전층 연골 결손의 쥐 모델 개발 및 평가

요약

이 프로토콜은 쥐의 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫고 후속 통증 행동 및 조직병리학적 변화를 측정하여 전층 연골 결손(FTCD) 모델을 설정합니다.

초록

외상으로 인한 무릎 관절의 연골 결손은 클리닉에서 흔히 볼 수 있는 스포츠 관절 손상이며, 이러한 결손은 관절 통증, 운동 장애, 그리고 결국 무릎 골관절염(kOA)을 초래합니다. 그러나 연골 결손이나 kOA에 대한 효과적인 치료법은 거의 없습니다. 동물 모델은 치료제 개발에 중요하지만 연골 결손에 대한 기존 모델은 만족스럽지 못하다. 이 연구는 쥐의 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫어 전층 연골 결손(FTCD) 모델을 확립하고 후속 통증 행동과 조직병리학적 변화를 판독 실험으로 사용했습니다. 수술 후, 기계적 금단 역치가 감소하고, 손상된 부위의 연골 세포가 손실되고, 매트릭스 메탈로프로테이나제 MMP13 발현이 증가하고, II형 콜라겐 발현이 감소하여, 인간 연골 결함에서 관찰된 병리학적 변화와 일치한다. 이 방법론은 수행하기 쉽고 간단하며 부상 직후 육안적인 관찰이 가능합니다. 또한, 이 모델은 임상적 연골 결함을 성공적으로 모방할 수 있으므로 연골 결함의 병리학적 과정을 연구하고 해당 치료 약물을 개발하기 위한 플랫폼을 제공합니다.

서문

관절 연골은 연골 세포와 세포 외 기질¹로 구성된 고도로 분화되고 조밀 한 조직입니다. 관절 연골의 표층은 유리질 연골의 한 형태로, 표면이 매끄럽고 마찰이 적으며 강도와 탄성이 좋으며 기계적 응력 내성이 우수합니다². 세포외 기질은 콜라겐 프로테오글리칸과 물을 포함하며, 타입 II 콜라겐은 전체 콜라겐³의 약 90%를 차지하기 때문에 콜라겐의 주요 구조 성분이다. 연골 조직에는 혈관이나 신경이 존재하지 않기 때문에 손상 후 자가 복구 능력이 부족합니다⁴. 따라서 외상으로 인한 연골 결손은 항상 클리닉에서 다루기 힘든 관절 질환이었습니다. 또한, 이 관절 질환은 젊은이들을 공격하는 경향이 있으며 전 세계적으로 발병률이 증가하고 있습니다 ^5,6. 무릎 관절은 연골 결손의 가장 흔한 부위이며, 여기서 결손은 관절 통증, 관절 기능 장애 및 관절 연골 변성을 동반하여 결국 무릎 골관절염(kOA)^으로 이어집니다7. 무릎 관절의 연골 결손은 환자에게 경제적, 생리적 부담을 주고 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 미친다⁸. 이 질병은 임박한 해결책이 없는 중대하고 시급한 임상적 문제를 제기합니다. 현재 수술은 연골 결손 치료의 중심이지만 장기적인 결과는 여전히 만족스럽지 않다⁹.

임상적 연골 결손은 결국 kOA를 유발하고, 따라서, kOA 동물 모델은 연골 결손의 병리학적 연구 및 약물 개발에 통상적으로 사용된다. 동물모델의 확립은 연골 결손 복구의 병태생리학적 과정을 이해하는 데 중요하며, 이는 연골 재생 및 섬유연골과 유리질 연골 사이의 변화를 관찰하는 데 사용할 수 있다¹⁰. 그러나, 전방십자인대 절개술(ACLT), 내측 반월판의 불안정화(DMM), 난소절제술(OVX) 및 헐스(Hulth)와 같이 일반적으로 사용되는 kOA 동물 모델은 일반적으로 장기 모델링이 필요하고 병리학적 및 통증 평가만 허용하므로 약물 개발의 효율성에 한계가 있다¹¹. 수술 모델 외에도 모노요오드아세테이트(monoiodoacetate, MIA) 및 파파인 주사와 같은 화학적 모델도 연골 결손을 초래하지만, 결손의 정도를 잘 관리할 수 없고, 임상 현실과는 거리가 멀다¹¹. 충돌(Collision)은 큰 동물의 연골 결손을 모델링하는 또 다른 접근법이지만, 이 방법은 특정 기구의 사용에 따라 달라지며 거의 적용되지 않는다¹².

요약하면, 기존의 kOA 모델은 연골 결손의 병인을 연구하거나 신약을 개발하는 데 이상적이지 않으며, 연골 결손의 특이적이고 표준화된 모델이 필요합니다. 이 연구는 쥐의 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫어 전층 연골 결손(FTCD) 모델을 확립했습니다. 모델 평가를 위해 육안 관찰, 통증 행동 테스트 및 조직병리학적 분석을 수행했습니다. kOA의 다른 동물 모델과 달리 이 모델은 쥐의 일반적인 상태에 거의 영향을 미치지 않습니다. 이 모델링 접근법은 접근 가능하고 잘 관리 할 수 있으며 연골 결함에서 kOA로의 진행에 대한 이해와 효과적인 치료법 개발을 지원합니다. 이 모델은 또한 골관절염 전 관절의 결함을 치유하여 kOA를 예방하는 치료법을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

동물 실험은 실험실 동물의 사용 및 관리에 관한 중국 법률을 준수하는 절강 중의과 대학의 의료 표준 및 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 본 연구에서는 체중 150-180g의 6주령 수컷 Sprague-Dawley(SD) 랫트를 사용했습니다. 동물을 상업적 공급원으로부터 입수하였다 ( 재료 표 참조).

1. 랫트의 전층 연골 결손 모델 구축

1. 새로운 환경에 1주일 동안 순응한 후 쥐를 무작위로 균등하게 두 그룹(n = 8마리/그룹)으로 나눕니다. 가짜 그룹의 쥐는 가짜 수술을 받고 모델 그룹의 쥐는 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫는 실험적 수술을 받게 됩니다.
   알림: 각 케이지는 쥐의 발가락을 보호하기 위해 멸균된 옥수수 속대 패딩( 재료 표 참조)으로 덮어야 합니다.
2. 펜토바르비탈 나트륨(40mg/kg)의 복강내 주사(ip)로 쥐를 마취합니다. 그런 다음 쥐의 발가락을 부드럽게 눌러 적절한 마취를 확인합니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 쥐의 눈에 수의사 연고를 사용하십시오.
   참고: 동물 수술은 오토클레이브 수술 기구를 사용하여 전용 수술실에서 수행해야 합니다. 작업자는 수술 중에 깨끗한 실험실 코트, 안면 마스크, 머리 덮개 및 멸균 장갑을 착용해야 합니다. 수술 부위에 멸균 패드를 놓고 사용하기 전에 모든 장비를 멸균하십시오. 절차 전반에 걸쳐 열 지원을 제공합니다.
3. 쥐를 앙와위 자세로 수술대에 놓고 좌우 뒷다리를 면도하고 수술 용 비누로 무릎 관절 부위를 닦은 다음 멸균 상태에서 방부제 포비돈 요오드 용액과 알코올을 세 번 번갈아 가며 닦습니다. 쥐 위에 멸균 드레이프를 놓고 소독된 무릎 관절만 노출시킵니다.
4. 쥐 무릎관절 중앙에 메스날(11번)로 위에서 아래로 1cm 절개를 하고, 표재성 절개 후 슬개골 내측 가장자리를 따라 관절낭과 대퇴사두근 힘줄을 자른다.
   참고: 대퇴사두근 힘줄은 무릎 관절¹³의 굴곡 동안 슬개골과 대퇴골과에 부착됩니다. 관절낭에서 볼 수 있는 홈은 대퇴골 활차 홈이고 원위 대퇴골 과두는 내측 및 외측 과두를 형성합니다.
5. 슬개골을 바깥쪽으로 돌리고 경골과 비골을 90° 각도로 구부려 대퇴골 과두의 활차가 완전히 노출되도록 합니다. 직경 1.6mm의 원형 드릴 비트( 재료 표 참조)를 4,000rpm에서 10초 동안 연골 표면에 수직으로 사용하여 깊이 0.1mm의 대퇴골 활차 홈에 하나의 전층 연골 결함을 만듭니다.
   알림: 드릴링 절차 중 주변 뼈 조직에 대한 열 외상을 최소화하기 위해 식염수를 간헐적으로 사용하십시오.
6. 0.9% 생리식염수에 적신 면봉으로 수술 부위를 닦고, 슬개골을 교체하고, 무릎을 신전 위치에 유지하고, 비흡수성 4-0 봉합사로 절개 부위를 층별로 봉합합니다( 재료 표 참조).
   1. 흉골 누운 상태로 가열 패드에 동물을 놓고 깨어날 때까지 모니터링 한 다음 새장으로 되돌립니다. 통증 완화를 위해 수술 후 8시간마다 3회 부프레노르핀(0.05mg/kg)을 피하 주사합니다.
7. 섹션 2에 설명된 대로 수술 후 3일, 10일 및 17일에 모든 쥐의 통증 관련 행동을 테스트합니다.

2. 기계적 인출 임계값(MWT)

참고: 쥐의 양측 후발바닥의 MWT는 고전적인 von Frey 필라멘트 통증 측정 방법¹⁴에 의해 측정되었습니다.

1. 철망 플랫폼 ( 재료 표 참조)의 단일 플라스틱 챔버 (17cm x 11cm x 13cm)에 쥐를 놓고 철망 받침대를 테이블 위 50cm에 놓습니다. 적응 30분 후 MWT를 측정합니다.
2. 폰 프레이 필라멘트 ( 재료 표 참조)를 각 쥐의 뒷발의 발바닥 표면에 수직으로 누르고 뒷발 중앙의 가장 두꺼운 부분을 피하면서 약 2 초 동안 브러시를 구부립니다.
3. 긍정적인 반응(발 철수 또는 발 핥기)이 발생할 때까지 자극 가중치를 가장 낮은 4g에서 점차적으로 늘립니다.
   알림: 각 자극 사이의 간격은 1분 이상이어야 합니다. MWT는 5가지 자극에서 3가지 긍정적인 반응으로 정의됩니다. 자극 가중치를 그램 단위로 기록합니다.
4. 기록된 최소 자극 가중치(그램)에 따라 가짜 및 모델 그룹의 평균값을 계산합니다.

3. 조직병리학적 및 면역조직화학적 분석

1. 수술 후 17일과 56일에 40mg/kg 펜토바르비탈 나트륨(i.p.)으로 쥐를 마취시키고 심장에서 혈액을 빼내어 모든 쥐를 희생시킵니다. 대퇴골 중간과 경골 중앙의 뼈를 절단하여 무릎을 분리하고 주변 근육 조직을 해부합니다. 조직 학적 분석을 위해 무릎 관절을 제거하십시오.
2. 무릎 관절을 실온에서 48시간 동안 10% 파라포름알데히드 용액 20mL에 고정한 다음, 4°C에서 8주 동안 오비탈 쉐이커에서 10% EDTA 용액 20mL로 석회질을 제거합니다. EDTA 솔루션을 매일 교체하십시오.
3. 임베딩 상자의 크기에 맞게 무릎 관절을 다듬습니다. 탈수된 무릎 관절을 100% 파라핀¹⁵에 삽입합니다.
4. 파라핀이 내장된 무릎 관절을 마이크로톰 홀더에 놓고 각도를 조정한 다음 표면이 평평해질 때까지 칼날로 파라핀 샘플을 다듬습니다.
5. 파라핀 슬라이스의 두께를 3 μm로 설정하고, 슬라이스를 40°C의 수조에서 평탄화시킨다.
6. 슬라이스를 유리 슬라이드에 붙이고 건조될 때까지 45°C 베이킹 기계( 재료 표 참조)에 넣고 실온에서 보관합니다.
7. 탈랍 및 재수화: 슬라이스를 60°C의 오븐에서 4시간 동안 탈왁스한 다음 슬라이스를 100% 자일렌(3회), 100% 에탄올(2회), 95% 에탄올, 80% 에탄올 및 75% 에탄올에 각각 5분 동안 연속적으로 넣습니다.
8. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색
   1. 왁스를 제거하고 수분을 보충한 다음 이중 증류수로 2분 동안 씻습니다.
   2. 0.5% 헤마톡실린( 재료 표 참조)으로 슬라이스를 3분 동안 염색하고 슬라이스 표면에 헤마톡실린 잔류물이 없을 때까지 이중 증류수로 슬라이스를 세척합니다.
   3. 슬라이스를 1 % 염산 알코올에 3 초 동안 담그고 슬라이스를 이중 증류수로 2 분 동안 씻으십시오.
   4. 슬라이스를 1 % 암모니아수에 10 초 동안 담그고 슬라이스를 이중 증류수로 2 분 동안 씻으십시오.
   5. 슬라이스를 에오신( 재료 표 참조)으로 1분 동안 염색하고 슬라이스 표면에 에오신 잔류물이 없을 때까지 이중 증류수로 슬라이스를 씻습니다.
   6. 슬라이스를 95% 에탄올, 100% 에탄올, 100% 자일렌(3회)에 매번 1분 동안 연속적으로 담급니다.
   7. 각 조각에 중성 수지 한 방울( 재료 표 참조)을 추가하고 커버슬립으로 밀봉합니다.
9. Safranin O/Fast Freen(SO) 염색
   1. 왁스를 제거하고 수분을 보충한 다음 이중 증류수로 2분 동안 씻습니다.
   2. 0.05% Fast Green( 재료 표 참조)으로 3분 동안 슬라이스를 염색하고 슬라이스 표면에 Fast Green 잔류물이 없을 때까지 이중 증류수로 슬라이스를 씻습니다.
   3. 슬라이스를 1 % 아세트산 용액에 10 초 동안 담그고 슬라이스를 이중 증류수로 2 분 동안 씻으십시오.
   4. 슬라이스를 2.5% SO( 재료 표 참조)로 2분 동안 염색한 다음 슬라이스 표면에 SO 잔류물이 없을 때까지 이중 증류수로 슬라이스를 세척합니다.
   5. 슬라이스를 95% 에탄올, 100% 에탄올, 100% 자일렌(3회)에 매번 1분 동안 연속적으로 담급니다.
   6. 각 조각에 중성 수지 한 방울을 추가하고 커버 슬립으로 밀봉하십시오.
10. 톨루이딘 블루(TB) 염색
    1. 왁스를 제거하고 수분을 보충한 다음 이중 증류수로 2분 동안 씻습니다.
    2. 슬라이스를 1% TB 용액( 재료 표 참조)에 2분 동안 담그고 슬라이스 표면에 톨루이딘 블루 잔류물이 없을 때까지 이중 증류수로 슬라이스를 세척합니다.
    3. 슬라이스를 95% 에탄올, 100% 에탄올, 100% 자일렌(3회)에 매번 1분 동안 연속적으로 담급니다.
    4. 각 조각에 중성 수지 한 방울을 추가하고 커버 슬립으로 밀봉하십시오.
11. Masson 염색
    1. 왁스를 제거하고 수분을 보충한 다음 이중 증류수로 2분 동안 씻습니다.
    2. Bouin 용액( 재료 표 참조)을 슬라이스에 적가하고 37°C에서 2시간 동안 염색한 다음 슬라이스 표면의 노란색이 사라질 때까지 이중 증류수로 세척합니다.
    3. 슬라이스를 셀레스타이트 블루( 재료 표 참조)로 3분 동안 염색하고 슬라이스 표면에 셀레스타이트 블루 잔류물이 없을 때까지 이중 증류수로 슬라이스를 씻습니다.
    4. 3분 동안 헤마톡실린으로 슬라이스를 염색하고 슬라이스 표면에 헤마톡실린 잔류물이 없을 때까지 이중 증류수로 슬라이스를 세척합니다.
    5. 슬라이스를 산성 에탄올에 5 초 동안 담그고 슬라이스를 이중 증류수로 2 분 동안 씻으십시오.
    6. Ponceau fuchsin( 재료 표 참조)으로 슬라이스를 10분 동안 염색하고 슬라이스 표면에 Ponceau 푹신 잔류물이 없을 때까지 이중 증류수로 슬라이스를 씻습니다.
    7. 슬라이스를 포스 포 몰리브덴산 ( 재료 표 참조)에 10 분 동안 담근 다음 5 분 동안 TB 용액에 담그고 슬라이스 표면에 TB 잔류 물이 없을 때까지 이중 증류수로 슬라이스를 씻으십시오.
    8. 슬라이스를 약산성 용액에 2 분 동안 담그고 슬라이스를 이중 증류수로 2 분 동안 씻으십시오.
    9. 슬라이스를 95% 에탄올, 100% 에탄올, 100% 자일렌(3회)에 매번 1분 동안 연속적으로 담그십시오.
    10. 각 조각에 중성 수지 한 방울을 추가하고 커버 슬립으로 밀봉하십시오.
12. 이중 맹검 설정에서 현미경으로 모든 슬라이스를 관찰하여 Mankin의 스코어링 시스템¹⁶에 따라 관절 연골 변성의 정도를 결정합니다.
13. 면역조직화학
    1. 슬라이스를 정기적으로 탈랍 및 재수화하고 PBS로 슬라이스를 2분 동안 세척합니다.
    2. 슬라이스를 시트르산 나트륨 용액에 담그고 슬라이스를 60°C의 오븐에 4시간 동안 넣어 항원을 복구합니다. PBS로 슬라이스를 각각 3분 동안 세 번 씻습니다.
    3. 슬라이스를 0.3% 트리톤 X-100 용액에 10분 동안 담그고 매번 3분 동안 PBS로 슬라이스를 두 번 세척합니다.
    4. 메탄올에 3%_H2O2용액을 첨가하여 30분 동안 내인성 퍼옥시다아제 활성을 차단한다. 슬라이스를 PBS로 매번 3분 동안 두 번 씻습니다.
    5. 절편을 실온에서 30분 동안 PBS 중의 5% 염소 혈청과 함께 인큐베이션하여 임의의 비특이적 결합을 차단한다. 슬라이스를 PBS로 매번 3분 동안 두 번 씻습니다.
    6. PBS 희석된 1차 항체(anti-col1, 1:50; anti-col3, 1:50; anti-col2, 1:100; and anti-MMP13, 1:100; the Table of Materials)를 각 슬라이스에 첨가하고, 4°C에서 밤새 배양한다. 슬라이스를 PBS로 매번 3분 동안 두 번 씻습니다.
    7. 각 슬라이스를 PBS 희석(1:100) 2차 항체(염소 항토끼 또는 염소 항-마우스, 재료 표 참조) 100μL와 함께 실온에서 20분 동안 배양합니다. 슬라이스를 PBS로 매번 3분 동안 두 번 씻습니다.
    8. 100 μL의 3, 3'-diaminobenzidine (DAB, 재료 표 참조) 작업 용액을 각 슬라이스에 추가합니다.
    9. 현미경으로 갈색의 출현 시간을 관찰하고 기록합니다. 발색 반응은 에피토프 부위를 갈색으로 만듭니다¹⁷. 나머지 샘플을 동일한 기록된 반응 시간으로 처리합니다.
    10. 조각이 갈색으로 변한 후 매번 이중 증류수로 3분 동안 두 번 씻습니다.
    11. 슬라이스를 헤마톡실린으로 1분 동안 다시 염색하고 이중 증류수로 슬라이스를 2분 동안 세척합니다.
    12. 슬라이스를 염산에 3 초 동안 담그고 슬라이스를 이중 증류수로 2 분 동안 씻으십시오.
    13. 슬라이스를 1 % 암모니아수에 10 초 동안 담그고 슬라이스를 이중 증류수로 2 분 동안 씻으십시오.
    14. 슬라이스를 95% 에탄올, 100% 에탄올, 100% 자일렌(3회)에 매번 1분 동안 연속적으로 담급니다.
    15. 각 조각에 중성 수지 한 방울을 추가하고 커버 슬립으로 밀봉하십시오.

결과

본 연구에서는 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫고 후속 통증 거동과 조직병리학적 변화를 감지하여 FTCD의 쥐 모델을 확립하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 모델링 3일 후, 모조군에 비해 모델군에서 랫트의 MWT가 현저히 감소하여 FTCD에 의한 통각과민을 시사한다. 모델링 후 17일째에, 모델 그룹에 있는 쥐의 기계적 금단 역치는 낮은 수준으로 유지되었고, 이는 통증 감작이 적어도...

토론

이 연구는 쥐의 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫어 임상적 연골 결함을 모방하는 동물 모델을 설명합니다(보충 그림 1). 연골 손상 후, 말초 통각 수용체의 흥분성 또는 반응성이 향상되고, 이는 통증 역치의 감소와 자극에 대한 반응성의 향상을 가져올 수 있다¹⁸. 전임상 연구에서, 다양한 동물 종의 연골 결함 모델링은 항상 통증을 유발했다¹⁹

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3, 3 '-diaminobenzidine	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	ZLI-9019	The dye for IHC staining
Anti-Collagen III antibody	Novus	NB600-594	Primary antibody for IHC
Anti-Collagen II antibody	Abcam (UK)	34712	Primary antibody for IHC
Anti-Collagen I antibody	Novus	NB600-408	Primary antibody for IHC
Bouin solution	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Celestite blue	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Corncob paddings	Xiaohe Technology Co., Ltd		Bedding for animal
Eosin	Sigma-Aldrich	861006	The dye for HE staining
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	The dye for SO staining
Goat anti-mouse antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9002	Secondary antibody for IHC
Goat anti-rabbit antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9001	Secondary antibody for IHC
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3163	The dye for HE staining
Masson	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Microdrill	Rwd Life Science Co., Ltd	78001	Equipment for surgery
MMP13	Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)	69926	Primary antibody for IHC
Modular tissue embedding center	Thermo Fisher Scientific (USA)	EC 350	Produce paraffin blocks
Neutral resin	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	ZLI-9555	Seal for IHC
Nonabsorbable suture	Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd.	4-0	Equipment for surgery
Pentobarbital sodium	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	WBBTN5G	Anesthetized animal
phosphomolybdic acid	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Ponceau fuchsin	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Rotary and Sliding Microtomes	Thermo Fisher Scientific (USA)	HM325	Precise paraffin sections
Safranin-O	Sigma-Aldrich	S2255	The dye for SO staining
Scalpel blade	Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd.	11	Equipment for surgery
Sodium citrate solution (20x)	Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd.	HK1222	Antigen retrieval for IHC
Sprague Dawley (SD) rats	Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd.	SD	Experimental animal
Tissue-Tek VIP 5 Jr	Sakura (Japan)		Vacuum Infiltration Processor
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89640	The dye for TB staining
Von Frey filament	UGO Basile (Italy)	37450-275	Equipment for MWT assay
Wire mesh platform	Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd.		Equipment for MWT assay