تطوير وتقييم نموذج الفئران لعيوب الغضروف كاملة السماكة

Summary

ينشئ هذا البروتوكول نموذجا لعيوب الغضروف كاملة السماكة (FTCD) عن طريق حفر ثقوب في أخدود الفخذ للفئران وقياس سلوك الألم اللاحق والتغيرات النسيجية المرضية.

Abstract

عيوب الغضروف في مفصل الركبة الناجمة عن الصدمة هي إصابة رياضية شائعة في المفصل في العيادة ، وتؤدي هذه العيوب إلى آلام المفاصل ، وضعف الحركة ، وفي النهاية هشاشة العظام في الركبة (kOA). ومع ذلك ، هناك القليل من العلاج الفعال لعيوب الغضروف أو حتى kOA. النماذج الحيوانية مهمة لتطوير الأدوية العلاجية ، لكن النماذج الحالية لعيوب الغضاريف غير مرضية. أنشأ هذا العمل نموذجا لعيوب الغضروف كاملة السماكة (FTCD) عن طريق حفر ثقوب في أخدود الفخذ للفئران ، وتم استخدام سلوك الألم اللاحق والتغيرات النسيجية المرضية كتجارب قراءة. بعد الجراحة ، تم تخفيض عتبة الانسحاب الميكانيكي ، وفقدت الخلايا الغضروفية في الموقع المصاب ، وزاد تعبير مصفوفة ميتالوبروتيناز MMP13 ، وانخفض تعبير الكولاجين من النوع الثاني ، بما يتفق مع التغيرات المرضية التي لوحظت في عيوب الغضروف البشري. هذه المنهجية سهلة وبسيطة في الأداء وتمكن من المراقبة الإجمالية فور الإصابة. علاوة على ذلك ، يمكن لهذا النموذج أن يحاكي بنجاح عيوب الغضروف السريرية ، وبالتالي توفير منصة لدراسة العملية المرضية لعيوب الغضروف وتطوير الأدوية العلاجية المقابلة.

Introduction

الغضروف المفصلي هو نسيج شديد التمايز وكثيف يتكون من الخلايا الغضروفية^{والمصفوفة} خارج الخلية 1. الطبقة السطحية للغضروف المفصلي هي شكل من أشكال الغضروف الزجاجي ، الذي يتميز بسطح أملس ، واحتكاك منخفض ، وقوة ومرونة جيدة ، وتحمل ممتاز للإجهاد الميكانيكي². تتكون المصفوفة خارج الخلية من الكولاجين البروتيني والماء ، والكولاجين من النوع الثاني هو المكون الهيكلي الرئيسي للكولاجين ، حيث يمثل حوالي 90٪ من إجمالي الكولاجين³. نظرا لعدم وجود أوعية دموية أو أعصاب في أنسجة الغضاريف ، فإنه يفتقر إلى القدرة على الإصلاح الذاتي بعد الإصابة⁴. لذلك ، كانت عيوب الغضروف الناجمة عن الصدمة دائما مرضا مشتركا مستعصيا في العيادات. بالإضافة إلى ذلك ، يميل هذا المرض المشترك إلى إصابة الشباب ، ومعدل الإصابة العالمي آخذ في الارتفاع ^5,6. مفصل الركبة هو الموقع الأكثر شيوعا لعيوب الغضروف ، والعيوب هنا مصحوبة بألم المفاصل ، وضعف المفاصل ، وتنكس الغضروف المفصلي ، مما يؤدي في النهاية إلى هشاشة العظام في الركبة (kOA) ⁷. عيوب الغضروف في مفصل الركبة تجلب أعباء اقتصادية وفسيولوجية للمرضى وتؤثر بشكل خطير على نوعية حياة المرضى⁸. يشكل هذا المرض تحديا سريريا كبيرا وعاجلا مع عدم وجود حلول وشيكة. حاليا ، الجراحة هي الدعامة الأساسية لعلاج عيوب الغضروف ، لكن نتائجها على المدى الطويل لا تزال غير مرضية⁹.

تؤدي عيوب الغضروف السريرية في النهاية إلى kOA ، وبالتالي ، تستخدم النماذج الحيوانية kOA بشكل شائع للدراسة المرضية لعيوب الغضروف وتطوير الأدوية. يعد إنشاء نماذج حيوانية أمرا مهما لفهم العملية الفيزيولوجية المرضية لإصلاح عيوب الغضروف ، والتي يمكن استخدامها لمراقبة تجديد الغضروف والتغيير بين الغضروف الليفي والغضروف الزجاجي¹⁰. ومع ذلك ، فإن النماذج الحيوانية الشائعة الاستخدام kOA ، مثل النماذج الجراحية لقطع الرباط الصليبي الأمامي (ACLT) ، وزعزعة استقرار الغضروف المفصلي الإنسي (DMM) ، واستئصال المبيض (OVX) ، و Hulth ، عادة ما تحتاج إلى نمذجة طويلة الأجل وتسمح فقط بالتقييمات المرضية والألم ، مما يشكل قيودا على كفاءة تطوير الأدوية¹¹. إلى جانب النماذج الجراحية ، تؤدي النماذج الكيميائية ، مثل أحادي يودوأسيتات (MIA) وحقن غراء ، أيضا إلى عيوب في الغضروف ، ولكن لا يمكن إدارة درجة العيب بشكل جيد ، والظروف بعيدة عن الواقع السريري¹¹. الاصطدام هو نهج آخر لنمذجة عيوب الغضروف في الحيوانات الكبيرة ، ولكن هذه الطريقة تعتمد على استخدام أدوات محددة ونادرا ما يتم تطبيقها¹².

باختصار ، نماذج kOA الحالية ليست مثالية لدراسة التسبب في عيوب الغضروف أو تطوير أدوية جديدة ، وهناك حاجة إلى نموذج محدد وموحد لعيوب الغضروف. أنشأت هذه الدراسة نموذجا لعيوب الغضروف كاملة السماكة (FTCD) عن طريق حفر ثقوب في أخدود الفخذ في الفئران. تم إجراء الملاحظة الإجمالية واختبارات سلوك الألم والتحليل النسيجي المرضي لتقييم النموذج. على عكس النماذج الحيوانية الأخرى من kOA ، فإن هذا النموذج له تأثير ضئيل على الحالة العامة للفئران. يمكن الوصول إلى نهج النمذجة هذا ، ويمكن إدارته بشكل جيد ، ويدعم فهم التقدم من عيوب الغضروف إلى kOA وتطوير علاجات فعالة. يمكن أيضا استخدام هذا النموذج لاختبار العلاجات التي تمنع kOA عن طريق شفاء العيوب في المفاصل قبل التهاب المفاصل.

Protocol

تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل لجنة المعايير والأخلاقيات الطبية بجامعة تشجيانغ للطب الصيني التقليدي ، والتي تتوافق مع التشريعات الصينية بشأن استخدام ورعاية المختبر. في الدراسة الحالية ، تم استخدام ذكور الفئران Sprague-Dawley (SD) البالغة من العمر 6 أسابيع والتي تزن 150-180 جم. تم الحصول على الحيوانات من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).

1. إنشاء نموذج عيوب الغضروف كاملة السماكة في الفئران

1. بعد 1 أسبوع من التأقلم مع البيئة الجديدة ، قسم الفئران بشكل عشوائي ومتساو إلى مجموعتين (ن = 8 فئران / مجموعة). ستخضع الفئران في المجموعة الوهمية للجراحة الوهمية ، بينما ستخضع الفئران في المجموعة النموذجية للجراحة التجريبية التي تنطوي على حفر ثقوب في أخدود الفخذ.
   ملاحظة: يجب تغطية كل قفص بحشوات معقمة من كوز الذرة (انظر جدول المواد) لحماية أصابع الفئران.
2. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق (i.p.) من الصوديوم بنتوباربيتال (40 ملغم / كغم). ثم اضغط برفق على أصابع الفئران لتأكيد التخدير الكافي. استخدم مرهما بيطريا على عيون الفئران لمنع الجفاف أثناء التخدير.
   ملاحظة: يجب إجراء جراحة الحيوانات في غرفة عمليات مخصصة باستخدام أدوات جراحية معقمة. يجب على المشغلين ارتداء معاطف المختبر النظيفة وأقنعة الوجه وأغطية الرأس والقفازات المعقمة أثناء الجراحة. ضع ضمادات معقمة على منطقة الجراحة وعقم جميع المعدات قبل الاستخدام. توفير الدعم الحراري طوال العملية.
3. ضع الفئران على طاولة العمليات في وضع ضعيف ، وحلق الأطراف الخلفية اليسرى واليمنى ، ونظف منطقة مفصل الركبة بالصابون الجراحي ، متبوعا بمحلول بوفيدون اليود المطهر بالتناوب والكحول ثلاث مرات في ظل ظروف معقمة. ضع ستارة معقمة فوق الجرذ ، وكشف مفصل الركبة المطهر فقط.
4. قم بعمل شق 1 سم بشفرة مشرط (رقم 11) في منتصف مفصل ركبة الفئران من أعلى إلى أسفل ، واقطع كبسولة المفصل ووتر الفخذ الفخذي على طول الحافة الإنسية للرضفة بعد التشريح السطحي.
   ملاحظة: يتم توصيل وتر الفخذ رباعي الرؤوس بالرضفة واللقمة الفخذية أثناء ثني مفصل الركبة¹³. الأخدود الذي يظهر في كبسولة المفصل هو أخدود عظم الفخذ ، وتشكل اللقمة الفخذية البعيدة اللقمات الإنسية والجانبية.
5. أدر الرضفة إلى الخارج ، وقم بثني الساق والشظية بزاوية 90 درجة لكشف تروقعة اللقمة الفخذية بالكامل. استخدم مثقاب ثقب دائري بقطر 1.6 مم (انظر جدول المواد) عموديا على سطح الغضروف عند 4000 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان لعمل عيب غضروفي كامل السماكة في أخدود القوقعة الفخذي بعمق 0.1 مم.
   ملاحظة: استخدم المحلول الملحي بشكل متقطع لتقليل الصدمات الحرارية للأنسجة العظمية المحيطة أثناء إجراء الحفر.
6. امسح موقع الجراحة بكرات قطنية مبللة بمحلول ملحي بنسبة 0.9٪ ، واستبدل الرضفة ، واحتفظ بالركبة في وضع التمديد ، وقم بخياطة الشق طبقة تلو الأخرى بخيوط غير قابلة للامتصاص 4-0 (انظر جدول المواد).
   1. ضع الحيوانات على منصات التدفئة مع راقد القص ، ومراقبتها حتى تستيقظ ، ثم إعادتها إلى أقفاصها. حقن البوبرينورفين (0.05 ملغ/كغ) تحت الجلد كل 8 ساعات ثلاث مرات بعد العملية لتخفيف الآلام.
7. اختبر السلوك المرتبط بالألم لجميع الفئران في 3 أيام و 10 أيام و 17 يوما بعد الجراحة ، كما هو موضح في القسم 2.

2. عتبة السحب الميكانيكية (MWT)

ملاحظة: تم قياس MWT للأخمص الخلفي الثنائي للفئران بواسطة طريقة قياس ألم خيوط فون فراي^{الكلاسيكية 14}.

1. ضع الجرذ في حجرة بلاستيكية واحدة (17 سم × 11 سم × 13 سم) على منصة شبكية سلكية (انظر جدول المواد) ، وضع قاعدة الشبكة السلكية 50 سم فوق الطاولة. قم بقياس MWT بعد 30 دقيقة من التكيف.
2. اضغط على خيوط فون فراي (انظر جدول المواد) بشكل عمودي على السطح الأخمصي للمخلب الخلفي لكل فأر ، وثني الفرشاة لمدة 2 ثانية تقريبا ، وتجنب الجزء السميك من مركز المخلب الخلفي.
3. قم بزيادة وزن التحفيز تدريجيا من أدنى 4 جم حتى تحدث استجابة إيجابية (انسحاب مخلب أو لعق مخلب).
   ملاحظة: يجب أن تكون الفترة الفاصلة بين كل تحفيز أكثر من 1 دقيقة. يتم تعريف MWT على أنه ثلاث استجابات إيجابية في خمسة محفزات. سجل وزن التحفيز بالجرام.
4. احسب القيم المتوسطة للمجموعات الوهمية والنموذجية وفقا للحد الأدنى المسجل لوزن التحفيز بالجرام.

3. التحليل النسيجي المرضي والمناعي الكيميائي

1. في 17 و 56 يوما بعد الجراحة ، قم بتخدير الفئران ب 40 مجم / كجم من الصوديوم الخماسي (IP) ، والتضحية بجميع الفئران عن طريق سحب الدم من القلب. عزل الركبتين عن طريق قطع العظام في منتصف عظم الفخذ ومنتصف الساق ، وتشريح الأنسجة العضلية المحيطة. إزالة مفاصل الركبة للتحليل النسيجي.
2. ثبت مفاصل الركبة في 20 مل من محلول بارافورمالدهايد 10٪ لمدة 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإزالة الكلس منها باستخدام 20 مل من محلول EDTA بنسبة 10٪ في شاكر مداري لمدة 8 أسابيع عند 4 درجات مئوية. قم بتغيير حل EDTA كل يوم.
3. قم بقص مفصل الركبة ليناسب حجم صندوق التضمين. قم بتضمين مفاصل الركبة المجففة في 100٪ بارافين¹⁵.
4. ضع مفاصل الركبة المضمنة بالبارافين على حامل الميكروتوم ، واضبط الزاوية ، وقم بقص عينة البارافين بشفرة حتى يصبح السطح مسطحا.
5. اضبط سمك شرائح البارافين على 3 ميكرومتر ، وقم بتسطيح الشرائح في حمام مائي عند 40 درجة مئوية.
6. ألصق الشرائح على شرائح زجاجية ، وضعها في آلة خبز 45 درجة مئوية (انظر جدول المواد) حتى تجف ، وقم بتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
7. إزالة الشمع والإماهة: قم بإزالة الشمع من الشرائح في الفرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات ، ثم ضع الشرائح على التوالي في 100٪ زيلين (ثلاث مرات) ، و 100٪ إيثانول (مرتين) ، و 95٪ إيثانول ، و 80٪ إيثانول ، و 75٪ إيثانول لمدة 5 دقائق في كل مرة.
8. تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E)
   1. قم بإزالة الشمع وإعادة الترطيب وغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
   2. قم بتلطيخ الشرائح بنسبة 0.5٪ هيماتوكسيلين (انظر جدول المواد) لمدة 3 دقائق ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج حتى لا يكون هناك بقايا هيماتوكسيلين على أسطح الشرائح.
   3. اغمر الشرائح في كحول حمض الهيدروكلوريك بنسبة 1٪ لمدة 3 ثوان ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
   4. انقع الشرائح في 1٪ من ماء الأمونيا لمدة 10 ثوان ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
   5. قم بتلطيخ الشرائح باستخدام eosin (انظر جدول المواد) لمدة 1 دقيقة ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج حتى لا يكون هناك بقايا يوزين على أسطح الشريحة.
   6. اغمر الشرائح في 95٪ إيثانول و 100٪ إيثانول و 100٪ زيلين (ثلاث مرات) على التوالي لمدة دقيقة واحدة في كل مرة.
   7. أضف قطرة من الراتنج المحايد (انظر جدول المواد) إلى كل شريحة ، وأغلقها بغطاء غطاء.
9. سافرانين O / فاست فرين (SO) تلطيخ
   1. قم بإزالة الشمع وإعادة الترطيب وغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
   2. قم بتلطيخ الشرائح بنسبة 0.05٪ Fast Green (انظر جدول المواد) لمدة 3 دقائق ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج حتى لا يكون هناك بقايا Fast Green على سطح الشرائح.
   3. اغمر الشرائح في محلول حمض الخليك 1٪ لمدة 10 ثوان ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
   4. قم بتلطيخ الشرائح بنسبة 2.5٪ SO (انظر جدول المواد) لمدة دقيقتين ، ثم اغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج حتى لا يكون هناك بقايا SO على أسطح الشرائح.
   5. اغمر الشرائح في 95٪ إيثانول و 100٪ إيثانول و 100٪ زيلين (ثلاث مرات) على التوالي لمدة دقيقة واحدة في كل مرة.
   6. أضف قطرة من الراتنج المحايد إلى كل شريحة ، وأغلقها بغطاء غطاء.
10. تلطيخ التولويدين الأزرق (TB)
    1. قم بإزالة الشمع وإعادة الترطيب وغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
    2. اغمر الشرائح في محلول 1٪ TB (انظر جدول المواد) لمدة 2 دقيقة ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج حتى لا يكون هناك بقايا زرقاء تولويدين على سطح الشرائح.
    3. اغمر الشرائح في 95٪ إيثانول و 100٪ إيثانول و 100٪ زيلين (ثلاث مرات) على التوالي لمدة دقيقة واحدة في كل مرة.
    4. أضف قطرة من الراتنج المحايد إلى كل شريحة ، وأغلقها بغطاء غطاء.
11. تلطيخ ماسون
    1. قم بإزالة الشمع وإعادة الترطيب وغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
    2. أضف محلول بوين (انظر جدول المواد) بالتنقيط إلى الشرائح ، وقم بتلطيخها عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة ، واغسلها بالماء المقطر المزدوج حتى يختفي اللون الأصفر على سطح الشرائح.
    3. قم بتلطيخ الشرائح باللون الأزرق السيليستيت (انظر جدول المواد) لمدة 3 دقائق ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج حتى لا يكون هناك بقايا زرقاء سيليستيت على أسطح الشرائح.
    4. قم بتلطيخ الشرائح بالهيماتوكسيلين لمدة 3 دقائق ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج حتى لا يكون هناك بقايا هيماتوكسيلين على أسطح الشرائح.
    5. اغمر الشرائح في الإيثانول الحمضي لمدة 5 ثوان ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
    6. قم بتلطيخ الشرائح باستخدام Ponceau fuchsin (انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج حتى لا يكون هناك بقايا Ponceau fuchsin على أسطح الشرائح.
    7. اغمر الشرائح في حمض الفوسفوموليبديك (انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق ، ثم اغمسها في محلول السل لمدة 5 دقائق ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج حتى لا يكون هناك بقايا سل على سطح الشرائح.
    8. اغمر الشرائح في محلول حمضي ضعيف لمدة دقيقتين ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة دقيقتين.
    9. اغمر الشرائح في 95٪ إيثانول و 100٪ إيثانول و 100٪ زيلين (ثلاث مرات) على التوالي لمدة 1 دقيقة في كل مرة.
    10. أضف قطرة من الراتنج المحايد إلى كل شريحة ، وأغلقها بغطاء غطاء.
12. راقب جميع الشرائح تحت المجهر في بيئة مزدوجة التعمية لتحديد درجة تنكس الغضروف المفصلي وفقا لنظام تسجيل مانكين¹⁶.
13. الكيمياء الهيستولوجية المناعية
    1. قم بإزالة الشمع وإعادة ترطيب الشرائح بشكل روتيني ، واغسل الشرائح باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة.
    2. اغمر الشرائح في محلول سترات الصوديوم ، وضع الشرائح في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات لإصلاح المستضد. اغسل الشرائح باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 3 دقائق لكل منها.
    3. اغمر الشرائح في محلول Triton X-100 بنسبة 0.3٪ لمدة 10 دقائق ، واغسل الشرائح مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق في كل مرة.
    4. منع نشاط البيروكسيديز الداخلي عن طريق إضافة محلول H 2 O₂3٪ في الميثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. اغسل الشرائح مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق في كل مرة.
    5. احتضن الأقسام بمصل الماعز بنسبة 5٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لمنع أي ارتباط غير محدد. اغسل الشرائح مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق في كل مرة.
    6. أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة ب PBS (anti-col1 ، 1:50 ؛ anti-col3 ، 1:50 ؛ anti-col2 ، 1: 100 ؛ و anti-MMP13 ، 1: 100 ؛ انظر جدول المواد) إلى كل شريحة ، واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اغسل الشرائح مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق في كل مرة.
    7. احتضن كل شريحة ب 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف (1: 100) (الماعز المضاد للأرانب أو الماعز المضاد للفأر ، انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. اغسل الشرائح مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق في كل مرة.
    8. أضف 100 ميكرولتر من 3 ، 3 '-ديامينوبنزيدين (DAB ، انظر جدول المواد) حل العمل لكل شريحة.
    9. مراقبة وتسجيل وقت ظهور اللون البني تحت المجهر ؛ يحول التفاعل الكروموجيني مواقع الخاتمة إلى اللون^{البني 17}. عالج بقية العينات بنفس وقت رد الفعل المسجل.
    10. بعد أن تتحول الشرائح إلى اللون البني ، اغسل الشرائح مرتين بالماء المقطر المزدوج لمدة 3 دقائق في كل مرة.
    11. أعد تلطيخ الشرائح بالهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
    12. اغمر الشرائح في حمض الهيدروكلوريك لمدة 3 ثوان ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
    13. انقع الشرائح في 1٪ من ماء الأمونيا لمدة 10 ثوان ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
    14. اغمر الشرائح في 95٪ إيثانول و 100٪ إيثانول و 100٪ زيلين (ثلاث مرات) على التوالي لمدة دقيقة واحدة في كل مرة.
    15. أضف قطرة من الراتنج المحايد إلى كل شريحة ، وأغلقها بغطاء غطاء.

النتائج

في هذا العمل ، تم إنشاء نموذج الفئران من FTCD عن طريق حفر ثقوب في أخدود الفخذ trochlear والكشف عن سلوك الألم اللاحق والتغيرات النسيجية. كما هو موضح في الشكل 1 ، بعد 3 أيام من النمذجة ، مقارنة بالمجموعة الوهمية ، انخفض MWT للفئران في المجموعة النموذجية بشكل كبير ، مما يشير إلى فرط التأ...

Discussion

تصف هذه الدراسة نموذجا حيوانيا لمحاكاة عيوب الغضروف السريرية عن طريق حفر ثقوب في أخدود الفخذ للفئران (الشكل التكميلي 1). بعد إصابة الغضروف ، يتم تعزيز استثارة أو استجابة مستقبلات الألم المحيطية ، مما قد يؤدي إلى انخفاض في عتبة الألم وتعزيز الاستجابة للتحفيز¹⁸

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3, 3 '-diaminobenzidine	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	ZLI-9019	The dye for IHC staining
Anti-Collagen III antibody	Novus	NB600-594	Primary antibody for IHC
Anti-Collagen II antibody	Abcam (UK)	34712	Primary antibody for IHC
Anti-Collagen I antibody	Novus	NB600-408	Primary antibody for IHC
Bouin solution	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Celestite blue	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Corncob paddings	Xiaohe Technology Co., Ltd		Bedding for animal
Eosin	Sigma-Aldrich	861006	The dye for HE staining
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	The dye for SO staining
Goat anti-mouse antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9002	Secondary antibody for IHC
Goat anti-rabbit antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9001	Secondary antibody for IHC
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3163	The dye for HE staining
Masson	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Microdrill	Rwd Life Science Co., Ltd	78001	Equipment for surgery
MMP13	Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)	69926	Primary antibody for IHC
Modular tissue embedding center	Thermo Fisher Scientific (USA)	EC 350	Produce paraffin blocks
Neutral resin	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	ZLI-9555	Seal for IHC
Nonabsorbable suture	Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd.	4-0	Equipment for surgery
Pentobarbital sodium	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	WBBTN5G	Anesthetized animal
phosphomolybdic acid	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Ponceau fuchsin	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Rotary and Sliding Microtomes	Thermo Fisher Scientific (USA)	HM325	Precise paraffin sections
Safranin-O	Sigma-Aldrich	S2255	The dye for SO staining
Scalpel blade	Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd.	11	Equipment for surgery
Sodium citrate solution (20x)	Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd.	HK1222	Antigen retrieval for IHC
Sprague Dawley (SD) rats	Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd.	SD	Experimental animal
Tissue-Tek VIP 5 Jr	Sakura (Japan)		Vacuum Infiltration Processor
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89640	The dye for TB staining
Von Frey filament	UGO Basile (Italy)	37450-275	Equipment for MWT assay
Wire mesh platform	Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd.		Equipment for MWT assay