Разработка и оценка крысиной модели полноразмерных дефектов хряща

Резюме

Этот протокол устанавливает модель полноразмерных дефектов хряща (FTCD) путем сверления отверстий в бедренной трохлеарной борозде крыс и измерения последующего болевого поведения и гистопатологических изменений.

Аннотация

Дефекты хряща коленного сустава, вызванные травмой, являются распространенными спортивными повреждениями суставов в клинике, и эти дефекты приводят к боли в суставах, нарушению движений и, в конечном итоге, остеоартриту коленного сустава (кОА). Тем не менее, существует мало эффективного лечения дефектов хряща или даже кОА. Животные модели важны для разработки терапевтических препаратов, но существующие модели дефектов хряща неудовлетворительны. В этой работе была создана модель полноразмерных дефектов хряща (FTCD) путем сверления отверстий в бедренной трохлеарной борозде крыс, а последующее болевое поведение и гистопатологические изменения были использованы в качестве считывающих экспериментов. После операции был снижен механический порог абстиненции, утрачены хондроциты в поврежденном месте, повышена экспрессия матриксной металлопротеиназы MMP13 и снижена экспрессия коллагена II типа, что соответствует патологическим изменениям, наблюдаемым при дефектах хряща человека. Эта методика проста и легка в применении и позволяет проводить грубое наблюдение сразу после травмы. Кроме того, эта модель может успешно имитировать клинические дефекты хряща, обеспечивая тем самым платформу для изучения патологического процесса дефектов хряща и разработки соответствующих терапевтических препаратов.

Введение

Суставной хрящ представляет собой высокодифференцированную и плотную ткань, состоящую из хондроцитов и внеклеточного матрикса¹. Поверхностный слой суставного хряща представляет собой форму гиалинового хряща, который имеет гладкую поверхность, низкое трение, хорошую прочность и эластичность, а также отличную устойчивость к механическим нагрузкам². Внеклеточный матрикс состоит из коллагена, протеогликана и воды, а коллаген II типа является основным структурным компонентом коллагена, так как на его долю приходится около 90% от общего количества коллагена³. Поскольку в хрящевой ткани отсутствуют кровеносные сосуды или нервы, она не обладает способностью к самовосстановлению после травмы⁴. Поэтому дефекты хряща, вызванные травмой, всегда были трудноизлечимым заболеванием суставов в клиниках; Кроме того, это заболевание суставов, как правило, поражает молодых людей, и глобальная заболеваемость растет ^5,6. Коленный сустав является наиболее распространенным местом дефектов хряща, и дефекты здесь сопровождаются болью в суставах, дисфункцией суставов и дегенерацией суставного хряща, что в конечном итоге приводит к остеоартрозу коленного сустава (кОА)⁷. Дефекты хряща коленного сустава создают экономическое и физиологическое бремя для пациентов и серьезно влияют на качество жизни пациентов⁸. Это заболевание представляет собой серьезную и неотложную клиническую проблему, решение которой не может быть найдено в ближайшее время. В настоящее время хирургическое вмешательство является основой лечения дефектов хряща, но его отдаленный исход остается неудовлетворительным⁹.

Клинические дефекты хряща в конечном итоге приводят к кОА, и, таким образом, животные модели кОА обычно используются для патологического изучения дефектов хряща и разработки лекарств. Создание животных моделей важно для понимания патофизиологического процесса восстановления дефектов хряща, которые могут быть использованы для наблюдения за регенерацией хряща и изменением между фиброзно-хрящевым и гиалиновым хрящами¹⁰. Тем не менее, широко используемые модели кОА на животных, такие как хирургические модели рассечения передней крестообразной связки (ACLT), дестабилизации медиального мениска (DMM), овариоэктомии (OVX) и Hulth, обычно нуждаются в долгосрочном моделировании и позволяют проводить только патологоанатомическую и болевую оценку, что накладывает ограничения на эффективность разработки лекарств¹¹. Помимо хирургических моделей, химические модели, такие как монойодоацетат (МИА) и инъекция папаина, также приводят к дефектам хряща, но степень дефекта не поддается адекватному контролю, а условия далеки от клинической реальности¹¹. Коллизия является еще одним подходом к моделированию дефектов хряща у более крупных животных, но этот метод зависит от использования конкретных инструментов и применяется редко¹².

Подводя итог, можно сказать, что существующие модели кОА не являются идеальными для изучения патогенеза дефектов хряща или разработки новых лекарственных препаратов, и необходима специфическая и стандартизированная модель дефектов хряща. В этом исследовании была создана модель полноразмерных дефектов хряща (FTCD) путем сверления отверстий в вертельчатой бороздке бедренной кости у крыс. Для оценки модели были проведены грубое наблюдение, тесты болевого поведения и гистопатологический анализ. В отличие от других животных моделей кОА, эта модель мало влияет на общее состояние крыс. Такой подход к моделированию является доступным, хорошо управляемым и способствует пониманию прогрессирования от дефектов хряща к кОА и разработке эффективных терапевтических средств. Эта модель также может быть использована для тестирования методов лечения, которые предотвращают кОА путем заживления дефектов в суставах, предостеартритных.

протокол

Эксперименты на животных были одобрены Комитетом по медицинским стандартам и этике Чжэцзянского университета традиционной китайской медицины, который соответствует законодательству Китая об использовании и уходе за лабораторными животными. В настоящем исследовании использовали 6-недельных самцов крыс Sprague-Dawley (SD) массой 150-180 г. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Создание полноразмерной модели дефектов хряща у крыс

1. Через 1 неделю акклиматизации к новой среде случайным образом и поровну разделите крыс на две группы (n = 8 крыс/группа). Крысы в фиктивной группе будут подвергнуты фиктивной операции, в то время как крысы в модельной группе будут подвергнуты экспериментальной операции, включающей сверление отверстий в бедренной трохлеарной бороздке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая клетка должна быть покрыта стерильными набивками из кукурузных початков (см. Таблицу материалов) для защиты пальцев ног крыс.
2. Обезболивайте крыс внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (40 мг/кг). Затем осторожно надавите на пальцы ног крыс, чтобы убедиться в адекватной анестезии. Наносите ветеринарную мазь на глаза крыс, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Операция на животных должна проводиться в специальной операционной с использованием автоклавных хирургических инструментов. Во время операции операторы должны носить чистые лабораторные халаты, маски для лица, головные уборы и стерильные перчатки. Положите стерильные прокладки на операционную область и простерилизуйте все оборудование перед использованием. Обеспечьте тепловую поддержку на протяжении всей процедуры.
3. Поместить крысу на операционный стол в положение лежа на спине, побрить левую и правую задние конечности, а область коленного сустава очистить хирургическим мылом с последующим чередованием антисептического раствора повидон-йода и спирта трижды в стерильных условиях. Накройте крысу стерильной простыней и обнажите только продезинфицированный коленный сустав.
4. Сделать надрез лезвием скальпеля (No 11) в середине коленного сустава крысы сверху вниз, а после поверхностного рассечения разрезать суставную капсулу и сухожилие четырехглавой мышцы бедра по медиальному краю надколенника.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сухожилие четырехглавой мышцы бедра прикрепляется к надколеннику и мыщелку бедренной кости во время сгибания коленного сустава¹³. Бороздка, видимая в капсуле сустава, является вертельной бороздой бедренной кости, а дистальный мыщелок бедренной кости образует медиальный и латеральный мыщелки.
5. Поверните коленную чашечку наружу и согните большеберцовую и малоберцовую кости под углом 90°, чтобы полностью обнажить улитку мыщелка бедренной кости. Используйте циркулярное сверло диаметром 1,6 мм (см. таблицу материалов) вертикально к поверхности хряща при 4 000 об/мин в течение 10 с, чтобы сделать один дефект хряща на всю толщину в вертельной бороздке бедренной кости глубиной 0,1 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте физиологический раствор с перерывами, чтобы свести к минимуму термическую травму окружающих костных тканей во время процедуры сверления.
6. Протирают место операции ватными шариками, смоченными в 0,9% физиологическом растворе, заменяют коленную чашечку, удерживают колено в разгибающем положении и послойно зашивают разрез нерассасывающимися нитями 4-0 (см. Таблицу материалов).
   1. Положите животных на грелки с лежачей грудиной, наблюдайте за ними до тех пор, пока они не проснутся, а затем верните их в клетки. Вводите бупренорфин (0,05 мг/кг) подкожно каждые 8 ч три раза после операции для облегчения боли.
7. Протестируйте поведение, связанное с болью, у всех крыс через 3, 10 и 17 дней после операции, как описано в разделе 2.

2. Механический порог изъятия (MWT)

ПРИМЕЧАНИЕ: MWT двустороннего заднего подошвенного отдела крыс измеряли классическим методом измерения боли в нитях по Фрею¹⁴.

1. Поместите крысу в одну пластиковую камеру (17 см x 11 см x 13 см) на платформу из проволочной сетки (см. Таблицу материалов), а основание из проволочной сетки разместите на высоте 50 см над столом. Измерьте MWT через 30 минут адаптации.
2. Надавите на нить фон Фрея (см. Таблицу материалов) перпендикулярно подошвенной поверхности задней лапы каждой крысы и согните щетку примерно на 2 с, избегая самой толстой части центра задней лапы.
3. Постепенно увеличивайте вес стимула с самых низких 4 г до тех пор, пока не наступит положительный ответ (отдергивание лапы или облизывание лапы).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Интервал между каждой стимуляцией должен быть более 1 мин. MWT определяется как три положительных реакции в пяти стимуляциях; Запишите вес стимула в граммах.
4. Вычислите средние значения для фиктивной и модельной групп в соответствии с записанным минимальным весом стимула в граммах.

3. Гистопатологический и иммуногистохимический анализ

1. Через 17 и 56 дней после операции обезболивайте крыс пентобарбиталом натрия (в/в) в дозе 40 мг/кг и приносите в жертву всех крыс, забирая кровь из сердца. Изолируйте колени, разрезав кость в середине бедренной и средней большеберцовой костей, и рассеките окружающую мышечную ткань. Удалить коленные суставы для проведения гистологического анализа.
2. Зафиксируйте коленные суставы в 20 мл 10% раствора параформальдегида в течение 48 ч при комнатной температуре, а затем декальцинируйте их 20 мл 10% раствора ЭДТА в орбитальном шейкере в течение 8 недель при 4 °C. Меняйте раствор ЭДТА каждый день.
3. Обрежьте коленный сустав в соответствии с размером коробки для встраивания. Заделайте обезвоженные коленные суставы в 100% парафин¹⁵.
4. Поместите залитые парафином коленные суставы на держатель микротома, отрегулируйте угол и обрежьте образец парафина лезвием до тех пор, пока поверхность не станет ровной.
5. Установите толщину ломтиков парафина на 3 мкм и расплющите ломтики на водяной бане при температуре 40 °C.
6. Наклейте ломтики на предметные стекла, поместите их в машину для выпечки при температуре 45 °C (см. Таблицу материалов), пока они не высохнут, и храните при комнатной температуре.
7. Депарафинизация и регидратация: Депарафинизация ломтиков в духовке при температуре 60 °C в течение 4 часов, а затем последовательно помещайте ломтики в 100% ксилол (три раза), 100% этанол (два раза), 95% этанол, 80% этанол и 75% этанол на 5 минут каждый раз.
8. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)
   1. Удалите парафин, регидратируйте и промойте ломтики двойной дистиллированной водой в течение 2 минут.
   2. Окрасьте ломтики 0,5% гематоксилином (см. Таблицу материалов) в течение 3 мин и промойте ломтики двойной дистиллированной водой до тех пор, пока на поверхностях ломтиков не останется остатков гематоксилина.
   3. Погрузите ломтики в 1%-ный солянокислый спирт на 3 с, а ломтики промойте дважды дистиллированной водой на 2 мин.
   4. Замочите ломтики в 1%-ной нашатырной воде на 10 с и промойте ломтики дважды дистиллированной водой в течение 2 минут.
   5. Окрасьте ломтики эозином (см. Таблицу материалов) в течение 1 мин и промойте ломтики двойной дистиллированной водой до тех пор, пока на поверхности ломтиков не останется следов эозина.
   6. Погрузите ломтики в 95% этанол, 100% этанол и 100% ксилол (три раза) последовательно на 1 минуту каждый раз.
   7. Добавьте каплю нейтральной смолы (см. Таблицу материалов) к каждому ломтику и запечатайте его покровным стеклом.
9. Окрашивание Safranin O/Fast Freen (SO)
   1. Удалите парафин, регидратируйте и промойте ломтики двойной дистиллированной водой в течение 2 минут.
   2. Окрасьте ломтики 0,05% Fast Green (см. Таблицу материалов) в течение 3 минут и промойте ломтики двойной дистиллированной водой до тех пор, пока на поверхности ломтиков не останется остатков Fast Green.
   3. Срезы погрузить в 1% раствор уксусной кислоты на 10 с, а срезы промыть дважды дистиллированной водой на 2 мин.
   4. Окрасьте ломтики 2,5% SO (см. Таблицу материалов) в течение 2 мин, а затем промойте ломтики двойной дистиллированной водой до тех пор, пока на поверхности ломтиков не останется остатков SO.
   5. Погрузите ломтики в 95% этанол, 100% этанол и 100% ксилол (три раза) последовательно на 1 минуту каждый раз.
   6. Добавьте каплю нейтральной смолы в каждый ломтик и запечатайте его покровным стеклом.
10. Окрашивание толуидиновым синим (TB)
    1. Удалите парафин, регидратируйте и промойте ломтики двойной дистиллированной водой в течение 2 минут.
    2. Погрузите ломтики в 1% раствор ТБ (см. таблицу материалов) на 2 мин и промойте ломтики дважды дистиллированной водой до тех пор, пока на поверхности ломтиков не останется остатка толуидинового синего.
    3. Погрузите ломтики в 95% этанол, 100% этанол и 100% ксилол (три раза) последовательно на 1 минуту каждый раз.
    4. Добавьте каплю нейтральной смолы в каждый ломтик и запечатайте его покровным стеклом.
11. Окрашивание по Массону
    1. Удалите парафин, регидратируйте и промойте ломтики двойной дистиллированной водой в течение 2 минут.
    2. Добавьте раствор Буэна (см. Таблицу материалов) по каплям к ломтикам, окрасьте их при 37 °C в течение 2 ч и промойте двойной дистиллированной водой до исчезновения желтого цвета на поверхности ломтиков.
    3. Окрасьте ломтики целеститовым синим (см. Таблицу материалов) в течение 3 минут и промойте ломтики двойной дистиллированной водой до тех пор, пока на поверхности ломтиков не останется следов целеститового синего цвета.
    4. Окрасьте ломтики гематоксилином в течение 3 минут и промойте ломтики двойной дистиллированной водой до тех пор, пока на поверхностях ломтиков не останется следов гематоксилина.
    5. Погрузите ломтики в кислый этанол на 5 секунд и промойте ломтики дважды дистиллированной водой на 2 минуты.
    6. Окрасьте ломтики фуксином Понсо (см. Таблицу материалов) в течение 10 минут и промойте ломтики двойной дистиллированной водой до тех пор, пока на поверхностях ломтиков не останется остатков фуксина Понсо.
    7. Срезы погрузить в фосфомолибдиновую кислоту (см. таблицу материалов) на 10 мин, затем погрузить их в раствор туберкулеза на 5 мин и промыть ломтики двойной дистиллированной водой до тех пор, пока на поверхности ломтиков не останется остатков туберкулеза.
    8. Погрузите ломтики в слабый раствор кислоты на 2 мин, а ломтики промойте дважды дистиллированной водой на 2 мин.
    9. Погрузите ломтики в 95% этанол, 100% этанол и 100% ксилол (три раза) последовательно на 1 минуту каждый раз.
    10. Добавьте каплю нейтральной смолы в каждый ломтик и запечатайте его покровным стеклом.
12. Наблюдают все срезы под микроскопом в двойных слепых условиях, чтобы определить степень дегенерации суставного хряща в соответствии с системой оценки^{Манкина 16}.
13. Иммуногистохимия
    1. Регулярно депарафинизируйте и увлажняйте ломтики и мойте ломтики PBS в течение 2 минут.
    2. Погрузите ломтики в раствор цитрата натрия и поместите ломтики в духовку при температуре 60 °C на 4 часа для восстановления антигена. Промойте ломтики PBS три раза по 3 минуты каждый.
    3. Погрузите ломтики в 0,3% раствор Triton X-100 на 10 минут и промойте ломтики дважды PBS по 3 минуты каждый раз.
    4. Блокируют активность эндогенной пероксидазы, добавляя 3%-ныйраствор Н2О2 в метанол при комнатной температуре в течение 30 мин. Промойте ломтики дважды PBS в течение 3 минут каждый раз.
    5. Инкубируйте срезы с 5% козьей сывороткой в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы заблокировать любое неспецифическое связывание. Промойте ломтики дважды PBS в течение 3 минут каждый раз.
    6. Добавьте 100 мкл первичных антител, разбавленных PBS (анти-кол1, 1:50; анти-кол3, 1:50; анти-кол2, 1:100; и анти-MMP13, 1:100; см. таблицу материалов) к каждому ломтику и инкубируйте их в течение ночи при 4 °C. Промойте ломтики дважды PBS в течение 3 минут каждый раз.
    7. Инкубируют каждый срез со 100 мкл вторичных антител, разбавленных PBS (1:100) (козьи антикролики или козьи мыши, см. таблицу материалов) при комнатной температуре в течение 20 минут. Промойте ломтики дважды PBS в течение 3 минут каждый раз.
    8. К каждому срезу добавляют 100 мкл 3,3'-диаминобензидина (DAB, см. таблицу материалов).
    9. Наблюдайте и записывайте время появления коричневого цвета под микроскопом; Хромогенная реакция окрашивает участки эпитопов в коричневый^{цвет 17}. Обработайте остальные образцы с тем же зарегистрированным временем реакции.
    10. После того, как ломтики станут коричневыми, промойте ломтики дважды двойной дистиллированной водой в течение 3 минут каждый раз.
    11. Повторно окрасьте ломтики гематоксилином в течение 1 минуты и промойте ломтики дважды дистиллированной водой в течение 2 минут.
    12. Погрузите ломтики в соляную кислоту на 3 с, а ломтики промойте дважды дистиллированной водой на 2 мин.
    13. Замочите ломтики в 1%-ной нашатырной воде на 10 с и промойте ломтики дважды дистиллированной водой в течение 2 минут.
    14. Погрузите ломтики в 95% этанол, 100% этанол и 100% ксилол (три раза) последовательно на 1 минуту каждый раз.
    15. Добавьте каплю нейтральной смолы в каждый ломтик и запечатайте его покровным стеклом.

Результаты

В данной работе была создана модель FTCD на крысах путем сверления отверстий в трохлеарной борозде бедренной кости и выявления последующего болевого поведения и гистопатологических изменений. Как показано на рисунке 1, через 3 дня после моделирования, по сравнению с фикт?...

Обсуждение

В этом исследовании описывается животная модель для имитации клинических дефектов хряща путем сверления отверстий в бедренной трохлеарной борозде крыс (дополнительный рисунок 1). После повреждения хряща повышается возбудимость или отзывчивость периферических ноци...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3, 3 '-diaminobenzidine	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	ZLI-9019	The dye for IHC staining
Anti-Collagen III antibody	Novus	NB600-594	Primary antibody for IHC
Anti-Collagen II antibody	Abcam (UK)	34712	Primary antibody for IHC
Anti-Collagen I antibody	Novus	NB600-408	Primary antibody for IHC
Bouin solution	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Celestite blue	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Corncob paddings	Xiaohe Technology Co., Ltd		Bedding for animal
Eosin	Sigma-Aldrich	861006	The dye for HE staining
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	The dye for SO staining
Goat anti-mouse antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9002	Secondary antibody for IHC
Goat anti-rabbit antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9001	Secondary antibody for IHC
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3163	The dye for HE staining
Masson	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Microdrill	Rwd Life Science Co., Ltd	78001	Equipment for surgery
MMP13	Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)	69926	Primary antibody for IHC
Modular tissue embedding center	Thermo Fisher Scientific (USA)	EC 350	Produce paraffin blocks
Neutral resin	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	ZLI-9555	Seal for IHC
Nonabsorbable suture	Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd.	4-0	Equipment for surgery
Pentobarbital sodium	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	WBBTN5G	Anesthetized animal
phosphomolybdic acid	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Ponceau fuchsin	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Rotary and Sliding Microtomes	Thermo Fisher Scientific (USA)	HM325	Precise paraffin sections
Safranin-O	Sigma-Aldrich	S2255	The dye for SO staining
Scalpel blade	Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd.	11	Equipment for surgery
Sodium citrate solution (20x)	Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd.	HK1222	Antigen retrieval for IHC
Sprague Dawley (SD) rats	Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd.	SD	Experimental animal
Tissue-Tek VIP 5 Jr	Sakura (Japan)		Vacuum Infiltration Processor
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89640	The dye for TB staining
Von Frey filament	UGO Basile (Italy)	37450-275	Equipment for MWT assay
Wire mesh platform	Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd.		Equipment for MWT assay