2,000 nuevos cada año. Hasta la fecha, se han identificado más de 3.700 moléculas que pueden ser haptenos/alérgenos de contacto3. La reacción de hipersensibilidad de contacto (CHS) es un modelo experimental de ACD que puede estudiarse en ratones, cobayas y ratas y puede ser inducida por la aplicación tópica en la piel de haptenos químicos reactivos disueltos en disolventes orgánicos 4,5,6. Este estudio tiene como objetivo describir un método de laboratorio objetivo que puede ayudar a estudiar la reacción chS en ratones, que puede medirse y cuantificarse mediante diversas pruebas.

El CHS consiste en fases de sensibilización (inducción) y efector (desafío). En modelos animales, los haptenos primero se unen covalentemente a las proteínas del cuerpo para crear neoantígenos. Durante la fase de sensibilización, los queratinocitos activados promueven la migración y maduración de las células dendríticas de la piel (sDC) mediante la producción de citoquinas proinflamatorias-factor de necrosis tumoral α (TNF-α) e interleucina 1β (IL-1β)7. Las células de Langerhans epidérmicas (LC) presentan antígenos durante las fases de inducción y efector del CHS8. Los LC expuestos al hapteno durante la sensibilización promueven la inducción de células reguladoras y efectoras9. La creciente evidencia de varios estudios sugiere que las respuestas de CHS pueden estar mediadas por células Th1 restringidas a CD4 + MHC clase II, liberando localmente interferón-γ (IFN-γ) para emplear un infiltrado inflamatorio característico, linfocitos Tc1 restringidos por CD8 + MHC clase I que también pueden liberar IFN-γ pero en su mayoría median daño citotóxico a los queratinocitos, y ahora también células Th17 productoras de interleucina 17 (IL-17)10, 11.

Se han desarrollado varios modelos diferentes de CHS que emplean variasespecies 1 2,13,14 y haptenos (una comparación detallada de diferentes haptenos, disolventes y tiempo de aplicación se resume en la Tabla 1). El ratón, una especie de laboratorio de uso frecuente, ofrece algunas ventajas en el estudio de CHS. Hay más cepas, knockouts (KO) y animales transgénicos entre los ratones en comparación con otras especies, lo que los convierte en un animal muy atractivo15. Además, el modelo CHS requiere muchos animales, y los ratones son más económicos aquí. Los modelos animales no imitan el ACD en todos los aspectos; en particular, muestran costras y descamación, lo que no es común para los humanos16,17. Las características de la enfermedad crónica son difíciles de reproducir, principalmente porque el modelo descrito no asume la aplicación del hapteno durante un largo período de tiempo. Sin embargo, se ha confirmado aquí que muchos de los aspectos significativos de ACD se reproducen. También se ha demostrado que, al igual que en los seres humanos, estas características están asociadas con reacciones alérgicas locales. La elección del hapteno, su disolvente y su aplicación descrita en este protocolo fueron dictadas por el hecho de que los resultados han sido confirmados por numerosas pruebas in vitro y que fue probado y modificado en el laboratorio durante muchos años hasta que se estableció la versión actual. Los modelos murinos permiten el análisis de los subconjuntos celulares o citoquinas que están involucradas en el desarrollo de ACD y son esenciales para las evaluaciones preclínicas de nuevos tratamientos.

Protocolo

Todos los experimentos presentados en este artículo se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del 1er Comité Ético Local de Pruebas con Animales en Cracovia. Todos los procedimientos descritos se realizaron de acuerdo con las recomendaciones locales, especialmente con respecto al uso de ketamina / xilazina como anestésico, el uso de ambos lados de las orejas para aplicar la sustancia / hapteno, el corte de la oreja y la recolección de sangre mediante la extracción del globo ocular. Para el presente estudio se utilizaron BALB/c (haplotipo H-2d), CBA/J (H-2k) y C57BL/6 (H-2b), ratones machos y hembras de 6-12 semanas de edad (ver Tabla de Materiales). Para la significación estadística, es mejor si cada grupo de ratones consta de 10-12 animales.

1. Preparación animal

  1. Limpie la mesa de operaciones con una solución de etanol al 70% antes y después de todos los procedimientos. Si utiliza ratones que requieren condiciones estériles, realice todas las operaciones en un gabinete de bioseguridad.

2. Marcado de ratones para su identificación

  1. Etiquete a los ratones afeitando la piel con una hoja de afeitar: # 0 - sin marcar, # 2 - en la pata delantera derecha, # 3 - en el lado derecho, # 4 - en la pata trasera derecha, # 5 - en la base de la cola, # 6 - en la pata trasera izquierda, # 7 - en el lado izquierdo, # 8 - en la pata delantera izquierda.
    NOTA: Debido a la reacción inducida, los ratones no pueden ser marcados clásicamente por golpes en las orejas o marcaje. Los ratones no fueron anestesiados durante el etiquetado.

3. Inducción de CHS

NOTA: Este procedimiento se muestra en la Figura 1.

  1. Realice la sensibilización (inducción) siguiendo los pasos a continuación.
    1. En el día "0", afeitar ratones en el pecho y el abdomen (cuadrado 2 cm x 2 cm) aplicando jabón gris con agua y afeitándose con una cuchilla de afeitar.
      NOTA: Antes de aplicar hapteno, espere 6 h para que la piel no se irrite.
    2. Preparar hapteno al 5%: 2,4,6-trinitroclorobenceno (TNCB, ver Tabla de Materiales) en una mezcla de acetona-etanol (relación 1:3) o solo en vehículo (acetona-etanol). Prepare las soluciones justo antes de usarlo en un vial de vidrio y protéjalo de la luz cubriendo el vial con papel de aluminio.
    3. El mismo día, sensibilizar a los ratones aplicando 150 μL de hapteno al 5% en el lugar previamente afeitado. En el grupo de ratones control, aplique el vehículo solo para evaluar la reacción inflamatoria inespecífica. Antes de volver a poner al animal en la jaula, espere 30 s, dejando que el hapteno se seque.
      PRECAUCIÓN: Use guantes; TNCB causa una reacción alérgica grave en la mayoría de las personas.
  2. Realizar elicitación (desafío) y medición de la hinchazón del oído.
    1. El día "4", prepare hapteno al 0,4%: TNCB en una mezcla de acetona-etanol (proporción 1: 1). Prepare la solución justo antes de usarla en un vial de vidrio y protéjala de la luz cubriendo el vial con papel de aluminio.
    2. Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal (i.p.) de una mezcla de ketamina (90-120 mg/kg) y xilazina (5-10 mg/kg) (ver Tabla de Materiales) para anestesia profunda. Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado durante al menos 5 minutos con un pellizco en el dedo del pie.
    3. Medir el grosor del oído (medición de 0 h, línea de base) con un micrómetro (ver Tabla de Materiales) por un observador que no conozca los grupos experimentales.
    4. Aplicar 10 μL de hapteno al 0,4% en ambos lados de las orejas en ambos grupos (prueba y control). Antes de volver a poner al animal en la jaula, espere 30 s y deje que el hapteno se seque.
    5. El día "5", 24 h después de la aplicación de hapteno, repita los pasos 3.2.2-3.2.3 para la medición de 24 h.
    6. Evalúe la respuesta de CHS calculando la diferencia en el grosor de la aurícula antes y después del desafío con el hapteno: 24 h de grosor del oído (μm) - 0 h de grosor del oído (μm). Cuente cada oreja como una medida separada. A continuación, exprese la hinchazón del oído en micrómetros (μm) ± error estándar de la media (SEM) (Tabla 2, Figura 3).

4. Biopsias de oído

  1. Inmediatamente después de la medición de 24 horas del grosor de la oreja (cuando el ratón todavía está bajo anestesia profunda), corte las orejas lo más cerca posible del cráneo con tijeras. Recoja las biopsias del lado distal de las orejas haciendo un punzón de 6 mm de diámetro utilizando un punzón de biopsia (ver Tabla de Materiales).
    1. Mida el peso del oído (paso 4.2) y, además, realice una de las siguientes pruebas en la misma biopsia de oído: ensayo de mieloperoxidasa (MPO) (paso 4.3) o medición in vitro de la concentración de citoquinas en los extractos de oído (por ejemplo, IFN-γ, IL-17A, TNF-α [paso 4.4]).
      NOTA: Corte las orejas antes de la recolección de sangre. Después de este procedimiento, los ratones deben ser sacrificados (por ejemplo, por dislocación cervical).
  2. Medir el peso de cada biopsia de oído en la balanza analítica y expresarlo en miligramos (mg) (Figura 4).
  3. Realice un ensayo de MPO siguiendo los pasos a continuación.
    1. Preparar tampón de homogeneización disolviendo bromuro de hexadeciltrimetilamonio al 0,5% en tampón de fosforato de 50 mmol KH2PO4/Na2HPO4 y ajustando el pH a 6,0 (uso a temperatura ambiente, RT).
    2. Homogeneizar las biopsias en tubos de microcentrífuga de 2 ml con 500 μL de tampón preparado durante 10 min utilizando un homogeneizador con perlas de acero inoxidable de 5 mm de diámetro (añadir dos perlas/vial) (ver Tabla de Materiales). A continuación, enfríe la muestra durante 15 minutos a 4 °C y homogeneícela durante 10 minutos adicionales.
      NOTA: Los tubos de microcentrífuga tienen un fondo redondo para que las cuentas puedan moverse fácilmente.
    3. Congelar los homogeneizados a -20 °C durante 30 min. Descongelación y vórtice (asegúrese de que las muestras se descongelen). Repita este procedimiento 3x.
    4. Centrifugar los homogeneizados a 3.000 x g durante 30 min a 4 °C. Cosecha los sobrenadantes con una pipeta. Expresar la actividad MPO en unidades (U) por 1 mg de proteína.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Las muestras son estables a -20 °C durante 3 meses.
    5. Para medir la actividad de MPO, realice una reacción enzimática mezclando 20 μL de sobrenadante y 200 μL de sustrato MPO (0,167 mg/mL de diclorhidrato de orto-dianisina en 50 mmol de KH2PO4/Na2tampón HPO4 con 5 x 10−4% H202) y añadir en placas de fondo plano de 96 pocillos. Incubar las placas durante 20 min en RT.
    6. Preparar la curva estándar utilizando 20 μL del estándar MPO a concentraciones desde 0.008 U hasta 0.5 U en 200 μL del sustrato MPO. Prepare la muestra en blanco solo con el sustrato MPO.
      PRECAUCIÓN: Use una máscara mientras trabaja con diclorhidrato de orto-dianisina.
      NOTA: Las placas deben estar hechas de polipropileno, que tiene una menor capacidad de unión para que las proteínas o el ADN no se unan.
    7. Mida la densidad óptica (OD) a una longitud de onda de λ = 460 nm. La reacción enzimática es estable durante 10 min. Lea la actividad de MPO en muestras probadas de la curva estándar.
    8. Para medir la concentración de proteínas, use 20 μL del sobrenadante, realice una prueba con un kit de ácido bicinchonínico para la determinación de proteínas (ver Tabla de Materiales) y mida el OD a λ = 562 nm (Figura 5).
  4. Realizar medición in vitro de citoquinas en el extracto de oído.
    1. Homogeneizar las biopsias de oído en RT en tubos de microcentrífuga de 2 ml con 500 μL de reactivo de extracción de proteína tisular (T-PER) durante 10 min utilizando un homogeneizador con perlas de acero inoxidable de 5 mm de diámetro (añadir dos perlas/vial). A continuación, enfríe la muestra durante 15 minutos a 4 °C y homogeneícela durante 10 minutos adicionales.
      NOTA: Los tubos de microcentrífuga tienen un fondo redondo para que las cuentas puedan moverse fácilmente.
    2. Centrifugar los homogeneizados a 3.000 x g durante 30 min a 4 °C.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Las muestras son estables a -80 °C durante 6 meses.
    3. Evalúe los niveles de citoquinas utilizando un conjunto ELISA disponible comercialmente (por ejemplo, IFN-γ) (consulte la Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante (Figura 6).

5. Histología del tejido auditivo

  1. Inmediatamente después de la medición de 24 horas del grosor de la oreja, cuando el ratón todavía está profundamente anestesiado, corte las orejas lo más cerca posible del cráneo con las tijeras (paso 4.1).
    NOTA: Después de este procedimiento, los ratones deben ser sacrificados (por ejemplo, por dislocación cervical).
  2. Realice la incrustación de parafina de los bloques de tejido siguiendo los pasos a continuación.
    1. Inmediatamente después de la extracción, coloque la oreja en ~ 10 ml de formalina al 10% durante 24 h.
    2. Coloque las orejas en un cassette de procesamiento de tejidos. Coloque los casetes en un procesador automatizado (consulte la Tabla de materiales) para ciclos de deshidratación (alcohol 70%, 90%, 100%, 30 min cada uno en RT), ciclos de limpieza (xileno 3x, 30 min cada uno en RT) y ciclos de infiltración de cera (parafina 3x, 30 min cada uno a 56 °C).
    3. Retire los casetes del procesador automatizado y sujete la placa de calentamiento hasta que sea necesario. Llene el molde de cera con cera tibia (del dispensador).
    4. Retire las secciones del cassette con pinzas calentadas y colóquelas en el molde; a continuación, coloque la base del cassette en la parte superior del molde y luego llene con más cera. Colóquelo en agua fría en una placa fría durante 30 minutos para que la parafina se solidifique para formar un bloque que contenga la muestra.
    5. Utilice un microtomo rotativo (consulte la Tabla de materiales) para cortar secciones de ~5 μm de espesor. Flote las secciones en un baño tibio para aplanarlas. Recoja las secciones en un portaobjetos de microscopio de vidrio. Deje que se sequen en RT para asegurarse de que las secciones se adhieran a la diapositiva.
      NOTA: Use portaobjetos que eliminen la necesidad de aplicar materiales adhesivos o recubrimientos de proteínas para evitar la pérdida de secciones de tejido durante la tinción.
  3. Realizar tinción de hematoxilina y eosina (H&E).
    1. Prepare 17 platos de tinción con lo siguiente: xileno (cuatro platos), 100% etanol (alcohol absoluto) (cuatro platos), 90% etanol, 80% etanol, 70% etanol, 50% etanol, PBS (tres platos), solución de hematoxilina, solución de eosina. Transfiera las diapositivas de un plato a otro según los pasos a continuación y realice todo en RT.
      NOTA: El procedimiento en cada plato se puede repetir aproximadamente 10 veces (por ejemplo, si se usa un plato de 20 diapositivas, se pueden hacer 200 manchas sin cambiar los líquidos).
    2. Desparafinar las secciones mediante incubación a 65 °C durante 30 min en la incubadora. Sumergir los portaobjetos en xileno durante 30 min. Repita 1x en xileno nuevo durante 30 min.
    3. Sumergir los portaobjetos en etanol al 100% durante 5 min. Repita 1x en etanol nuevo 100% durante 5 min. Sumerja las diapositivas en la fila de etanol, 90%, 80%, 70% y 50%, durante 2 min en cada dilución.
    4. Sumerja los portaobjetos en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 min. Limpie el exceso de líquido alrededor del tejido y la parte posterior de los portaobjetos.
    5. Manche las secciones en solución de hematoxilina (ver Tabla de Materiales) durante 7-8 min. Lavar en agua corriente durante 30 s desde el reverso para no dañar las secciones. Repita el paso 5.3.4.
    6. Manche las secciones con solución de eosina (ver Tabla de Materiales) durante 30 s. Lave como se menciona en el paso 5.3.5 y luego repita el paso 5.3.4.
    7. Sumergir los portaobjetos en etanol al 100 % (alcohol absoluto) durante 2 min. Repita 1x en etanol nuevo 100% durante 2 min.
    8. Sumergir los portaobjetos en xileno durante 5 min. Repita 1x en xileno nuevo durante 5 min.
    9. Deje que las secciones se sequen al aire durante 15 minutos en RT. Agregue una gota de medio de montaje (consulte la Tabla de materiales) en un cubrecubiertas y luego colóquelo en la parte superior de la sección.
  4. Examine la sección bajo un microscopio de luz con un aumento de 20x o 40x, y capture imágenes (Figura 7).

6. Prueba de permeabilidad vascular

NOTA: Alternativamente a la medición del grosor del oído, se puede realizar una prueba de permeabilidad vascular.

  1. Sensibilizar a los ratones el día "0" (pasos 3.1.1-3.1.3), y luego, en el día "4", anestesiar a los ratones (paso 3.2.2) y aplicar directamente hapteno en las orejas (paso 3.2.4), omitiendo la medición del oído de 0 h.
  2. A las 23 h posteriores al desafío, anestesiar a los ratones (paso 3.2.2).
  3. Inyectar por vía intravenosa (i.v.) 8,3 μL/g de peso corporal de colorante azul Evans al 1% (ver Tabla de Materiales) en solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
  4. Anestesiar a los ratones de nuevo-anestesia profunda (paso 3.2.2)-1 h después de la inyección azul de Evans.
  5. Recoja biopsias de oído (paso 4.1).
    NOTA: Después de este procedimiento, los ratones deben ser sacrificados (por ejemplo, por dislocación cervical).
  6. Extraiga el tinte del tejido, coloque punzones en los tubos que contienen 1 ml de formamida e incube a 37 °C en la atmósfera de 5% de CO2 durante 18 h.
  7. Centrifuga las biopsias a 3.000 x g durante 3 min en RT. Recoger los sobrenadantes con una pipeta.
  8. Mida el OD a una longitud de onda de λ = 565 nm en placas de fondo plano de 96 pocillos contra un espacio en blanco que contenga formamida. El color es estable durante 24 h. Lea la concentración de las muestras de prueba de la curva estándar (use las concentraciones de azul de Evans que van desde 0.2-30 μg de colorante/ml de formamida) (Figura 8).
    NOTA: Las placas deben estar hechas de polipropileno, que tiene una menor capacidad de unión para que las proteínas o el ADN no se unan.

7. Recolección de suero y medición de anticuerpos anti-TNP inmunoglobulina (IgG1)

  1. Después de recolectar biopsias de oído (paso 4.1), cuando el ratón todavía está bajo anestesia profunda, retire el globo ocular con pinzas, ejerza una presión suave sobre el ratón y recolecte sangre del seno retroorbital en el tubo (vial con gel para obtener suero, consulte la Tabla de materiales). Un método alternativo para recolectar sangre podría ser perforar el corazón con una jeringa y recolectar la sangre.
    NOTA: La sangre debe recogerse después de extraer las orejas. El mismo método de sangrado debe utilizarse en todo un estudio debido a las posibles diferencias en los parámetros sanguíneos18. Después de este procedimiento, los ratones deben ser sacrificados (por ejemplo, por dislocación cervical).
  2. Invierta un mínimo de 6x, espere 30 minutos para que la sangre coagule y luego centríe a 1,300-2,000 x g durante 10 min a RT.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. La muestra es estable a -20 °C durante 6 meses.
  3. Cubra una placa de fondo plano de 96 pocillos con 50 μL de albúmina sérica bovina conjugada con 2,4,6-trinitrofenilo (TNP-BSA) disuelto en DPBS a una concertación de 10 μg/ml. A continuación, cubra la segunda placa con albúmina sérica bovina (BSA) sola disuelta en DPBS (fondo) a una concentración de 10 μg/ ml. Incubar durante la noche a 4 °C.
    NOTA: El suero de ratón contiene anticuerpos (Abs) contra BSA, por lo que las muestras deben analizarse en ambas placas, y a continuación, se debe realizar un cálculo (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. Lavar las placas con 300 μL de DPBS que contengan 0,05% Tween 20. Repita 3x.
  5. Preparar diluyente de ensayo (AD): DPBS que contiene 1% de BSA. Bloquee los pozos con AD durante 1 h en RT. Lavar de nuevo (paso 7.4).
  6. Preparar un estándar interno (iSTD): sensibilizar a los ratones con TNCB (pasos 3.1.1-3.1.3) y, 10 días después de la sensibilización, recolectar y sondear el suero de todos los donantes (paso 7.1 y paso 7.2).
  7. Añadir a la placa 50 μL de concentraciones graduadas de iSTD diluidas con AD para hacer la curva estándar (descrita en la Tabla 3). Añadir a la placa 50 μL de muestras de suero. Pruebe cada muestra y curva estándar en ambas placas (TNP-BSA y BSA recubiertas). Incubar durante 2 h en RT. Lavar las placas (paso 7.4).
  8. Añadir 50 μL de anticuerpo monoclonal igG1 biotinilado anti-ratón (mAb, ver Tabla de Materiales) diluido 1:250 con EA e incubar durante 1 h a RT. Lavar de nuevo (paso 7.4).
  9. Añadir 50 μL de estreptavidina peroxidasa de rábano picante (EStreptavidina HRD, ver Tabla de Materiales) diluida 1:2000 con EA, e incubar durante 30 min a RT en la oscuridad. Lavar la placa (paso 7.4).
  10. Añadir 50 μL de sustrato TMB (ver Tabla de Materiales) e incubar durante 30 min a RT en la oscuridad.
  11. Detener la reacción enzimática añadiendo 25 μL de 1 M H2SO4; la reacción es estable durante 30 min.
  12. Mida el OD a una longitud de onda de λ = 450 nm y un fondo de 570 nm (el fondo debe restarse de cada medición de 450 nm). Al presentar los resultados, reste las mediciones de BSA del TNP-BSA para muestras y la curva estándar. Luego, calcule la unidad (U) de anticuerpos de acuerdo con la curva estándar (Figura 9).

8. Transferencia adoptiva de las células efectoras de CHS

NOTA: Este procedimiento se muestra en la Figura 2.

  1. Donantes (en la proporción de un donante:1 receptor): sensibilizar a los ratones con TNCB el día "0" (pasos 3.1.1-3.1.3).
  2. En el día "4", anestesiar la anestesia profunda de los ratones (paso 3.2.2).
  3. Aislar con fórceps los ganglios linfáticos axilares e inguinales (ALN) y el bazo (SPL). Agrupe las ALN en un vial y las SPL en otro.
    NOTA: Hay un ganglio linfático axilar detrás del músculo pectoral en cada axila. Un ganglio linfático inguinal en la región de la cadera está situado junto a tres vasos sanguíneos. El bazo se encuentra en el lado izquierdo del cuerpo detrás del intestino y el estómago19. Trabaje con herramientas estériles en un gabinete de bioseguridad para mantener condiciones estériles. Después de este procedimiento, los ratones deben ser sacrificados (por ejemplo, por dislocación cervical).
  4. Triture el tejido entre los extremos esmerilados de dos portaobjetos de microscopio. Pase la suspensión celular a través de un colador celular con un tamaño de poro de 70 μm (ver Tabla de Materiales).
  5. Lave las células con DPBS suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 1%. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante y resuspendir el pellet celular restante en 1-5.0 mL de DPBS.
  6. Cuente las células vivas usando un hemocitómetro20 con azul de tripano, y mezcle 10 μL de la suspensión celular con 90-990 μL (dependiendo del número de células) de azul de tripano. Tenga en cuenta la dilución al calcular el número de celdas (10x-100x).
  7. Preparar una mezcla de ALNs y SPLs (ratio 1:1): 8.0 x 106 hasta 7.0 x 107/mouse en 200 μL de DPBS.
  8. Receptores (ratones singénicos ingenuos): anestesian ratones receptores ingenuos (paso 3.2.2) e inyectan i.v. con una mezcla preparada de las células efectoras chS (paso 8.7). En el grupo de control de ratones, no inyecte ninguna célula.
  9. Mida el grosor de la oreja antes (0 h) y después (24 h) del desafío (pasos 3.2.1-3.2.6) (Figura 10).
  10. Además, realice pruebas en células efectoras de CHS aisladas (por ejemplo, fenotipado celular o la medición de citoquinas producidas por las células efectoras de CHS mediante citometría de flujo). También se pueden establecer cultivos celulares, y se puede evaluar la capacidad de las células efectoras de CHS para proliferar en presencia del antígeno o la cantidad de citoquinas secretadas en los sobrenadantes de cultivo21,22 (datos no presentados).
    NOTA: La realización de pruebas adicionales requiere correspondientemente más donantes de células.

Resultados

Para la inducción de CHS, los animales fueron sensibilizados mediante pintura cutánea (abdominal) con 150 μL de TNCB al 5% o sensibilizados simuladamente con el vehículo solo. En el día "4", las respuestas de hinchazón del oído de ambos oídos fueron inducidas por pintura de contacto (desafío) con 10 μL de TNCB al 0,4% en ambos ratones previamente sensibilizados en contacto con TNCB (grupo de prueba) y en ratones del grupo control (sensibilizados simuladamente). Los datos presentados muestran que los ra...

Discusión

El CHS se induce a través de haptenos, que se unen a antígenos autoproteicos en la piel, creando neoantígenos. El CHS está mediado por el reclutamiento extravascular local de células T efectoras chS específicas del antígeno circulante, lo que resulta en hinchazón en el tejido desafiado, alcanzando su punto máximo 24 h después de la exposición de la piel secundaria al mismohapteno 6. La hinchazón del tejido es causada principalmente por la infiltración de leucocitos y la depos...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por la subvención SUBZ. A020.22.060 de la Universidad de Medicina de Wroclaw, Polonia, y por subvenciones del Ministerio de Ciencia y Educación Superior N N401 545940 a MS e IP2012 0443 72 a MMS.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
70% ethanolMerck KGaA, Darmstadt, Germany65350-Mfor surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropyleneGreiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria655101for MPO and Evans blue measurement - plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%)Merck KGaA, Darmstadt, Germany179124
Aluminum foilMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ185140
Analytical balanceSartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, GermanyPRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processorMediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, IndiaMTP-E-212automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum)Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USABD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determinationMerck KGaA, Darmstadt, GermanyBCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA553441
BSA (bovine serum albumine)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyA9418protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μmBIOLOGIX, China15-1070suitable for 50 mL tubes
CoverslipVWR, Radnor, Pennsylvania, United States631-158324 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA14190144no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histologyMerck KGaA, Darmstadt, Germany6522mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers - straightAnimalab, Poznan, Poland11251-10FSTsurgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers - bentAnimalab, Poznan, Poland11272-50FSTsurgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholicMerck KGaA, Darmstadt, GermanyHT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppenforf, Germany3,01,20,086polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mLEppenforf, Germany3,01,20,094polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol)Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.07017
Ethanol 96%Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.59010
Evans blueMerck KGaA, Darmstadt, GermanyE2129
FBS (fetal bovine serum)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAA3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10%Merck KGaA, Darmstadt, GermanyHT501128
Formamide 99.5% (GC)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyF7503
Freezer -20 °CBosch, GermanyGSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °CBosch, GermanyKGV36V10mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost PlusVWR, Radnor, Pennsylvania, United States631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad PrismGraphPad Software Inc.v. 9.4.0
Grey soapPollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., PolandBialy jelen soap bargrey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M)Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.60313
Harris hematoxylin solutionMerck KGaA, Darmstadt, GermanyHHS16
HemocytometerVWR, Avantor, U.S.A612-5719manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromideMerck KGaA, Darmstadt, GermanyH5882
HomogenizerQIAGEN Hilden, GermanyTissue Lyser LT, SN 23.1001/05234homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin)Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USASA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyH1009
Incubator Heracell 150iThermo Electron LED Gmbh, Germany4107106837 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injectionBiowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Polandcat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basisMerck KGaA, Darmstadt, Germany1.05108
Laboratory CentrifugeHeraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, GermanyB00013899speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory CentrifugeHeraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany75002425speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2)VWR, Radnor, Pennsylvania, United States111-0917for working with ortho-dianisine dihydrochloride
MiceBreeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, PolandCBA/J, C57BL/6
MicrometerMitutoyo, Tokyo, Japan193-111digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test)Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria655061with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectivesLeica Microsystems CMS GmbH, GermanyDM1000, 294011-082007histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyM6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyS9390
Olive-oilMerck KGaA, Darmstadt, Germany75343pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA SetBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA555138
Ortho-dianisine dihydrochlorideMerck KGaA, Darmstadt, GermanyD3252
Paraffin waxMerck KGaA, Darmstadt, Germany76242beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA20012027pH 7.2, mammalian cell culture
ph meterElmetron, PolandCP-401
Pipettes, variable volume with tipsMerck KGaA, Darmstadt, GermanyEP3123000900-1EA3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor bladeVWR, Radnor, Pennsylvania, United StatesPERS94-0462scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtomeMRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UKHIS-202A
Scissors - straight, sharp / sharpAnimalab, Poznan, Poland14060-10FSTSurgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top)Merck KGaA, Darmstadt, Germany27056black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
SpectrophotometerBioTek Instruments, U.S.A201446universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 - 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 - 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rackMerck KGaA, Darmstadt, GermanyS6141e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mmIntegra LifeSciences, Princeton, NJ, USA33-36
Surgical scissorsAnimalab, Poznan, Poland52138-46surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettesMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ672122tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent SetBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene)Tokyo Chemical Industry CO., LTD, JapanC0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl)Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USAT-5050
T-PER (tissue protein extration reagent)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA78510
Tubes 15 mL sterileMerck KGaA, Darmstadt, GermanyCLS430055 (Corning)polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterileMerck KGaA, Darmstadt, GermanyCLS430290 (Corning)polypropylene, conical bottom
Tween 20Merck KGaA, Darmstadt, GermanyP1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Germany27173for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bathAJL Electronic, PolandLW102
Wax (paraffin) dispenserVWR, Radnor, Pennsylvania, United States114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injectionVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Polandcat.# not avaliable
Xylene (histological grade)Merck KGaA, Darmstadt, Germany534056

Referencias

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