פיתוח והערכה של מודל חולדה של פגמים בסחוס בעובי מלא

Summary

פרוטוקול זה מבסס מודל פגמים בסחוס בעובי מלא (FTCD) על ידי קידוח חורים בחריץ טרוכלארי הירך של חולדות ומדידת התנהגות הכאב והשינויים ההיסטופתולוגיים הבאים.

Abstract

פגמים בסחוס של מפרק הברך הנגרמים כתוצאה מטראומה הם פציעת מפרק ספורט נפוצה במרפאה, ופגמים אלה גורמים לכאבי מפרקים, לפגיעה בתנועה ובסופו של דבר לדלקת מפרקים ניוונית בברך (kOA). עם זאת, אין כמעט טיפול יעיל לפגמים בסחוס או אפילו kOA. מודלים של בעלי חיים חשובים לפיתוח תרופות טיפוליות, אך המודלים הקיימים לפגמים בסחוס אינם מספקים. עבודה זו ביססה מודל פגמים בסחוס בעובי מלא (FTCD) על ידי קידוח חורים בחריץ טרוכלארי הירך של חולדות, והתנהגות הכאב והשינויים ההיסטופתולוגיים שלאחר מכן שימשו כניסויי קריאה. לאחר הניתוח, סף הנסיגה המכנית ירד, כונדרוציטים באתר הפגוע אבדו, ביטוי מטריצה metalloproteinase MMP13 הוגדל, ביטוי קולגן מסוג II ירד, בהתאם לשינויים הפתולוגיים שנצפו פגמים בסחוס האנושי. מתודולוגיה זו קלה ופשוטה לביצוע ומאפשרת התבוננות גסה מיד לאחר הפציעה. יתר על כן, מודל זה יכול לחקות בהצלחה פגמים בסחוס הקליני, ובכך לספק פלטפורמה לחקר התהליך הפתולוגי של פגמים בסחוס ופיתוח תרופות טיפוליות מתאימות.

Introduction

סחוס מפרקי הוא רקמה מובחנת וצפופה מאוד המורכבת מכונדרוציטים ומטריקס חוץ-תאי¹. שכבת פני השטח של הסחוס המפרקי היא סוג של סחוס היאלין, בעל משטח חלק, חיכוך נמוך, חוזק וגמישות טובים, וסובלנות מאמץ מכנית מעולה². המטריצה החוץ-תאית כוללת קולגן פרוטאוגליקן ומים, וקולגן מסוג II הוא המרכיב המבני העיקרי של הקולגן, שכן הוא מהווה כ-90% מכלל קולגן³. מכיוון שלא קיימים כלי דם או עצבים ברקמת הסחוס, אין לו יכולת לתקן את עצמו לאחר פציעה⁴. לכן, פגמים בסחוס שנגרמו כתוצאה מטראומה היו מאז ומתמיד מחלת מפרקים בלתי פתירה במרפאות; בנוסף, מחלה משותפת זו נוטה להכות צעירים, ואת השכיחות העולמית היא בעלייה ^5,6. מפרק הברך הוא האתר השכיח ביותר של פגמים בסחוס, והפגמים כאן מלווים בכאבי מפרקים, תפקוד לקוי של המפרקים וניוון סחוס מפרקי, מה שמוביל בסופו של דבר לדלקת מפרקים ניוונית בברך (kOA)⁷. פגמים בסחוס במפרק הברך יוצרים עומס כלכלי ופיזיולוגי על המטופלים ומשפיעים קשות על^{איכות חייהם 8}. מחלה זו מציבה אתגר קליני גדול ודחוף ללא פתרונות קרובים. כיום, ניתוח הוא עמוד התווך של הטיפול בפגמים בסחוס, אך תוצאותיו ארוכות הטווח אינן משביעות רצון⁹.

פגמים קליניים בסחוס מובילים בסופו של דבר ל-kOA, ולכן מודלים של בעלי חיים kOA משמשים בדרך כלל למחקר פתולוגי של פגמים בסחוס ופיתוח תרופות. הקמת מודלים של בעלי חיים חשובה להבנת התהליך הפתופיזיולוגי של תיקון פגמים בסחוס, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לצפות בהתחדשות הסחוס ובשינוי בין סחוס פיברוקרטי לסחוס היאלין¹⁰. עם זאת, מודלים נפוצים של kOA בבעלי חיים, כגון מודלים כירורגיים של טרנסקציה של הרצועה הצולבת הקדמית (ACLT), ערעור יציבות המניסקוס המדיאלי (DMM), כריתת שחלות (OVX) והולת', זקוקים בדרך כלל למודלים ארוכי טווח ומאפשרים רק הערכות פתולוגיות וכאב, מה שמציב מגבלות על יעילות פיתוח התרופות¹¹. מלבד המודלים הניתוחיים, מודלים כימיים, כגון מונויודואצטט (MIA) והזרקת פפאין, גורמים גם הם לפגמים בסחוס, אך לא ניתן לנהל היטב את מידת הפגם, והתנאים רחוקים מהמציאות הקלינית¹¹. התנגשות היא גישה נוספת למדל פגמים בסחוס בבעלי חיים גדולים יותר, אך שיטה זו תלויה בשימוש במכשירים ספציפיים ומיושמת לעיתים רחוקות¹².

לסיכום, המודלים הקיימים של kOA אינם אידיאליים לחקר הפתוגנזה של פגמים בסחוס או לפיתוח תרופות חדשות, ויש צורך במודל ספציפי וסטנדרטי לפגמים בסחוס. מחקר זה ביסס מודל פגמים בסחוס בעובי מלא (FTCD) על ידי קידוח חורים בחריץ טרוכלארי הירך בחולדות. נערכו תצפית גסה, מבחני התנהגות כאב וניתוח היסטופתולוגי להערכת מודל. שלא כמו מודלים אחרים של בעלי חיים של kOA, למודל זה יש השפעה מועטה בלבד על מצבן הכללי של החולדות. גישת מידול זו נגישה, ניתנת לניהול טוב ותומכת בהבנת ההתקדמות מפגמים בסחוס ל- kOA ופיתוח טיפולים יעילים. מודל זה יכול לשמש גם לבדיקת טיפולים המונעים kOA על ידי ריפוי פגמים במפרקים טרום אוסטיאוארתריים.

Protocol

הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת התקנים הרפואיים והאתיקה של אוניברסיטת ג'ג'יאנג לרפואה סינית מסורתית, התואמת את החקיקה הסינית על שימוש וטיפול בחיות מעבדה. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בחולדות Sprague-Dawley (SD) זכרים בני 6 שבועות במשקל 150-180 גרם. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. הקמת מודל פגמים בסחוס בעובי מלא בחולדות

1. לאחר שבוע של התאקלמות בסביבה החדשה, חלקו את החולדות באופן אקראי ושווה לשתי קבוצות (n = 8 חולדות לקבוצה). החולדות בקבוצת הדמה יעברו את ניתוח הדמה, ואילו החולדות בקבוצת המודל יעברו את הניתוח הניסיוני הכולל קידוח חורים בחריץ טרוכלארי הירך.
   הערה: כל כלוב חייב להיות מכוסה בריפוד קלחי תירס סטריליים (ראה טבלת חומרים) כדי להגן על אצבעות הרגליים של החולדות.
2. הרדימו את החולדות על ידי הזרקה תוך צפקית (כלומר) של נתרן פנטוברביטלי (40 מ"ג/ק"ג). לאחר מכן, לחץ בעדינות על אצבעות הרגליים של החולדות כדי לאשר הרדמה נאותה. השתמשו במשחה וטרינרית על עיני החולדות כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
   הערה: את ניתוח בעלי החיים יש לבצע בחדר ניתוח ייעודי באמצעות כלי ניתוח אוטוקלאביים. על המפעילים ללבוש מעילי מעבדה נקיים, מסכות פנים, כיסויי ראש וכפפות סטריליות במהלך הניתוח. הניחו רפידות סטריליות על אזור הניתוח וחיקרו את כל הציוד לפני השימוש. לספק תמיכה תרמית לאורך כל ההליך.
3. הניחו את החולדה על שולחן הניתוחים במצב שכיבה, גלחו את הגפיים האחוריות השמאלית והימנית, ונקו את אזור מפרק הברך עם סבון כירורגי, ולאחר מכן תמיסת פובידון-יוד חיטוי לסירוגין ואלכוהול שלוש פעמים בתנאים סטריליים. מניחים וילון סטרילי מעל החולדה, וחושפים את מפרק הברך שעבר חיטוי בלבד.
4. בצע חתך של 1 ס"מ עם להב אזמל (מספר 11) באמצע מפרק ברך החולדה מלמעלה למטה, וחתך את קפסולת המפרק וגיד הירך הארבע ראשי לאורך הקצה המדיאלי של הפטלה לאחר הדיסקציה השטחית.
   הערה: גיד ה-Quadriceps femoris מחובר לפטלה ולקונדיל הירך במהלך כיפוף מפרק הברך¹³. החריץ שנראה בקופסית המפרק הוא החריץ הטרוכליארי של הירך, והקונדיל הפמורלי הדיסטלי יוצר את הקונדילים המדיאליים והצדיים.
5. סובבו את הפטלה כלפי חוץ, וכופפו את השוקה והפיבולה בזווית של 90 מעלות כדי לחשוף באופן מלא את הטרוכליאה של קונדיל הירך. השתמש במקדח מעגלי בקוטר 1.6 מ"מ (ראה טבלת חומרים) אנכי למשטח הסחוס ב-4,000 סל"ד למשך 10 שניות כדי ליצור פגם סחוס אחד בעובי מלא בחריץ טרוכלארי הירך בעומק של 0.1 מ"מ.
   הערה: יש להשתמש במי מלח לסירוגין כדי למזער טראומה תרמית לרקמת העצם שמסביב במהלך הליך הקידוח.
6. נגבו את מקום הניתוח בכדורי צמר גפן ספוגים בתמיסת מלח 0.9%, החליפו את הפטלה, השאירו את הברך במצב הארכה, ותפרו את החתך שכבה אחר שכבה בתפרים 4-0 שאינם נספגים (ראו טבלת חומרים).
   1. הניחו את בעלי החיים על כריות חימום עם שכיבה עצם החזה, עקבו אחריהם עד שהם מתעוררים, ואז החזירו אותם לכלובים שלהם. יש להזריק בופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג) תת עורית כל 8 שעות שלוש פעמים לאחר הניתוח לשיכוך כאבים.
7. בדוק את ההתנהגות הקשורה לכאב של כל החולדות לאחר 3 ימים, 10 ימים ו -17 ימים לאחר הניתוח, כמתואר בסעיף 2.

2. סף משיכה מכני (MWT)

הערה: MWT של הפלנטר האחורי הדו-צדדי של חולדות נמדד בשיטה הקלאסית למדידת כאב נימה של פון פריי¹⁴.

1. הניחו את החולדה בתא פלסטיק יחיד (17 ס"מ x 11 ס"מ x 13 ס"מ) על משטח רשת תיל (ראו טבלת חומרים), והניחו את בסיס רשת התיל 50 ס"מ מעל שולחן. מדוד את MWT לאחר 30 דקות של הסתגלות.
2. לחצו על חוט הלהט של פון פריי (ראו טבלת חומרים) בניצב על המשטח הפלנטרי של כפה אחורית של כל חולדה, וכופפו את המברשת במשך כ-2 שניות, תוך הימנעות מהחלק העבה ביותר של מרכז הכף האחורית.
3. הגדילו בהדרגה את משקל הגירוי מ-4 גרם הנמוך ביותר עד לתגובה חיובית (נסיגת כפות או ליקוק כפות).
   הערה: המרווח בין כל גירוי צריך להיות יותר מדקה. MWT מוגדר כשלוש תגובות חיוביות בחמישה גירויים; רשום את משקל הגירוי בגרמים.
4. חשב את הערכים הממוצעים עבור קבוצות דמה ומודל על פי משקל הגירוי המינימלי שנרשם בגרמים.

3. ניתוח היסטופתולוגי ואימונוהיסטוכימי

1. בגיל 17 ו-56 ימים לאחר הניתוח, הרדימו את החולדות עם 40 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל (כלומר), והקריבו את כל החולדות על ידי לקיחת דם מהלב. בודדו את הברכיים על ידי חיתוך העצם באמצע עצם הירך ובאמצע השוקה, ונתחו את רקמת השריר שמסביב. הסר את מפרקי הברך לניתוח היסטולוגי.
2. תקן את מפרקי הברך ב 20 מ"ל של תמיסת 10% paraformaldehyde במשך 48 שעות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן decalcize אותם עם 20 מ"ל של 10% EDTA פתרון בשייקר אורביטלי במשך 8 שבועות ב 4 ° C. שנה את פתרון EDTA מדי יום.
3. חתוך את מפרק הברך כך שיתאים לגודל קופסת ההטבעה. הטמיעו את מפרקי הברך המיובשים ב-100% פרפין¹⁵.
4. הניחו את מפרקי הברכיים המשובצים בפרפין על מחזיק המיקרוטום, התאימו את הזווית וקצצו את דגימת הפרפין עם להב עד שהמשטח שטוח.
5. קובעים את עובי פרוסות הפרפין ל-3 מיקרומטר, ומשטחים את הפרוסות באמבט מים ב-40°C.
6. הדביקו את הפרוסות על מגלשות זכוכית, הכניסו אותן למכונת אפייה בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס (ראו טבלת חומרים) עד לייבוש ואחסנו אותן בטמפרטורת החדר.
7. טלטול והתייבשות: הכניסו את הפרוסות לתנור בטמפרטורה של 60°C למשך 4 שעות, ולאחר מכן הכניסו את הפרוסות ברצף ל-100% קסילן (שלוש פעמים), 100% אתנול (פעמיים), 95% אתנול, 80% אתנול ו-75% אתנול למשך 5 דקות בכל פעם.
8. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E)
   1. Dewax, rehydrate, ולשטוף את הפרוסות עם מים מזוקקים כפול במשך 2 דקות.
   2. מכתימים את הפרוסות ב-0.5% המטוקסילין (ראו טבלת חומרים) למשך 3 דקות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים עד שאין שאריות המטוקסילין על משטחי הפרוסה.
   3. טובלים את הפרוסות באלכוהול חומצה הידרוכלורית 1% למשך 3 שניות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים למשך 2 דקות.
   4. משרים את הפרוסות במי אמוניה 1% למשך 10 שניות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים למשך 2 דקות.
   5. מכתימים את הפרוסות באאוסין (ראו טבלת חומרים) למשך דקה אחת, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים עד שאין שאריות אאוזין על משטחי הפרוסה.
   6. טבלו את הפרוסות ב-95% אתנול, 100% אתנול ו-100% קסילן (שלוש פעמים) ברציפות במשך דקה אחת בכל פעם.
   7. הוסיפו טיפה של שרף נייטרלי (ראו טבלת חומרים) לכל פרוסה, ואטמו אותה בכיסוי.
9. ספרנין O/Fast Freen (SO) צביעה
   1. Dewax, rehydrate, ולשטוף את הפרוסות עם מים מזוקקים כפול במשך 2 דקות.
   2. צבעו את הפרוסות ב-0.05% Fast Green (ראו טבלת חומרים) במשך 3 דקות, ושטפו את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים עד שלא יהיו שאריות Fast Green על פני הפרוסות.
   3. טובלים את הפרוסות בתמיסת חומצה אצטית 1% למשך 10 שניות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים למשך 2 דקות.
   4. מכתימים את הפרוסות ב-2.5% SO (ראו טבלת חומרים) למשך 2 דקות, ולאחר מכן שוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים עד שאין שאריות SO על משטחי הפרוסה.
   5. טבלו את הפרוסות ב-95% אתנול, 100% אתנול ו-100% קסילן (שלוש פעמים) ברציפות במשך דקה אחת בכל פעם.
   6. הוסיפו טיפה של שרף נייטרלי לכל פרוסה, ואטמו אותה בכיסוי.
10. צביעה בצבע כחול טולוידין (שחפת)
    1. Dewax, rehydrate, ולשטוף את הפרוסות עם מים מזוקקים כפול במשך 2 דקות.
    2. טובלים את הפרוסות בתמיסת 1% שחפת (ראו טבלת חומרים) למשך 2 דקות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים עד שאין שאריות כחולות טולוידין על פני הפרוסות.
    3. טבלו את הפרוסות ב-95% אתנול, 100% אתנול ו-100% קסילן (שלוש פעמים) ברציפות במשך דקה אחת בכל פעם.
    4. הוסיפו טיפה של שרף נייטרלי לכל פרוסה, ואטמו אותה בכיסוי.
11. צביעת מסון
    1. Dewax, rehydrate, ולשטוף את הפרוסות עם מים מזוקקים כפול במשך 2 דקות.
    2. מוסיפים תמיסת Bouin (ראו טבלת חומרים) טיפה לפרוסות, מכתימים אותן ב-37°C למשך שעתיים ושוטפים אותן במים מזוקקים פעמיים עד שהצבע הצהוב על פני השטח של הפרוסות נעלם.
    3. מכתימים את הפרוסות בכחול שמיימי (ראו טבלת חומרים) למשך 3 דקות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים עד שאין שאריות כחולות על משטחי הפרוסה.
    4. מכתימים את הפרוסות בהמטוקסילין למשך 3 דקות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים עד שאין שאריות המטוקסילין על משטחי הפרוסה.
    5. טובלים את הפרוסות באתנול חומצי במשך 5 שניות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים למשך 2 דקות.
    6. מכתימים את הפרוסות בפונסו פוקסין (ראו טבלת חומרים) למשך 10 דקות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים עד שאין שאריות פונסו פוקסין על משטחי הפרוסה.
    7. טובלים את הפרוסות בחומצה פוסהומוליבדית (ראו טבלת חומרים) למשך 10 דקות, לאחר מכן טובלים אותן בתמיסת שחפת למשך 5 דקות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים עד שאין שאריות שחפת על פני הפרוסות.
    8. טובלים את הפרוסות בתמיסת חומצה חלשה למשך 2 דקות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים למשך 2 דקות.
    9. טבלו את הפרוסות ב-95% אתנול, 100% אתנול ו-100% קסילן (שלוש פעמים) ברציפות במשך דקה אחת בכל פעם.
    10. הוסיפו טיפה של שרף נייטרלי לכל פרוסה, ואטמו אותה בכיסוי.
12. התבוננו בכל הפרוסות תחת מיקרוסקופ במצב כפול סמיות כדי לקבוע את מידת ניוון הסחוס המפרקי על פי שיטת הניקוד של מנקין¹⁶.
13. אימונוהיסטוכימיה
    1. יש ללחלח את הפרוסות באופן שגרתי, ולשטוף את הפרוסות עם PBS למשך 2 דקות.
    2. לטבול את הפרוסות בתמיסת נתרן ציטראט, ומניחים את הפרוסות בתנור ב 60 ° C במשך 4 שעות כדי לתקן את האנטיגן. שטפו את הפרוסות עם PBS שלוש פעמים במשך 3 דקות כל אחת.
    3. טבלו את הפרוסות בתמיסת טריטון X-100 0.3% למשך 10 דקות, ושטפו את הפרוסות פעמיים עם PBS במשך 3 דקות בכל פעם.
    4. חסום את פעילות הפרוקסידז האנדוגני על ידי הוספת תמיסת 3%H 2 O₂ במתנול בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שטפו את הפרוסות פעמיים עם PBS במשך 3 דקות בכל פעם.
    5. יש לדגור על החלקים עם סרום עיזים 5% ב-PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחסום כל קשירה לא ספציפית. שטפו את הפרוסות פעמיים עם PBS במשך 3 דקות בכל פעם.
    6. הוסיפו 100 μL של נוגדנים ראשוניים מדוללים ב-PBS (anti-col1, 1:50; anti-col3, 1:50; anti-col2, 1:100; ו-anti-MMP13, 1:100; ראו טבלת חומרים) לכל פרוסה, ודגרו עליהם למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. שטפו את הפרוסות פעמיים עם PBS במשך 3 דקות בכל פעם.
    7. יש לדגור על כל פרוסה עם 100 מיקרוליטר של נוגדן משני בדילול PBS (1:100) (אנטי-ארנב עז או אנטי-עכבר עזים, ראו טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. שטפו את הפרוסות פעמיים עם PBS במשך 3 דקות בכל פעם.
    8. הוסף 100 μL של 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB, ראה את טבלת החומרים) פתרון עבודה לכל פרוסה.
    9. להתבונן ולתעד את זמן המראה של צבע חום תחת מיקרוסקופ; התגובה הכרומוגנית הופכת את אתרי האפיטופ לחום¹⁷. טפל בשאר הדגימות עם אותו זמן תגובה מוקלט.
    10. לאחר שהפרוסות הופכות לשחומות, שטפו את הפרוסות פעמיים במים מזוקקים פעמיים במשך 3 דקות בכל פעם.
    11. מכתימים מחדש את הפרוסות בהמטוקסילין למשך דקה, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים למשך 2 דקות.
    12. טובלים את הפרוסות בחומצה הידרוכלורית במשך 3 שניות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים למשך 2 דקות.
    13. משרים את הפרוסות במי אמוניה 1% למשך 10 שניות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים למשך 2 דקות.
    14. טבלו את הפרוסות ב-95% אתנול, 100% אתנול ו-100% קסילן (שלוש פעמים) ברציפות במשך דקה אחת בכל פעם.
    15. הוסיפו טיפה של שרף נייטרלי לכל פרוסה, ואטמו אותה בכיסוי.

תוצאות

בעבודה זו, מודל חולדה של FTCD הוקם על ידי קידוח חורים בחריץ טרוכליר הירך ואיתור התנהגות הכאב והשינויים ההיסטופתולוגיים הבאים. כפי שניתן לראות באיור 1, 3 ימים לאחר המידול, בהשוואה לקבוצת הדמה, ה-MWT של חולדות בקבוצת המודל הופחת באופן משמעותי, מה שמרמז על שיכוך יתר שנגרם על-ידי ה-FTC...

Discussion

מחקר זה מתאר מודל של בעלי חיים לחיקוי פגמים בסחוס קליני על-ידי קידוח חורים בחריץ טרוכלארי הירך של חולדות (איור משלים 1). לאחר פגיעה בסחוס, ההתרגשות או ההיענות של nociceptors היקפי משופר, אשר יכול לגרום לירידה בסף הכאב ואת שיפור ההיענות לגירוי¹⁸. במחקרים פרה-קליניים, ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3, 3 '-diaminobenzidine	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	ZLI-9019	The dye for IHC staining
Anti-Collagen III antibody	Novus	NB600-594	Primary antibody for IHC
Anti-Collagen II antibody	Abcam (UK)	34712	Primary antibody for IHC
Anti-Collagen I antibody	Novus	NB600-408	Primary antibody for IHC
Bouin solution	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Celestite blue	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Corncob paddings	Xiaohe Technology Co., Ltd		Bedding for animal
Eosin	Sigma-Aldrich	861006	The dye for HE staining
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	The dye for SO staining
Goat anti-mouse antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9002	Secondary antibody for IHC
Goat anti-rabbit antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9001	Secondary antibody for IHC
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3163	The dye for HE staining
Masson	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Microdrill	Rwd Life Science Co., Ltd	78001	Equipment for surgery
MMP13	Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)	69926	Primary antibody for IHC
Modular tissue embedding center	Thermo Fisher Scientific (USA)	EC 350	Produce paraffin blocks
Neutral resin	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	ZLI-9555	Seal for IHC
Nonabsorbable suture	Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd.	4-0	Equipment for surgery
Pentobarbital sodium	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	WBBTN5G	Anesthetized animal
phosphomolybdic acid	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Ponceau fuchsin	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	The dye for Masson staining
Rotary and Sliding Microtomes	Thermo Fisher Scientific (USA)	HM325	Precise paraffin sections
Safranin-O	Sigma-Aldrich	S2255	The dye for SO staining
Scalpel blade	Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd.	11	Equipment for surgery
Sodium citrate solution (20x)	Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd.	HK1222	Antigen retrieval for IHC
Sprague Dawley (SD) rats	Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd.	SD	Experimental animal
Tissue-Tek VIP 5 Jr	Sakura (Japan)		Vacuum Infiltration Processor
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89640	The dye for TB staining
Von Frey filament	UGO Basile (Italy)	37450-275	Equipment for MWT assay
Wire mesh platform	Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd.		Equipment for MWT assay