Développement et évaluation d’un modèle de rats-de-cartilage de pleine épaisseur

Résumé

Ce protocole établit un modèle de défauts cartilagineux de pleine épaisseur (FTCD) en perçant des trous dans la rainure trochléaire fémorale de rats et en mesurant le comportement douloureux et les changements histopathologiques ultérieurs.

Résumé

Les défauts cartilagineux de l’articulation du genou causés par un traumatisme sont une blessure articulaire sportive courante en clinique, et ces défauts entraînent des douleurs articulaires, des troubles du mouvement et, éventuellement, de l’arthrose du genou (kOA). Cependant, il existe peu de traitement efficace pour les défauts du cartilage ou même le kOA. Les modèles animaux sont importants pour le développement de médicaments thérapeutiques, mais les modèles existants pour les défauts du cartilage ne sont pas satisfaisants. Ce travail a établi un modèle de défauts cartilagineux de pleine épaisseur (FTCD) en forant des trous dans la rainure trochléaire fémorale de rats, et le comportement de la douleur et les changements histopathologiques ultérieurs ont été utilisés comme expériences de lecture. Après la chirurgie, le seuil de retrait mécanique a été abaissé, les chondrocytes sur le site blessé ont été perdus, l’expression de la métalloprotéinase matricielle MMP13 a été augmentée et l’expression de collagène de type II a diminué, conformément aux changements pathologiques observés dans les défauts du cartilage humain. Cette méthodologie est facile et simple à réaliser et permet une observation globale immédiatement après la blessure. En outre, ce modèle peut imiter avec succès les défauts cartilagineux cliniques, fournissant ainsi une plate-forme pour étudier le processus pathologique des défauts du cartilage et développer des médicaments thérapeutiques correspondants.

Introduction

Le cartilage articulaire est un tissu hautement différencié et dense constitué de chondrocytes et de la matrice extracellulaire¹. La couche superficielle du cartilage articulaire est une forme de cartilage hyalin, qui a une surface lisse, un faible frottement, une bonne résistance et élasticité, et une excellente tolérance aux contraintes mécaniques². La matrice extracellulaire comprend du collagène protéoglycane et de l’eau, et le collagène de type II est le principal composant structurel du collagène, car il représente environ 90% du collagène^{total 3}. Comme aucun vaisseau sanguin ou nerf n’existe dans le tissu cartilagineux, il n’a pas la capacité de s’auto-réparer après une blessure⁴. Par conséquent, les défauts cartilagineux causés par un traumatisme ont toujours été une maladie articulaire réfractaire dans les cliniques; De plus, cette maladie articulaire a tendance à frapper les jeunes, et l’incidence mondiale est en hausse ^5,6. L’articulation du genou est le site le plus courant de défauts cartilagineux, et les défauts ici sont accompagnés de douleurs articulaires, de dysfonctionnements articulaires et de dégénérescence du cartilage articulaire, conduisant éventuellement à l’arthrose du genou (kOA)⁷. Les défauts cartilagineux de l’articulation du genou entraînent des charges économiques et physiologiques pour les patients et affectent gravement leur qualité de vie⁸. Cette maladie pose un défi clinique majeur et urgent sans solution imminente. Actuellement, la chirurgie est le pilier du traitement des défauts cartilagineux, mais ses résultats à long terme restent insatisfaisants⁹.

Les défauts cliniques du cartilage conduisent finalement à la kOA, et, par conséquent, les modèles animaux kOA sont couramment utilisés pour l’étude pathologique des défauts du cartilage et le développement de médicaments. L’établissement de modèles animaux est important pour comprendre le processus physiopathologique de réparation des défauts cartilagineux, qui peuvent être utilisés pour observer la régénération du cartilage et l’altération entre le fibrocartilage et le cartilage hyalin¹⁰. Cependant, les modèles animaux kOA couramment utilisés, tels que les modèles chirurgicaux de la transsection du ligament croisé antérieur (ACLT), de la déstabilisation du ménisque médial (DMM), de l’ovariectomie (OVX) et de Hulth, nécessitent généralement une modélisation à long terme et ne permettent que des évaluations pathologiques et douloureuses, ce qui limite l’efficacité du développement de médicaments¹¹. Outre les modèles chirurgicaux, les modèles chimiques, tels que le monoiodoacétate (MIA) et l’injection de papaïne, entraînent également des défauts du cartilage, mais le degré du défaut ne peut pas être bien géré et les conditions sont loin de la réalité clinique¹¹. La collision est une autre approche pour modéliser les défauts cartilagineux chez les grands animaux, mais cette méthode dépend de l’utilisation d’instruments spécifiques et est rarement appliquée¹².

En résumé, les modèles kOA existants ne sont pas idéaux pour étudier la pathogenèse des défauts du cartilage ou développer de nouveaux médicaments, et un modèle spécifique et standardisé pour les défauts du cartilage est nécessaire. Cette étude a établi un modèle de défauts cartilagineux de pleine épaisseur (FTCD) en forant des trous dans la rainure trochléaire fémorale chez le rat. Une observation globale, des tests de comportement douloureux et une analyse histopathologique ont été effectués pour l’évaluation du modèle. Contrairement à d’autres modèles animaux de kOA, ce modèle a peu d’effet sur l’état général des rats. Cette approche de modélisation est accessible, peut être bien gérée et soutient la compréhension de la progression des défauts du cartilage au kOA et le développement de thérapies efficaces. Ce modèle peut également être utilisé pour tester des thérapies qui préviennent le kOA en guérissant les défauts des articulations pré-arthrosiques.

Protocole

Les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité des normes médicales et de l’éthique de l’Université de médecine traditionnelle chinoise du Zhejiang, qui est conforme à la législation chinoise sur l’utilisation et les soins des animaux de laboratoire. Dans la présente étude, des rats Sprague-Dawley (SD) mâles âgés de 6 semaines pesant de 150 à 180 g ont été utilisés. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).

1. Etablissement d’un modèle de défauts cartilagineux de pleine épaisseur chez le rat

1. Après 1 semaine d’acclimatation au nouvel environnement, divisez les rats de manière aléatoire et égale en deux groupes (n = 8 rats / groupe). Les rats du groupe simulé subiront la chirurgie simulée, tandis que les rats du groupe modèle subiront la chirurgie expérimentale consistant à percer des trous dans le sillon trochléaire fémoral.
   REMARQUE : Chaque cage doit être recouverte de rembourrages stériles en épis de maïs (voir le tableau des matériaux) pour protéger les orteils des rats.
2. Anesthésier les rats par injection intrapéritonéale (i.p.) de pentobarbital sodique (40 mg/kg). Ensuite, appuyez doucement sur les orteils des rats pour confirmer une anesthésie adéquate. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux des rats pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
   REMARQUE: La chirurgie animale doit être effectuée dans une salle d’opération dédiée à l’aide d’instruments chirurgicaux autoclavés. Les opérateurs doivent porter des sarraus de laboratoire, des masques faciaux, des couvre-chefs et des gants stériles propres pendant la chirurgie. Placez des tampons stériles sur la zone chirurgicale et stérilisez tout l’équipement avant utilisation. Fournir un support thermique tout au long de la procédure.
3. Placez le rat sur la table d’opération en décubitus dorsal, rasez les membres postérieurs gauche et droit et nettoyez la zone de l’articulation du genou avec un savon chirurgical, suivi d’une alternance de solution antiseptique de povidone iodée et d’alcool trois fois dans des conditions stériles. Placez un champ stérile sur le rat et exposez uniquement l’articulation désinfectée du genou.
4. Faites une incision de 1 cm avec une lame de scalpel (numéro 11) au milieu de l’articulation du genou du rat de haut en bas, et coupez la capsule articulaire et le tendon quadriceps fémoris le long du bord médial de la rotule après la dissection superficielle.
   NOTE: Le tendon du quadriceps fémoral est attaché à la rotule et au condyle fémoral lors de la flexion de l’articulation du genou¹³. Le sillon observé dans la capsule articulaire est le sillon trochléaire fémoral, et le condyle fémoral distal forme les condyles médial et latéral.
5. Tournez la rotule vers l’extérieur et fléchissez le tibia et le péroné à un angle de 90° pour exposer complètement la trochlée du condyle fémoral. Utiliser un foret circulaire de 1,6 mm de diamètre (voir le tableau des matériaux) vertical à la surface du cartilage à 4 000 tr/min pendant 10 s pour faire un défaut cartilagineux de pleine épaisseur dans la rainure trochléaire fémorale avec une profondeur de 0,1 mm.
   REMARQUE: Utilisez une solution saline par intermittence pour minimiser les traumatismes thermiques du tissu osseux environnant pendant la procédure de forage.
6. Essuyez le site chirurgical avec des boules de coton imbibées d’une solution saline à 0,9%, replacez la rotule, maintenez le genou en position d’extension et suturez l’incision couche par couche avec des sutures 4-0 non résorbables (voir le tableau des matériaux).
   1. Placez les animaux sur des coussins chauffants avec une position couchée sternale, surveillez-les jusqu’à leur réveil, puis retournez-les dans leurs cages. Injectez de la buprénorphine (0,05 mg/kg) par voie sous-cutanée toutes les 8 heures trois fois après l’opération pour soulager la douleur.
7. Testez le comportement lié à la douleur de tous les rats 3 jours, 10 jours et 17 jours après la chirurgie, comme décrit dans la rubrique 2.

2. Seuil de retrait mécanique (MWT)

NOTE: Le MWT de la plantaire postérieure bilatérale de rats a été mesuré par la méthode classique de mesure de la douleur filamentaire de von Frey¹⁴.

1. Placez le rat dans une seule chambre en plastique (17 cm x 11 cm x 13 cm) sur une plate-forme en treillis métallique (voir le tableau des matériaux) et placez la base en treillis métallique à 50 cm au-dessus d’une table. Mesurer le MWT après 30 min d’adaptation.
2. Appuyez perpendiculairement sur la surface plantaire de la patte postérieure de chaque rat et pliez la brosse pendant environ 2 s, en évitant la partie la plus épaisse du centre de la patte postérieure.
3. Augmentez progressivement le poids du stimulus à partir des 4 g les plus bas jusqu’à ce qu’une réponse positive (retrait de la patte ou léchage de la patte) se produise.
   REMARQUE: L’intervalle entre chaque stimulation doit être supérieur à 1 min. Le MWT est défini comme trois réponses positives en cinq stimulations; Enregistrer le poids du stimulus en grammes.
4. Calculez les valeurs moyennes pour les groupes fictif et modèle en fonction du poids de stimulus minimal enregistré en grammes.

3. Analyse histopathologique et immunohistochimique

1. À 17 et 56 jours après la chirurgie, anesthésier les rats avec un pentobarbital sodique (i.p.) de 40 mg/kg et sacrifier tous les rats en prélevant le sang du cœur. Isolez les genoux en coupant l’os au milieu du fémur et du tibia moyen, et disséquez le tissu musculaire environnant. Retirez les articulations du genou pour une analyse histologique.
2. Fixer les articulations du genou dans 20 mL de solution de paraformaldéhyde à 10 % pendant 48 h à température ambiante, puis décalcifier avec 20 mL de solution d’EDTA à 10 % dans un agitateur orbital pendant 8 semaines à 4 °C. Changez la solution EDTA tous les jours.
3. Coupez l’articulation du genou pour l’adapter à la taille de la boîte d’intégration. Intégrez les articulations déshydratées du genou dans 100% de paraffine¹⁵.
4. Placez les articulations du genou incrustées de paraffine sur le support d’un microtome, ajustez l’angle et coupez l’échantillon de paraffine avec une lame jusqu’à ce que la surface soit plane.
5. Régler l’épaisseur des tranches de paraffine à 3 μm et aplatir les tranches au bain-marie à 40 °C.
6. Collez les tranches sur des lames de verre, placez-les dans une machine à pâtisserie à 45 °C (voir le tableau des matériaux) jusqu’à ce qu’elles soient sèches et conservez-les à température ambiante.
7. Déparaffinage et réhydratation : Décirer les tranches dans une étuve à 60 °C pendant 4 h, puis déposer successivement les tranches dans 100 % de xylène (trois fois), 100 % éthanol (deux fois), 95 % d’éthanol, 80 % d’éthanol et 75 % d’éthanol pendant 5 min à chaque fois.
8. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E)
   1. Décirer, réhydrater et laver les tranches avec de l’eau bidistillée pendant 2 min.
   2. Colorer les tranches avec de l’hématoxyline à 0,5 % (voir le tableau des matières) pendant 3 minutes et laver les tranches avec de l’eau bidistillée jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de résidus d’hématoxyline sur les surfaces des tranches.
   3. Immerger les tranches dans de l’alcool chlorhydrique à 1% pendant 3 s et laver les tranches à l’eau bidistillée pendant 2 min.
   4. Faire tremper les tranches dans de l’eau ammoniacale à 1% pendant 10 s et laver les tranches avec de l’eau bidistillée pendant 2 min.
   5. Colorer les tranches avec de l’éosine (voir le tableau des matériaux) pendant 1 min, et laver les tranches avec de l’eau bidistillée jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de résidus d’éosine sur les surfaces des tranches.
   6. Immergez les tranches dans de l’éthanol à 95 %, 100 % éthanol et 100 % xylène (trois fois) successivement pendant 1 min à chaque fois.
   7. Ajouter une goutte de résine neutre (voir le tableau des matières) à chaque tranche et la sceller avec un couvercle.
9. Safranin O/Fast Freen (SO) coloration
   1. Décirer, réhydrater et laver les tranches avec de l’eau bidistillée pendant 2 min.
   2. Colorer les tranches avec 0,05% de Fast Green (voir le tableau des matériaux) pendant 3 minutes et laver les tranches avec de l’eau bidistillée jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de résidus Fast Green à la surface des tranches.
   3. Tremper les tranches dans une solution d’acide acétique à 1% pendant 10 s et laver les tranches à l’eau bidistillée pendant 2 min.
   4. Colorer les tranches avec 2,5 % de SO (voir le tableau des matières) pendant 2 min, puis laver les tranches avec de l’eau bidistillée jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de résidus de SO sur les surfaces des tranches.
   5. Immergez les tranches dans de l’éthanol à 95 %, 100 % éthanol et 100 % xylène (trois fois) successivement pendant 1 min à chaque fois.
   6. Ajoutez une goutte de résine neutre à chaque tranche et scellez-la avec un couvercle.
10. Coloration au bleu de toluidine (TB)
    1. Décirer, réhydrater et laver les tranches avec de l’eau bidistillée pendant 2 min.
    2. Immerger les tranches dans une solution de TB à 1 % (voir le tableau des matières) pendant 2 min, et laver les tranches avec de l’eau bidistillée jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de résidus de bleu de toluidine à la surface des tranches.
    3. Immergez les tranches dans de l’éthanol à 95 %, 100 % éthanol et 100 % xylène (trois fois) successivement pendant 1 min à chaque fois.
    4. Ajoutez une goutte de résine neutre à chaque tranche et scellez-la avec un couvercle.
11. Coloration Masson
    1. Décirer, réhydrater et laver les tranches avec de l’eau bidistillée pendant 2 min.
    2. Ajouter la solution de bouin (voir le tableau des matières) goutte à goutte aux tranches, les colorer à 37 °C pendant 2 h et les laver à l’eau bidistillée jusqu’à ce que la couleur jaune à la surface des tranches disparaisse.
    3. Colorer les tranches avec du bleu de célestite (voir le tableau des matériaux) pendant 3 minutes et laver les tranches avec de l’eau bidistillée jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de résidus de bleu de célestite sur les surfaces des tranches.
    4. Colorer les tranches avec de l’hématoxyline pendant 3 minutes et laver les tranches avec de l’eau bidistillée jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de résidus d’hématoxyline sur les surfaces des tranches.
    5. Plonger les tranches dans de l’éthanol acide pendant 5 s et laver les tranches à l’eau bidistillée pendant 2 min.
    6. Colorer les tranches avec du Ponceau fuchsin (voir le tableau des matières) pendant 10 min, et laver les tranches avec de l’eau bidistillée jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de résidus de Ponceau fuchsin sur les surfaces des tranches.
    7. Immerger les tranches dans de l’acide phosphomolybdique (voir le tableau des matières) pendant 10 min, puis les immerger dans une solution de TB pendant 5 min, et laver les tranches avec de l’eau bidistillée jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de résidus de tuberculose à la surface des tranches.
    8. Plongez les tranches dans une solution acide faible pendant 2 min et lavez les tranches à l’eau bidistillée pendant 2 min.
    9. Immergez les tranches dans 95% d’éthanol, 100% d’éthanol et 100% de xylène (trois fois) successivement pendant 1 min à chaque fois.
    10. Ajoutez une goutte de résine neutre à chaque tranche et scellez-la avec un couvercle.
12. Observez toutes les tranches au microscope en double aveugle pour déterminer le degré de dégénérescence du cartilage articulaire selon le système de notation de Mankin¹⁶.
13. Immunohistochimie
    1. Décirer et réhydrater les tranches régulièrement, et laver les tranches avec du PBS pendant 2 min.
    2. Immerger les tranches dans une solution de citrate de sodium et placer les tranches dans une étuve à 60 °C pendant 4 h pour réparer l’antigène. Lavez les tranches avec du PBS trois fois pendant 3 minutes chacune.
    3. Immergez les tranches dans une solution de Triton X-100 à 0,3 % pendant 10 min et lavez les tranches deux fois avec du PBS pendant 3 minutes à chaque fois.
    4. Bloquer l’activité endogène de la peroxydase en ajoutant une solution à 3% H_2O2 dans du méthanol à température ambiante pendant 30 min. Lavez les tranches deux fois avec du PBS pendant 3 minutes à chaque fois.
    5. Incuber les sections avec du sérum de chèvre à 5% dans du PBS pendant 30 min à température ambiante pour bloquer toute liaison non spécifique. Lavez les tranches deux fois avec du PBS pendant 3 minutes à chaque fois.
    6. Ajouter 100 μL d’anticorps primaires dilués au PBS (anti-col1, 1:50; anti-col3, 1:50; anti-col2, 1:100; et anti-MMP13, 1:100; voir le tableau des matières) à chaque tranche et les incuber pendant une nuit à 4 °C. Lavez les tranches deux fois avec du PBS pendant 3 minutes à chaque fois.
    7. Incuber chaque tranche avec 100 μL d’anticorps secondaire dilué au PBS (1:100) (chèvre anti-lapin ou chèvre anti-souris, voir le tableau des matières) à température ambiante pendant 20 min. Lavez les tranches deux fois avec du PBS pendant 3 minutes à chaque fois.
    8. Ajouter 100 μL de solution de travail 3,3'-diaminobenzidine (DAB, voir le tableau des matières) à chaque tranche.
    9. Observer et enregistrer le temps d’apparition d’une couleur brune au microscope; La réaction chromogène rend les sites épitopiques bruns¹⁷. Traiter le reste des échantillons avec le même temps de réaction enregistré.
    10. Une fois que les tranches deviennent brunes, laver les tranches deux fois avec de l’eau bidistillée pendant 3 minutes à chaque fois.
    11. Re-colorer les tranches avec de l’hématoxyline pendant 1 min, et laver les tranches avec de l’eau bidistillée pendant 2 min.
    12. Immerger les tranches dans l’acide chlorhydrique pendant 3 s et laver les tranches à l’eau bidistillée pendant 2 min.
    13. Faire tremper les tranches dans de l’eau ammoniacale à 1% pendant 10 s et laver les tranches avec de l’eau bidistillée pendant 2 min.
    14. Immergez les tranches dans de l’éthanol à 95 %, 100 % éthanol et 100 % xylène (trois fois) successivement pendant 1 min à chaque fois.
    15. Ajoutez une goutte de résine neutre à chaque tranche et scellez-la avec un couvercle.

Résultats

Dans ce travail, un modèle de FTCD chez le rat a été établi en perçant des trous dans le sillon trochléaire fémoral et en détectant le comportement douloureux et les changements histopathologiques ultérieurs. Comme le montre la figure 1, 3 jours après la modélisation, par rapport au groupe fictif, le MWT des rats du groupe modèle a été significativement réduit, suggérant une hyperalgésie causée par le FTCD. À 17 jours après la modélisation, le seuil de retrait mécanique...

Discussion

Cette étude décrit un modèle animal pour imiter les défauts cartilagineux cliniques en perçant des trous dans la rainure trochléaire fémorale de rats (Figure supplémentaire 1). Après une lésion cartilagineuse, l’excitabilité ou la réactivité des nocicepteurs périphériques est améliorée, ce qui peut entraîner une diminution du seuil de douleur et l’amélioration de la réactivité à la stimulation¹⁸. Dans les études précliniques, la modéli...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3, 3 '-diaminobenzidine	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	ZLI-9019	The dye for IHC staining
Anti-Collagen III antibody	Novus	NB600-594	Primary antibody for IHC
Anti-Collagen II antibody	Abcam (UK)	34712	Primary antibody for IHC
Anti-Collagen I antibody	Novus	NB600-408	Primary antibody for IHC
Bouin solution	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Celestite blue	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Corncob paddings	Xiaohe Technology Co., Ltd		Bedding for animal
Eosin	Sigma-Aldrich	861006	The dye for HE staining
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	The dye for SO staining
Goat anti-mouse antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9002	Secondary antibody for IHC
Goat anti-rabbit antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9001	Secondary antibody for IHC
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3163	The dye for HE staining
Masson	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Microdrill	Rwd Life Science Co., Ltd	78001	Equipment for surgery
MMP13	Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)	69926	Primary antibody for IHC
Modular tissue embedding center	Thermo Fisher Scientific (USA)	EC 350	Produce paraffin blocks
Neutral resin	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	ZLI-9555	Seal for IHC
Nonabsorbable suture	Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd.	4-0	Equipment for surgery
Pentobarbital sodium	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	WBBTN5G	Anesthetized animal
phosphomolybdic acid	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Ponceau fuchsin	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Rotary and Sliding Microtomes	Thermo Fisher Scientific (USA)	HM325	Precise paraffin sections
Safranin-O	Sigma-Aldrich	S2255	The dye for SO staining
Scalpel blade	Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd.	11	Equipment for surgery
Sodium citrate solution (20x)	Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd.	HK1222	Antigen retrieval for IHC
Sprague Dawley (SD) rats	Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd.	SD	Experimental animal
Tissue-Tek VIP 5 Jr	Sakura (Japan)		Vacuum Infiltration Processor
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89640	The dye for TB staining
Von Frey filament	UGO Basile (Italy)	37450-275	Equipment for MWT assay
Wire mesh platform	Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd.		Equipment for MWT assay