Desenvolvimento e Avaliação de um Modelo de Defeitos Cartilaginosos em Rato

Resumo

Este protocolo estabelece um modelo de defeitos de cartilagem de espessura total (FTCD) através da perfuração de orifícios no sulco troclear femoral de ratos e mensuração do comportamento da dor e alterações histopatológicas subsequentes.

Resumo

Defeitos cartilaginosos da articulação do joelho causados por trauma são uma lesão comum na articulação esportiva na clínica, e esses defeitos resultam em dor articular, movimento prejudicado e, eventualmente, osteoartrite do joelho (kOA). No entanto, há pouco tratamento efetivo para defeitos cartilaginosos ou mesmo kOA. Modelos animais são importantes para o desenvolvimento de fármacos terapêuticos, mas os modelos existentes para defeitos cartilaginosos são insatisfatórios. Este trabalho estabeleceu um modelo de defeitos de cartilagem de espessura total (FTCD) através da perfuração de furos no sulco troclear femoral de ratos, e o comportamento da dor e as alterações histopatológicas subsequentes foram usados como experimentos de leitura. Após a cirurgia, o limiar de retirada mecânica foi diminuído, os condrócitos no local lesado foram perdidos, a expressão de MMP13 das metaloproteinases da matriz foi aumentada e a expressão de colágeno tipo II diminuiu, consistente com as alterações patológicas observadas nos defeitos da cartilagem humana. Essa metodologia é de fácil e simples execução e possibilita a observação macroscópica imediatamente após a lesão. Além disso, este modelo pode mimetizar com sucesso defeitos clínicos da cartilagem, fornecendo uma plataforma para o estudo do processo patológico dos defeitos cartilaginosos e desenvolvimento de drogas terapêuticas correspondentes.

Introdução

A cartilagem articular é um tecido altamente diferenciado e denso, constituído por condrócitos e matriz^{extracelular1}. A camada superficial da cartilagem articular é uma forma de cartilagem hialina, que apresenta superfície lisa, baixo atrito, boa resistência e elasticidade e excelente tolerância ao estresse^mecânico2. A matriz extracelular é composta por proteoglicanos e água, sendo o colágeno tipo II o principal componente estrutural do colágeno, sendo responsável por cerca de 90% do colágeno total3^. Como não existem vasos sanguíneos ou nervos no tecido cartilaginoso, este não tem a capacidade de auto-reparação após a lesão⁴. Portanto, os defeitos cartilaginosos causados por trauma sempre foram uma doença articular intratável na clínica; Além disso, essa doença articular tende a atingir os jovens, e a incidência mundial está^{aumentando5,6}. A articulação do joelho é o local mais comum de defeitos cartilaginosos, e os defeitos são acompanhados por dor articular, disfunção articular e degeneração da cartilagem articular, eventualmente levando à osteoartrite do joelho (kOA)⁷. Os defeitos cartilaginosos da articulação do joelho acarretam ônus econômico e fisiológico aos pacientes e afetam seriamente a qualidade de vida dos^pacientes8. Esta doença representa um grande e urgente desafio clínico sem soluções iminentes. Atualmente, a cirurgia é a base do tratamento dos defeitos da cartilagem, mas seu resultado a longo prazo permanece^{insatisfatório9}.

Defeitos clínicos da cartilagem eventualmente levam à kOA e, portanto, modelos animais de kOA são comumente usados para o estudo patológico de defeitos cartilaginosos e desenvolvimento de drogas. O estabelecimento de modelos animais é importante para o entendimento do processo fisiopatológico do reparo do defeito cartilaginoso, que pode ser utilizado para observar a regeneração cartilaginosa e a alteração entre fibrocartilagem e cartilagem^hialina10. No entanto, modelos animais comumente utilizados, como modelos cirúrgicos de transecção do ligamento cruzado anterior (LTCA), desestabilização do menisco medial (DMM), ooforectomia (OVX) e Hulth, geralmente necessitam de modelagem em longo prazo e permitem apenas avaliações patológicas e da dor, o que impõe limitações à eficiência do desenvolvimento de fármacos¹¹. Além dos modelos cirúrgicos, modelos químicos, como monoiodoacetato (MIA) e injeção de papaína, também resultam em defeitos cartilaginosos, mas o grau do defeito não pode ser bem manejado e as condições estão distantes da realidade clínica¹¹. A colisão é outra abordagem para modelar defeitos de cartilagem em animais maiores, mas esse método depende do uso de instrumentos específicos e raramente é aplicado¹².

Em resumo, os modelos de kOA existentes não são ideais para estudar a patogênese de defeitos cartilaginosos ou desenvolver novas drogas, sendo necessário um modelo específico e padronizado para defeitos cartilaginosos. Este estudo estabeleceu um modelo de defeitos de cartilagem de espessura total (FTCD) através da perfuração de furos no sulco troclear femoral em ratos. Observação macroscópica, testes de comportamento da dor e análise histopatológica foram realizados para avaliação do modelo. Ao contrário de outros modelos animais de kOA, este modelo tem pouco efeito sobre o estado geral dos ratos. Essa abordagem de modelagem é acessível, pode ser bem gerenciada e apoia a compreensão da progressão de defeitos cartilaginosos para kOA e o desenvolvimento de terapêuticas eficazes. Esse modelo também pode ser usado para testar terapias que previnem a kOA por meio da cicatrização de defeitos em articulações pré-osteoartríticas.

Protocolo

Os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética e Padrões Médicos da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Zhejiang, que está em conformidade com a legislação da China sobre o uso e cuidados com animais de laboratório. No presente estudo, ratos Sprague-Dawley (SD) machos com 6 semanas de idade pesando 150-180 g foram utilizados. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Estabelecimento de um modelo de defeitos cartilaginosos de espessura total em ratos

1. Após 1 semana de aclimatização ao novo ambiente, dividir os ratos de forma aleatória e igualitária em dois grupos (n = 8 ratos/grupo). Os ratos do grupo sham terão a cirurgia simulada, enquanto os ratos do grupo modelo terão a cirurgia experimental envolvendo a perfuração de furos no sulco troclear femoral.
   NOTA: Cada gaiola deve ser coberta com espiga de milho estéril (consulte a Tabela de Materiais) para proteger os dedos dos ratos.
2. Anestesiar os ratos por injeção intraperitoneal (i.p.) de pentobarbital sódico (40 mg/kg). Em seguida, pressione suavemente os dedos dos pés dos ratos para confirmar a anestesia adequada. Use uma pomada veterinária nos olhos dos ratos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
   NOTA: A cirurgia do animal precisa ser realizada em uma sala cirúrgica dedicada usando instrumentos cirúrgicos autoclavados. Os operadores devem usar jalecos de laboratório limpos, máscaras faciais, capas para a cabeça e luvas estéreis durante a cirurgia. Coloque absorventes estéreis sobre a área cirúrgica e esterilize todos os equipamentos antes do uso. Fornecer suporte térmico durante todo o procedimento.
3. Coloque o rato na mesa cirúrgica em decúbito dorsal, raspe os membros posteriores esquerdo e direito e limpe a área articular do joelho com sabão cirúrgico, seguido de solução antisséptica antisséptica de iodopovidona e álcool três vezes em condições estéreis. Coloque um pano estéril sobre o rato e exponha apenas a articulação do joelho desinfetada.
4. Faça uma incisão de 1 cm com uma lâmina de bisturi (número 11) no meio da articulação do joelho do rato de cima para baixo e corte a cápsula articular e o tendão do quadríceps femoral ao longo da borda medial da patela após a dissecção superficial.
   NOTA: O tendão do quadríceps femoral está aderido à patela e ao côndilo femoral durante a flexão da articulação do^joelho13. O sulco visto na cápsula articular é o sulco troclear femoral, e o côndilo femoral distal forma os côndilos medial e lateral.
5. Vire a patela para fora e flexione a tíbia e a fíbula em um ângulo de 90° para expor totalmente a tróclea do côndilo femoral. Use uma broca circular de 1,6 mm de diâmetro (consulte a Tabela de Materiais) vertical à superfície da cartilagem a 4.000 rpm por 10 s para fazer um defeito de cartilagem de espessura total no sulco troclear femoral com uma profundidade de 0,1 mm.
   NOTA: Use soro fisiológico intermitentemente para minimizar o trauma térmico no tecido ósseo circundante durante o procedimento de perfuração.
6. Limpar o sítio cirúrgico com algodão embebido em soro fisiológico 0,9%, substituir a patela, manter o joelho em posição de extensão e suturar a incisão camada por camada com pontos inabsorvíveis 4-0 (ver Tabela de Materiais).
   1. Coloque os animais em almofadas térmicas com decúbito esternal, monitore-os até acordarem e, em seguida, devolva-os às gaiolas. Injetar buprenorfina (0,05 mg/kg) por via subcutânea a cada 8 h três vezes após a operação para alívio da dor.
7. Testar o comportamento relacionado à dor de todos os ratos aos 3 dias, 10 dias e 17 dias após a cirurgia, conforme descrito na seção 2.

2. Limiar de retirada mecânica (TMP)

NOTA: O TCM da plantar posterior bilateral de ratos foi mensurado pelo método clássico de mensuração da dor no filamento de von^Frey14.

1. Coloque o rato em uma única câmara plástica (17 cm x 11 cm x 13 cm) sobre uma plataforma de malha de arame (consulte a Tabela de Materiais) e coloque a base de malha de arame 50 cm acima de uma mesa. Medir o TCM após 30 min de adaptação.
2. Pressione o filamento de von Frey (veja a Tabela de Materiais) perpendicularmente na superfície plantar da pata traseira de cada rato e dobre a escova por cerca de 2 s, evitando a parte mais espessa do centro da pata traseira.
3. Aumentar gradualmente o peso do estímulo a partir dos 4 g mais baixos até que ocorra uma resposta positiva (retirada da pata ou lambida da pata).
   OBS: O intervalo entre cada estimulação deve ser superior a 1 min. O TCM é definido como três respostas positivas em cinco estimulações; Registre o peso do estímulo em gramas.
4. Calcular os valores médios para os grupos sham e modelo de acordo com o peso mínimo do estímulo registrado em gramas.

3. Análise histopatológica e imuno-histoquímica

1. Aos 17 e 56 dias após a cirurgia, anestesiar os ratos com um pentobarbital sódico (i.p.) de 40 mg/kg e sacrificar todos os ratos retirando sangue do coração. Isolar os joelhos cortando o osso no fêmur médio e na tíbia média e dissecar o tecido muscular circundante. Remover as articulações do joelho para análise histológica.
2. Fixar as articulações do joelho em 20 mL de solução de paraformaldeído a 10% por 48 h à temperatura ambiente e, em seguida, descalcificá-las com 20 mL de solução de EDTA a 10% em um agitador orbital por 8 semanas a 4 °C. Troque a solução EDTA todos os dias.
3. Corte a articulação do joelho para se ajustar ao tamanho da caixa de incorporação. Incorporar as articulações desidratadas do joelho em parafina a 100%¹⁵.
4. Coloque as articulações do joelho embutidas em parafina no suporte de um micrótomo, ajuste o ângulo e corte a amostra de parafina com uma lâmina até que a superfície fique plana.
5. Ajustar a espessura das fatias de parafina para 3 μm e achatar as fatias em banho-maria a 40 °C.
6. Cole as fatias em lâminas de vidro, coloque-as numa máquina de assar a 45 °C (ver Tabela de Materiais) até ficarem secas e guarde-as à temperatura ambiente.
7. Desparafinação e reidratação: Desencefinar as fatias em forno a 60 °C por 4 h e, em seguida, colocar as fatias sucessivamente em xileno 100% (três vezes), etanol 100% (duas vezes), etanol 95%, etanol 80% e etanol 75% por 5 min cada vez.
8. Coloração pela hematoxilina e eosina (H&E)
   1. Desparafina, reidratei e lave as fatias com água bidestilada por 2 min.
   2. Manchar as fatias com hematoxilina a 0,5% (ver Tabela de Materiais) por 3 min e lavar as fatias com água bidestilada até não haver resíduo de hematoxilina nas superfícies de corte.
   3. Mergulhe as fatias em álcool de ácido clorídrico a 1% por 3 s e lave as fatias com água bidestilada por 2 min.
   4. Mergulhe as fatias em água de amônia a 1% por 10 s e lave as fatias com água bidestilada por 2 min.
   5. Manchar as fatias com eosina (ver Tabela de Materiais) por 1 min e lavá-las com água bidestilada até que não haja resíduo de eosina nas superfícies de corte.
   6. Imergir as fatias em etanol 95%, etanol 100% e xileno 100% (três vezes) sucessivamente por 1 min de cada vez.
   7. Adicione uma gota de resina neutra (consulte Tabela de Materiais) a cada fatia e sela-a com uma lamínula.
9. Coloração Safranin O/Fast Freen (SO)
   1. Desparafina, reidratei e lave as fatias com água bidestilada por 2 min.
   2. Manchar as fatias com 0,05% de Fast Green (veja a Tabela de Materiais) por 3 min, e lavar as fatias com água bidestilada até que não haja resíduo Fast Green na superfície das fatias.
   3. Imergir as fatias em solução de ácido acético a 1% por 10 s e lavar as fatias com água bidestilada por 2 min.
   4. Manchar as fatias com SO a 2,5% (ver Tabela de Materiais) por 2 min e, em seguida, lavar as fatias com água bidestilada até que não haja resíduo de SO nas superfícies de corte.
   5. Imergir as fatias em etanol 95%, etanol 100% e xileno 100% (três vezes) sucessivamente por 1 min de cada vez.
   6. Adicione uma gota de resina neutra a cada fatia e sele com uma lamínula.
10. Coloração azul de toluidina (TB)
    1. Desparafina, reidratei e lave as fatias com água bidestilada por 2 min.
    2. Mergulhe as fatias em solução de TB a 1% (consulte a Tabela de Materiais) por 2 minutos e lave as fatias com água bidestilada até que não haja resíduo de azul de toluidina na superfície das fatias.
    3. Imergir as fatias em etanol 95%, etanol 100% e xileno 100% (três vezes) sucessivamente por 1 min de cada vez.
    4. Adicione uma gota de resina neutra a cada fatia e sele com uma lamínula.
11. Coloração de Masson
    1. Desparafina, reidratei e lave as fatias com água bidestilada por 2 min.
    2. Adicione a solução de Bouin (ver Tabela de Materiais) gota a gota às fatias, manche-as a 37 °C durante 2 h e lave-as com água bidestilada até desaparecer a cor amarela na superfície das fatias.
    3. Manchar as fatias com azul celestita (ver Tabela de Materiais) por 3 min, e lavar as fatias com água bidestilada até que não haja resíduo de azul celestita nas superfícies das fatias.
    4. Manchar as fatias com hematoxilina por 3 min e lavá-las com água bidestilada até que não haja resíduo de hematoxilina nas superfícies de corte.
    5. Mergulhe as fatias em etanol ácido por 5 s e lave as fatias com água bidestilada por 2 min.
    6. Manchar as fatias com Ponceau fuchsin (ver Tabela de Materiais) por 10 min, e lavar as fatias com água bidestilada até que não haja resíduo de Ponceau fuchsin nas superfícies de corte.
    7. Mergulhe as fatias em ácido fosfomolíbdico (consulte a Tabela de Materiais) por 10 min, depois mergulhe-as em solução TB por 5 min e lave as fatias com água bidestilada até que não haja resíduo de TB na superfície das fatias.
    8. Mergulhe as fatias em uma solução de ácido fraco por 2 minutos e lave as fatias com água bidestilada por 2 min.
    9. Imergir as fatias em etanol 95%, etanol 100% e xileno 100% (três vezes) sucessivamente por 1 min de cada vez.
    10. Adicione uma gota de resina neutra a cada fatia e sele com uma lamínula.
12. Observar todos os cortes ao microscópio em ambiente duplo-cego para determinar o grau de degeneração da cartilagem articular de acordo com o sistema de escore de^Mankin16.
13. Imuno-histoquímica
    1. Desencefinar e reidratar as fatias rotineiramente, e lavá-las com PBS por 2 min.
    2. Imergir as fatias em solução de citrato de sódio e colocar as fatias em estufa a 60 °C durante 4 h para reparar o antigénio. Lave as fatias com PBS três vezes por 3 min cada.
    3. Imergir as fatias em uma solução de Triton X-100 a 0,3% por 10 min e lavá-las duas vezes com PBS por 3 min de cada vez.
    4. Bloquear a actividade da peroxidase endógena adicionando uma solução de 3%H 2 O₂ em metanol à temperatura ambiente durante 30 minutos. Lave as fatias duas vezes com PBS por 3 min de cada vez.
    5. Incubar os cortes com 5% de soro de cabra em PBS por 30 min à temperatura ambiente para bloquear qualquer ligação inespecífica. Lave as fatias duas vezes com PBS por 3 min de cada vez.
    6. Adicionar 100 μL de anticorpos primários diluídos em PBS (anti-col1, 1:50; anti-col3, 1:50; anti-col2, 1:100; e anti-MMP13, 1:100; ver Tabela de Materiais) a cada fatia e incubá-los durante a noite a 4 °C. Lave as fatias duas vezes com PBS por 3 min de cada vez.
    7. Incubar cada fatia com 100 μL de anticorpo secundário diluído em PBS (1:100) (cabra anticoelho ou cabra antirato, ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente durante 20 minutos. Lave as fatias duas vezes com PBS por 3 min de cada vez.
    8. Adicionar 100 μL de solução de trabalho de 3,3 '-diaminobenzidina (DAB, ver Tabela de Materiais) a cada fatia.
    9. Observe e registre o tempo de aparecimento de uma cor marrom sob um microscópio; A reação cromogênica torna os sítios dos epítopos marrons¹⁷. Tratar o restante das amostras com o mesmo tempo de reação registrado.
    10. Depois que as fatias ficarem douradas, lave as fatias duas vezes com água bidestilada por 3 min de cada vez.
    11. Re-manchar as fatias com hematoxilina por 1 min e lavar as fatias com água bidestilada por 2 min.
    12. Mergulhe as fatias em ácido clorídrico por 3 s e lave as fatias com água bidestilada por 2 min.
    13. Mergulhe as fatias em água de amônia a 1% por 10 s e lave as fatias com água bidestilada por 2 min.
    14. Imergir as fatias em etanol 95%, etanol 100% e xileno 100% (três vezes) sucessivamente por 1 min de cada vez.
    15. Adicione uma gota de resina neutra a cada fatia e sele com uma lamínula.

Resultados

Neste trabalho, um modelo de FTCD em ratos foi estabelecido através da perfuração de furos no sulco troclear femoral e detecção do comportamento da dor e alterações histopatológicas subsequentes. Como mostrado na Figura 1, 3 dias após a modelagem, em comparação com o grupo sham, o TCM dos ratos do grupo modelo foi significativamente reduzido, sugerindo hiperalgesia causada pela FTCD. Aos 17 dias após a modelagem, o limiar de retirada mecânica dos ratos do grupo modelo permaneceu...

Discussão

Este estudo descreve um modelo animal para mimetizar defeitos clínicos da cartilagem por meio de furos no sulco troclear femoral de ratos (Figura 1 Suplementar). Após a lesão da cartilagem, a excitabilidade ou responsividade dos nociceptores periféricos é aumentada, o que pode resultar em diminuição do limiar de dor e aumento da responsividade à estimulação¹⁸. Em estudos pré-clínicos, a modelagem de defeitos cartilaginosos em diferentes espécies de an...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3, 3 '-diaminobenzidine	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	ZLI-9019	The dye for IHC staining
Anti-Collagen III antibody	Novus	NB600-594	Primary antibody for IHC
Anti-Collagen II antibody	Abcam (UK)	34712	Primary antibody for IHC
Anti-Collagen I antibody	Novus	NB600-408	Primary antibody for IHC
Bouin solution	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Celestite blue	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Corncob paddings	Xiaohe Technology Co., Ltd		Bedding for animal
Eosin	Sigma-Aldrich	861006	The dye for HE staining
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	The dye for SO staining
Goat anti-mouse antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9002	Secondary antibody for IHC
Goat anti-rabbit antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9001	Secondary antibody for IHC
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3163	The dye for HE staining
Masson	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Microdrill	Rwd Life Science Co., Ltd	78001	Equipment for surgery
MMP13	Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)	69926	Primary antibody for IHC
Modular tissue embedding center	Thermo Fisher Scientific (USA)	EC 350	Produce paraffin blocks
Neutral resin	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	ZLI-9555	Seal for IHC
Nonabsorbable suture	Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd.	4-0	Equipment for surgery
Pentobarbital sodium	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	WBBTN5G	Anesthetized animal
phosphomolybdic acid	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Ponceau fuchsin	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Rotary and Sliding Microtomes	Thermo Fisher Scientific (USA)	HM325	Precise paraffin sections
Safranin-O	Sigma-Aldrich	S2255	The dye for SO staining
Scalpel blade	Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd.	11	Equipment for surgery
Sodium citrate solution (20x)	Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd.	HK1222	Antigen retrieval for IHC
Sprague Dawley (SD) rats	Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd.	SD	Experimental animal
Tissue-Tek VIP 5 Jr	Sakura (Japan)		Vacuum Infiltration Processor
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89640	The dye for TB staining
Von Frey filament	UGO Basile (Italy)	37450-275	Equipment for MWT assay
Wire mesh platform	Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd.		Equipment for MWT assay