Sviluppo e valutazione di un modello di ratto di difetti della cartilagine a tutto spessore

Riepilogo

Questo protocollo stabilisce un modello di difetti della cartilagine a tutto spessore (FTCD) praticando fori nel solco trocleare femorale dei ratti e misurando il successivo comportamento del dolore e i cambiamenti istopatologici.

Abstract

I difetti della cartilagine dell'articolazione del ginocchio causati da traumi sono una lesione articolare sportiva comune nella clinica e questi difetti provocano dolori articolari, movimenti alterati e, infine, artrosi del ginocchio (kOA). Tuttavia, c'è poco trattamento efficace per i difetti della cartilagine o addirittura kOA. I modelli animali sono importanti per lo sviluppo di farmaci terapeutici, ma i modelli esistenti per i difetti della cartilagine sono insoddisfacenti. Questo lavoro ha stabilito un modello di difetti della cartilagine a tutto spessore (FTCD) praticando fori nel solco trocleare femorale dei ratti, e il successivo comportamento del dolore e i cambiamenti istopatologici sono stati utilizzati come esperimenti di lettura. Dopo l'intervento chirurgico, la soglia di ritiro meccanico è diminuita, i condrociti nel sito danneggiato sono stati persi, l'espressione della metalloproteinasi MMP13 della matrice è aumentata e l'espressione del collagene di tipo II è diminuita, coerentemente con i cambiamenti patologici osservati nei difetti della cartilagine umana. Questa metodologia è facile e semplice da eseguire e consente un'osservazione grossolana immediatamente dopo l'infortunio. Inoltre, questo modello può imitare con successo i difetti clinici della cartilagine, fornendo così una piattaforma per lo studio del processo patologico dei difetti della cartilagine e lo sviluppo di farmaci terapeutici corrispondenti.

Introduzione

La cartilagine articolare è un tessuto altamente differenziato e denso costituito da condrociti e matrice extracellulare¹. Lo strato superficiale della cartilagine articolare è una forma di cartilagine ialina, che ha una superficie liscia, basso attrito, buona resistenza ed elasticità ed eccellente tolleranza alle sollecitazioni meccaniche². La matrice extracellulare comprende collagene proteoglicano e acqua, e il collagene di tipo II è il principale componente strutturale del collagene, in quanto rappresenta circa il 90% del collagene totale³. Poiché non esistono vasi sanguigni o nervi nel tessuto cartilagineo, manca la capacità di auto-ripararsi dopo l'infortunio⁴. Pertanto, i difetti della cartilagine causati da traumi sono sempre stati una malattia articolare intrattabile nelle cliniche; Inoltre, questa malattia articolare tende a colpire i giovani e l'incidenza globale è in aumento ^5,6. L'articolazione del ginocchio è il sito più comune di difetti della cartilagine, e i difetti qui sono accompagnati da dolori articolari, disfunzione articolare e degenerazione della cartilagine articolare, che alla fine porta all'artrosi del ginocchio (kOA)⁷. I difetti della cartilagine dell'articolazione del ginocchio comportano oneri economici e fisiologici per i pazienti e influenzano seriamente la qualità della vita dei pazienti⁸. Questa malattia rappresenta una sfida clinica importante e urgente senza soluzioni imminenti. Attualmente, la chirurgia è il cardine del trattamento per i difetti della cartilagine, ma il suo esito a lungo termine rimane insoddisfacente⁹.

I difetti clinici della cartilagine alla fine portano al kOA e, quindi, i modelli animali di kOA sono comunemente usati per lo studio patologico dei difetti della cartilagine e dello sviluppo di farmaci. La creazione di modelli animali è importante per comprendere il processo fisiopatologico di riparazione dei difetti cartilaginei che possono essere utilizzati per osservare la rigenerazione della cartilagine e l'alterazione tra fibrocartilagine e cartilagine ialina¹⁰. Tuttavia, i modelli animali kOA comunemente usati, come i modelli chirurgici di transezione del legamento crociato anteriore (ACLT), destabilizzazione del menisco mediale (DMM), ovariectomia (OVX) e Hulth, di solito richiedono una modellazione a lungo termine e consentono solo valutazioni patologiche e del dolore, il che pone limiti all'efficienza dello sviluppo del farmaco¹¹. Oltre ai modelli chirurgici, anche i modelli chimici, come il monoiodoacetato (MIA) e l'iniezione di papaina, provocano difetti della cartilagine, ma il grado del difetto non può essere ben gestito e le condizioni sono lontane dalla realtà clinica¹¹. La collisione è un altro approccio ai difetti della cartilagine modello negli animali più grandi, ma questo metodo dipende dall'uso di strumenti specifici e viene applicato raramente¹².

In sintesi, i modelli di kOA esistenti non sono ideali per studiare la patogenesi dei difetti della cartilagine o sviluppare nuovi farmaci ed è necessario un modello specifico e standardizzato per i difetti della cartilagine. Questo studio ha stabilito un modello di difetti della cartilagine a tutto spessore (FTCD) praticando fori nel solco trocleare femorale nei ratti. Sono stati condotti l'osservazione grossolana, i test sul comportamento del dolore e l'analisi istopatologica per la valutazione del modello. A differenza di altri modelli animali di kOA, questo modello ha scarso effetto sulle condizioni generali dei ratti. Questo approccio modellistico è accessibile, può essere ben gestito e supporta la comprensione della progressione dai difetti della cartilagine al kOA e lo sviluppo di terapie efficaci. Questo modello può anche essere utilizzato per testare terapie che prevengono il kOA curando i difetti nelle articolazioni pre-osteoartritiche.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Medical Standards and Ethics Committee della Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, che è conforme alla legislazione cinese sull'uso e la cura degli animali da laboratorio. Nel presente studio, sono stati utilizzati ratti maschi di Sprague-Dawley (SD) di 6 settimane del peso di 150-180 g. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi la tabella dei materiali).

1. Definizione di un modello di difetti della cartilagine a tutto spessore nei ratti

1. Dopo 1 settimana di acclimatazione al nuovo ambiente, dividere casualmente e equamente i ratti in due gruppi (n = 8 ratti / gruppo). I ratti nel gruppo sham avranno la chirurgia fittizia, mentre i ratti nel gruppo modello avranno la chirurgia sperimentale che prevede fori nel solco trocleare femorale.
   NOTA: Ogni gabbia deve essere coperta con imbottiture sterili di pannocchie (vedi la tabella dei materiali) per proteggere le dita dei ratti.
2. Anestetizzare i ratti mediante iniezione intraperitoneale (i.p.) di pentobarbital sodico (40 mg/kg). Quindi, premere delicatamente le dita dei ratti per confermare un'adeguata anestesia. Utilizzare un unguento veterinario sugli occhi dei ratti per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
   NOTA: La chirurgia animale deve essere eseguita in una sala operatoria dedicata utilizzando strumenti chirurgici autoclavati. Gli operatori devono indossare camici da laboratorio puliti, maschere facciali, copricapo e guanti sterili durante l'intervento. Posizionare cuscinetti sterili sopra l'area chirurgica e sterilizzare tutte le attrezzature prima dell'uso. Fornire supporto termico durante tutta la procedura.
3. Posizionare il ratto sul tavolo operatorio in posizione supina, radersi gli arti posteriori sinistro e destro e pulire l'area dell'articolazione del ginocchio con sapone chirurgico, seguito alternando soluzione antisettica povidone-iodio e alcol tre volte in condizioni sterili. Posizionare un drappo sterile sul ratto ed esporre solo l'articolazione del ginocchio disinfettata.
4. Fare un'incisione di 1 cm con una lama di bisturi (numero 11) nel mezzo dell'articolazione del ginocchio del ratto dall'alto verso il basso e tagliare la capsula articolare e il tendine del quadricipite femorale lungo il bordo mediale della rotula dopo la dissezione superficiale.
   NOTA: Il tendine del quadricipite femorale è attaccato alla rotula e al condilo femorale durante la flessione dell'articolazione del ginocchio¹³. Il solco visto nella capsula articolare è il solco trocleare femorale, e il condilo femorale distale forma i condili mediali e laterali.
5. Ruotare la rotula verso l'esterno e flettere la tibia e il perone con un angolo di 90° per esporre completamente la troclea del condilo femorale. Utilizzare una punta circolare da 1,6 mm di diametro (vedere la tabella dei materiali) verticale alla superficie della cartilagine a 4.000 giri/min per 10 s per creare un difetto della cartilagine a tutto spessore nella scanalatura trocleare femorale con una profondità di 0,1 mm.
   NOTA: Utilizzare soluzione salina in modo intermittente per ridurre al minimo il trauma termico al tessuto osseo circostante durante la procedura di perforazione.
6. Pulire il sito chirurgico con batuffoli di cotone imbevuti di una soluzione salina allo 0,9%, sostituire la rotula, mantenere il ginocchio in una posizione di estensione e suturare l'incisione strato per strato con suture 4-0 non assorbibili (vedi Tabella dei materiali).
   1. Posizionare gli animali su cuscinetti riscaldanti con recumbency sternale, monitorarli fino al loro risveglio e poi riportarli nelle loro gabbie. Iniettare buprenorfina (0,05 mg/kg) per via sottocutanea ogni 8 ore tre volte dopo l'operazione per alleviare il dolore.
7. Testare il comportamento correlato al dolore di tutti i ratti a 3 giorni, 10 giorni e 17 giorni dopo l'intervento, come descritto nel paragrafo 2.

2. Soglia di prelievo meccanico (MWT)

NOTA: Il MWT del plantare posteriore bilaterale dei ratti è stato misurato con il classico metodo di misurazione del dolore del filamento di von Frey¹⁴.

1. Posizionare il ratto in una singola camera di plastica (17 cm x 11 cm x 13 cm) su una piattaforma di rete metallica (vedere la tabella dei materiali) e posizionare la base di rete metallica 50 cm sopra un tavolo. Misurare il MWT dopo 30 minuti di adattamento.
2. Premere il filamento di von Frey (vedi la tabella dei materiali) perpendicolarmente sulla superficie plantare della zampa posteriore di ciascun ratto e piegare il pennello per circa 2 s, evitando la parte più spessa del centro della zampa posteriore.
3. Aumentare gradualmente il peso dello stimolo dai 4 g più bassi fino a quando non si verifica una risposta positiva (ritiro della zampa o leccatura della zampa).
   NOTA: L'intervallo tra ogni stimolazione deve essere superiore a 1 minuto. Il MWT è definito come tre risposte positive in cinque stimolazioni; Registra il peso dello stimolo in grammi.
4. Calcolare i valori medi per i gruppi sham e modello in base al peso minimo dello stimolo registrato in grammi.

3. Analisi istopatologiche e immunoistochimiche

1. A 17 e 56 giorni dopo l'intervento chirurgico, anestetizzare i ratti con un pentobarbital sodico (i.p.) di 40 mg/kg e sacrificare tutti i ratti prelevando il sangue dal cuore. Isolare le ginocchia tagliando l'osso a metà femore e metà tibia e sezionare il tessuto muscolare circostante. Rimuovere le articolazioni del ginocchio per l'analisi istologica.
2. Fissare le articolazioni del ginocchio in 20 ml di soluzione di paraformaldeide al 10% per 48 ore a temperatura ambiente, quindi decalcificarle con 20 ml di soluzione di EDTA al 10% in uno shaker orbitale per 8 settimane a 4 °C. Cambiare la soluzione EDTA ogni giorno.
3. Tagliare l'articolazione del ginocchio per adattarla alle dimensioni della scatola di incorporamento. Incorporare le articolazioni del ginocchio disidratate in 100% paraffina¹⁵.
4. Posizionare le articolazioni del ginocchio incorporate in paraffina sul supporto di un microtomo, regolare l'angolo e tagliare il campione di paraffina con una lama fino a quando la superficie non è piatta.
5. Impostare lo spessore delle fette di paraffina a 3 μm e appiattire le fette a bagnomaria a 40 °C.
6. Incollare le fette su vetrini, metterle in una macchina da forno a 45 °C (vedere la tabella dei materiali) fino a quando non sono asciutte e conservarle a temperatura ambiente.
7. Deceratura e reidratazione: decerare le fette in forno a 60 °C per 4 ore, quindi posizionare le fette successivamente in xilene al 100% (tre volte), etanolo al 100% (due volte), etanolo al 95%, etanolo all'80% e etanolo al 75% per 5 minuti ogni volta.
8. Colorazione con ematossilina ed eosina (H & E)
   1. Decerare, reidratare e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.
   2. Macchiare le fette con ematossilina allo 0,5% (vedi Tabella dei materiali) per 3 minuti e lavare le fette con acqua bidistillata fino a quando non vi è alcun residuo di ematossilina sulle superfici delle fette.
   3. Immergere le fette in alcool cloridrico all'1% per 3 secondi e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.
   4. Immergere le fette in acqua ammoniacale all'1% per 10 secondi e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.
   5. Macchiare le fette con eosina (vedi Tabella dei materiali) per 1 minuto e lavare le fette con acqua bidistillata fino a quando non ci sono residui di eosina sulle superfici delle fette.
   6. Immergere le fette in etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene al 100% (tre volte) successivamente per 1 minuto ogni volta.
   7. Aggiungere una goccia di resina neutra (vedi Tabella dei materiali) a ciascuna fetta e sigillarla con un coprifoglio.
9. Colorazione Safranin O/Fast Freen (SO)
   1. Decerare, reidratare e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.
   2. Macchiare le fette con 0,05% Fast Green (vedi la tabella dei materiali) per 3 minuti e lavare le fette con acqua bidistillata fino a quando non ci sono residui Fast Green sulla superficie delle fette.
   3. Immergere le fette in una soluzione di acido acetico all'1% per 10 s e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.
   4. Macchiare le fette con il 2,5% di SO (vedi Tabella dei materiali) per 2 minuti, quindi lavare le fette con acqua bidistillata fino a quando non ci sono residui di SO sulle superfici delle fette.
   5. Immergere le fette in etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene al 100% (tre volte) successivamente per 1 minuto ogni volta.
   6. Aggiungere una goccia di resina neutra a ciascuna fetta e sigillarla con un coprifoglio.
10. Colorazione blu toluidina (TB)
    1. Decerare, reidratare e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.
    2. Immergere le fette in una soluzione all'1% TB (vedere la tabella dei materiali) per 2 minuti e lavare le fette con acqua bidistillata fino a quando non vi è alcun residuo di blu di toluidina sulla superficie delle fette.
    3. Immergere le fette in etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene al 100% (tre volte) successivamente per 1 minuto ogni volta.
    4. Aggiungere una goccia di resina neutra a ciascuna fetta e sigillarla con un coprifoglio.
11. Colorazione Masson
    1. Decerare, reidratare e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.
    2. Aggiungere la soluzione di Bouin (vedere la tabella dei materiali) a goccia sulle fette, colorarle a 37 °C per 2 ore e lavarle con acqua distillata due volte fino a quando il colore giallo sulla superficie delle fette scompare.
    3. Macchiare le fette con blu celestite (vedere la tabella dei materiali) per 3 minuti e lavare le fette con acqua bidistillata fino a quando non ci sono residui di blu celestite sulle superfici delle fette.
    4. Macchiare le fette con ematossilina per 3 minuti e lavare le fette con acqua bidistillata fino a quando non vi è alcun residuo di ematossilina sulle superfici delle fette.
    5. Immergere le fette in etanolo acido per 5 secondi e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.
    6. Macchiare le fette con Ponceau fuchsin (vedi la tabella dei materiali) per 10 minuti e lavare le fette con acqua bidistillata fino a quando non ci sono residui di Ponceau fuchsin sulle superfici delle fette.
    7. Immergere le fette in acido fosfomolibdico (vedere la tabella dei materiali) per 10 minuti, quindi immergerle in soluzione TB per 5 minuti e lavare le fette con acqua bidistillata fino a quando non ci sono residui di TB sulla superficie delle fette.
    8. Immergere le fette in una soluzione acida debole per 2 minuti e lavare le fette con acqua distillata due volte per 2 minuti.
    9. Immergere le fette in etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene al 100% (tre volte) successivamente per 1 minuto ogni volta.
    10. Aggiungere una goccia di resina neutra a ciascuna fetta e sigillarla con un coprifoglio.
12. Osservare tutte le fette al microscopio in un ambiente in doppio cieco per determinare il grado di degenerazione della cartilagine articolare secondo il sistema di punteggio di Mankin¹⁶.
13. Immunoistochimica
    1. Decerare e reidratare le fette di routine e lavare le fette con PBS per 2 minuti.
    2. Immergere le fette in una soluzione di citrato di sodio e porre le fette in forno a 60 °C per 4 ore per riparare l'antigene. Lavare le fette con PBS tre volte per 3 minuti ciascuna.
    3. Immergere le fette in una soluzione Triton X-100 allo 0,3% per 10 minuti e lavare le fette due volte con PBS per 3 minuti ogni volta.
    4. Bloccare l'attività della perossidasi endogena aggiungendo una soluzione di H 2O₂ al 3% in metanolo a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavare le fette due volte con PBS per 3 minuti ogni volta.
    5. Incubare le sezioni con siero di capra al 5% in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente per bloccare qualsiasi legame non specifico. Lavare le fette due volte con PBS per 3 minuti ogni volta.
    6. Aggiungere 100 μL di anticorpi primari diluiti con PBS (anti-col1, 1:50; anti-col3, 1:50; anti-col2, 1:100; e anti-MMP13, 1:100; vedere la tabella dei materiali) a ciascuna fetta e incubarli per una notte a 4 °C. Lavare le fette due volte con PBS per 3 minuti ogni volta.
    7. Incubare ogni fetta con 100 μL di anticorpo secondario PBS-diluito (1:100) (capra anti-coniglio o capra anti-topo, vedere la Tabella dei materiali) a temperatura ambiente per 20 minuti. Lavare le fette due volte con PBS per 3 minuti ogni volta.
    8. Aggiungere 100 μL di soluzione di lavoro 3, 3 '-diaminobenzidina (DAB; vedere la tabella dei materiali) a ciascuna fetta.
    9. Osservare e registrare il tempo di comparsa di un colore marrone al microscopio; La reazione cromogenica trasforma i siti dell'epitopo in marrone¹⁷. Trattare il resto dei campioni con lo stesso tempo di reazione registrato.
    10. Dopo che le fette diventano marroni, lavare le fette due volte con acqua distillata due volte per 3 minuti ogni volta.
    11. Colorare nuovamente le fette con ematossilina per 1 minuto e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.
    12. Immergere le fette in acido cloridrico per 3 secondi e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.
    13. Immergere le fette in acqua ammoniacale all'1% per 10 secondi e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.
    14. Immergere le fette in etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene al 100% (tre volte) successivamente per 1 minuto ogni volta.
    15. Aggiungere una goccia di resina neutra a ciascuna fetta e sigillarla con un coprifoglio.

Risultati

In questo lavoro, è stato stabilito un modello di ratto di FTCD praticando fori nel solco trocleare femorale e rilevando il successivo comportamento del dolore e i cambiamenti istopatologici. Come mostrato nella Figura 1, 3 giorni dopo la modellazione, rispetto al gruppo sham, il MWT dei ratti nel gruppo modello è stato significativamente ridotto, suggerendo iperalgesia causata dalla FTCD. A 17 giorni dalla modellazione, la soglia di ritiro meccanico dei ratti nel gruppo modello è rimasta...

Discussione

Questo studio descrive un modello animale per imitare i difetti clinici della cartilagine praticando fori nel solco trocleare femorale dei ratti (Figura supplementare 1). Dopo la lesione della cartilagine, l'eccitabilità o la reattività dei nocicettori periferici è migliorata, il che può comportare una diminuzione della soglia del dolore e il miglioramento della reattività alla stimolazione¹⁸. Negli studi preclinici, la modellazione dei difetti della cartilag...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3, 3 '-diaminobenzidine	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	ZLI-9019	The dye for IHC staining
Anti-Collagen III antibody	Novus	NB600-594	Primary antibody for IHC
Anti-Collagen II antibody	Abcam (UK)	34712	Primary antibody for IHC
Anti-Collagen I antibody	Novus	NB600-408	Primary antibody for IHC
Bouin solution	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Celestite blue	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Corncob paddings	Xiaohe Technology Co., Ltd		Bedding for animal
Eosin	Sigma-Aldrich	861006	The dye for HE staining
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	The dye for SO staining
Goat anti-mouse antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9002	Secondary antibody for IHC
Goat anti-rabbit antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9001	Secondary antibody for IHC
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3163	The dye for HE staining
Masson	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Microdrill	Rwd Life Science Co., Ltd	78001	Equipment for surgery
MMP13	Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)	69926	Primary antibody for IHC
Modular tissue embedding center	Thermo Fisher Scientific (USA)	EC 350	Produce paraffin blocks
Neutral resin	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	ZLI-9555	Seal for IHC
Nonabsorbable suture	Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd.	4-0	Equipment for surgery
Pentobarbital sodium	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	WBBTN5G	Anesthetized animal
phosphomolybdic acid	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Ponceau fuchsin	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Rotary and Sliding Microtomes	Thermo Fisher Scientific (USA)	HM325	Precise paraffin sections
Safranin-O	Sigma-Aldrich	S2255	The dye for SO staining
Scalpel blade	Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd.	11	Equipment for surgery
Sodium citrate solution (20x)	Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd.	HK1222	Antigen retrieval for IHC
Sprague Dawley (SD) rats	Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd.	SD	Experimental animal
Tissue-Tek VIP 5 Jr	Sakura (Japan)		Vacuum Infiltration Processor
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89640	The dye for TB staining
Von Frey filament	UGO Basile (Italy)	37450-275	Equipment for MWT assay
Wire mesh platform	Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd.		Equipment for MWT assay