طريقة إثراء للحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من أنسجة سرطان الكبد

Summary

هنا نصف إثراء الحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من أنسجة سرطان الكبد من خلال طريقة الطرد المركزي التفاضلي الأمثل.

Abstract

يمكن أن تعكس الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) المشتقة من الأنسجة الحالة الوظيفية للخلايا المصدر وخصائص الفضاء الخلالي للنسيج. يعد الإثراء الفعال لهذه المركبات الكهربائية شرطا أساسيا مهما لدراسة وظيفتها البيولوجية ومفتاحا لتطوير تقنيات الكشف السريري وتكنولوجيا الناقل العلاجي. من الصعب عزل sEVs عن الأنسجة لأنها عادة ما تكون ملوثة بشدة. توفر هذه الدراسة طريقة للإثراء السريع ل sEVs عالية الجودة من أنسجة سرطان الكبد. تتضمن الطريقة عملية من أربع خطوات: حضانة الإنزيمات الهاضمة (كولاجيناز D و DNase Ι) بالأنسجة ، والترشيح من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر ، والطرد المركزي التفاضلي ، والترشيح من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر. نظرا لتحسين خطوة الطرد المركزي التفاضلي وإضافة خطوة ترشيح ، فإن نقاء sEVs التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة أعلى من تلك التي حققها الطرد المركزي التفاضلي الكلاسيكي. يوفر منهجية مهمة وبيانات داعمة لدراسة sEVs المشتقة من الأنسجة.

Introduction

يبلغ قطر الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) حوالي 30 نانومتر إلى 150 نانومتر وتفرزها خلايا مختلفة¹. يمكنهم التواصل مع خلايا الأنسجة وتنظيم البيئة المكروية المحلية أو البعيدة عن طريق نقل جزيئات بيولوجية مهمة مثل الدهون والبروتينات والحمض النووي والحمض النووي الريبي إلى مختلف الأعضاء والأنسجة والخلايا والأجزاء داخل الخلايا. وبالتالي ، يمكنهم أيضا تغيير سلوك الخلايا المتلقية ^2,3. يعد عزل وتنقية sEVs المحددة شرطا أساسيا لدراسة سلوكها البيولوجي أثناء تطور المرض ومساره. يستخدم الطرد المركزي التفاضلي - الذي يعتبر المعيار الذهبي - بشكل شائع لفصل sEVs عن الأنسجة التي يقيمون فيها عادة⁴. يمكن إزالة حطام الأنسجة وحطام الخلايا والحويصلات الكبيرة والأجسام المبرمج بواسطة هذه التقنية ، مع ترك sEVs فقط.

لقد ثبت أن كولاجيناز D و DNase I لا يؤثران على الخصائص الجزيئية للخلايا أو الحويصلات ، حيث تساهم خصائص كلا الإنزيمين في إطلاق الحويصلات في المصفوفة خارج الخلية ⁵. تم استخدام هذه الإنزيمات لاستخراج sEVs من أنسجة سرطان الجلد النقيلي البشري ، وأنسجة سرطان القولون ، والأنسجة المخاطية القولونية⁵،^6،7. ومع ذلك ، فإن تركيز ووقت هضم كولاجيناز D و DNase I في هذه الطرق يختلفان ، مما يؤدي إلى استنتاجات غير متسقة. لتجنب الترسيب المشترك لأنواع فرعية أخرى من sEVs ، قام الباحثون بإزالة حويصلات أكبر خارج الخلية (قطرها 0.1 ميكرومتر أو 0.2 ميكرومتر) عن طريق الترشيح و / أو الطرد المركزي التفاضلي⁸. اعتمادا على الأنسجة المصدر ، قد تكون هناك حاجة إلى طرق مختلفة للعزل والتنقية ^9,10.

يؤدي استخدام طريقة الطرد المركزي التفاضلي التقليدي لاستخراج sEVs من أنسجة الكبد إلى طبقة من المادة البيضاء على سطح المادة الطافية ، دون أي طريقة لتحديد خصائصها. في دراسة سابقة¹¹ ، وجد أن هذه الطبقة من المادة البيضاء تؤثر على نقاء sEVs. على الرغم من أن عدد الجسيمات وتركيز البروتين للعينات المعزولة بالطريقة التقليدية كانا أعلى من تلك الموجودة في الطريقة الحالية ، إلا أن معامل الاختلاف كان كبيرا ، ربما لأن العديد من الملوثات يمكن أن تؤدي إلى ضعف تكرار النتائج. أي باستخدام المنظفات (أي اكتشاف قابلية ذوبان الجسيمات في 1٪ Triton X-100) ، وجدنا أن نقاء sEVs التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة كان أكبر. ومن ثم ، فإننا نستخدم هذه الطريقة لعزل وتنقية sEVs المشتقة من أنسجة سرطان القولون والمستقيم للبحث البروتيني.

في الوقت الحاضر ، تركز الأبحاث حول sEVs في سرطان الكبد بشكل أساسي على المصل والبلازما والمادة الطافية لثقافة الخلايا¹²،^13،14. ومع ذلك ، يمكن أن تعكس sEVs المشتقة من أنسجة سرطان الكبد بشكل أكثر دقة علم الأمراض الفسيولوجية والبيئة المكروية المحيطة بسرطان الكبد وتتجنب بشكل فعال تدهور وتلوث المركبات الكهربائية الأخرى^15,16. مع استخدام الطرد المركزي التفاضلي ، يمكن لهذه الطريقة إثراء الغلة والحصول على sEVs عالية الجودة ، مما يوفر أساسا مهما لمزيد من الدراسة لسرطان الكبد. تتيح هذه الطريقة فصل أنسجة سرطان الكبد عن طريق الفصل الحاد وفصلها عن طريق كولاجيناز D و DNase I. بعد ذلك ، تتم إزالة الحطام الخلوي والحويصلات الكبيرة والأجسام المبرمج عن طريق الترشيح والطرد المركزي التفاضلي. أخيرا ، يتم عزل sEVs وتنقيتها للدراسات اللاحقة.

Protocol

تم جمع أنسجة سرطان الكبد البشري من المرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بالأورام الخبيثة الكبدية في المستشفى الأول التابع لجامعة جنان الطبية. وقع جميع المرضى على نموذج موافقة مستنيرة ، وتمت الموافقة على جمع عينات الأنسجة البشرية من قبل لجنة الأخلاقيات في المستشفى الأول التابع لجامعة جنان الطبية. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والمعدات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. التحضير

1. ضع شاكر إزالة اللون في الحاضنة واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. انظر الشكل 1 لجميع المعدات الأخرى المطلوبة.
2. نظف المشرط والملقط عن طريق رشها بنسبة 75٪ كحول.
3. تحضير محلول الهضم عن طريق قياس 6 ملغ من كولاجيناز D (4 ملغ / مل) و 24 ميكرولتر من DNase Ι (80 وحدة / مل) وإضافتها إلى 1.5 مل من الوسط الأساسي RPMI-1640. تخلط عن طريق انقلاب لطيف حتى تذوب المواد المضافة تماما.
4. مقدما ، رطب مصافي الخلايا 70 ميكرومتر و 0.22 ميكرومتر مع 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
5. ضع طبق زراعة خلايا معقمة 100 مم على صندوق الثلج لتثبيت أنسجة الكبد بعد إذابة الجليد.
6. في غضون 15 دقيقة بعد عزل أنسجة سرطان الخلايا الكبدية ، شطف الدم على سطح كتلة الأنسجة مع برنامج تلفزيوني ، ونقل الأنسجة إلى أنبوب مجمد معقم ، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى التجربة لمدة لا تزيد عن 2 أسابيع.

2. تفكك الأنسجة

1. أخرج عينة الأنسجة من الفريزر -80 درجة مئوية وضع حوالي 400 مجم من الأنسجة المقطعة إلى شظايا 2 مم × 2 مم × 2 مم - في طبق زراعة الخلايا 10 سم على صندوق الثلج.
2. نقل الأنسجة إلى لوحة 6 آبار مع 1.5 مل من محلول الجهاز الهضمي. بعد ذلك ، ضع اللوحة على شاكر إزالة اللون (20 دورة في الدقيقة / دقيقة) لاحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية للتفكك الكامل لأنسجة سرطان الكبد وإطلاق sEVs.
3. أخرج اللوحة المكونة من 6 آبار من الحاضنة وضعها على صندوق الثلج. أضف 80 ميكرولتر من مثبطات الفوسفاتيز و 200 ميكرولتر من محلول مثبط الأنزيم البروتيني الكامل لوقف عملية الهضم.
4. انقل المحلول الهضمي إلى مصفاة الخلايا 70 ميكرومتر وقم بترشيحه ببطء لإزالة أي بقايا أنسجة كبيرة. اجمع المرشح وضعه في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل.

3. الطرد المركزي التفاضلي

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية.

1. أجهزة الطرد المركزي المرشح في 500 × غرام لمدة 10 دقائق وجمع طاف في أنبوب طرد مركزي جديد 2 مل. يمكن بعد ذلك إزالة معظم بقايا الأنسجة الصغيرة.
2. جهاز طرد مركزي على متن المادة الطافية عند 3000 × جم لمدة 20 دقيقة لإزالة حطام الخلية. انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب طرد مركزي جديد حتى يصبح طرف الماصة على وشك لمس المادة البيضاء على السطح.
3. أجهزة الطرد المركزي السائل المتبقي عند 3000 × جم لمدة 3 دقائق ؛ ثم ، نضح الطافي لتسهيل جمع الحويصلات. لضمان نقاء sEVs ، تأكد من عدم استنشاق المادة البيضاء.
4. أجهزة الطرد المركزي التي تم جمعها عند 12000 × جم لمدة 20 دقيقة ونقل 900 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي فائق سعة 4.7 مل. قم بطرد السائل المتبقي عند 12000 × جم لمدة 3 دقائق ثم قم بجمع وخلط كل من المواد الطافية في نفس أنبوب الطرد المركزي الفائق. املأ الأنبوب بالكامل باستخدام برنامج تلفزيوني.
5. أجهزة الطرد المركزي للطاف في 100000 × غرام لمدة 60 دقيقة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات عن طريق ملء أنبوب الطرد المركزي الفائق ب PBS والطرد المركزي مرة أخرى عند 100000 × جم لمدة 60 دقيقة. أعد تعليق الحبيبات ب 50 ميكرولتر من PBS.
6. نضح تعليق sEV باستخدام حقنة معقمة 1 مل وترشيحه من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر. اجمع المرشح في أنبوب طرد مركزي سعة 600 ميكرولتر وقم بتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمزيد من التحليل.

4. تقييم جودة التخصيب

1. مراقبة مورفولوجيا sEVs تحت المجهر الإلكتروني الإرسال.
   1. بعد ذلك ، قم بإسقاط 10 ميكرولتر من عينة sEV على شبكة نحاسية ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، وتنظيفها بالماء المقطر المعقم ، باستخدام ورق ماص لإزالة السائل الزائد.
   2. قم بإسقاط 10 ميكرولتر من أسيتات اليورانيل 2٪ على شبكة النحاس للتلطيخ السلبي لمدة دقيقة واحدة. استخدم ورق الترشيح لامتصاص السائل الموجود على سطح الشبكة النحاسية وتجفيفه لمدة 2 دقيقة تحت مصباح متوهج.
   3. راقب الشبكة النحاسية تحت المجهر الإلكتروني النافذ والصورة عند 80 كيلو فولت.
2. استخدم مقياس تدفق الجسيمات النانوية لتحديد توزيع حجم ونقاء sEVs.
   1. قبل بدء تشغيل الماكينة ، قم بإعداد أنابيب تحتوي على 200 ميكرولتر من مراقبة الجودة ، و 200 ميكرولتر من الكريات النانوية السيليكا ، و 2 × 200 ميكرولتر من الماء عالي النقاء ، و 2 × 200 ميكرولتر من محلول التنظيف ، و 200 ميكرولتر من PBS.
      ملاحظة: قبل اختبار عينات sEV ، من الضروري إجراء مراقبة الجودة على الجهاز واختبار معيار حجم الجسيمات (يجب حساب توزيع الحجم باستخدام منحنيات قياسية تم إنشاؤها باستخدام عدة كرات نانوية دقيقة بأقطار مختلفة [68-155 نانومتر] تحت نفس حالة الكشف). تم تخفيف حبات مراقبة الجودة والكريات النانوية السيليكا 100x بماء فائق النقاء بحجم إجمالي يبلغ 200 ميكرولتر.
   2. تحقق من حجم محلول التنظيف (>10 مل) ولاحظ الفرق بين مستويات سائل الغمد وسائل النفايات (20-30 سم).
   3. قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة الرئيسي للأداة ؛ بعد 20 ثانية ، قم بتشغيل الكمبيوتر وانتظر أصوات التنبيه التي تشير إلى أن الجهاز متصل بشكل صحيح لتشغيل البرنامج.
   4. انقر فوق بدء التشغيل لتشغيل الكاميرا والليزر ومضخة الهواء.
   5. انقر فوق غمد التدفق - بدء التشغيل ، وضع الماء عالي النقاء على منصة التحميل. بعد 4 دقائق (العد التنازلي للأداة) ، انقر فوق تعزيز العينة | عينة تفريغ.
   6. بعد 30 ثانية ، ضع الأنبوب الفارغ على منصة التحميل وانقر على تعزيز العينة | عينة تفريغ. بعد ذلك ، ضع الأنبوب الذي يحمل الماء عالي النقاء على منصة التحميل ، وفي نفس الوقت ، انقر فوق تعزيز العينة | غمد التدفق تطهير.
   7. انقر فوق التشغيل اليدوي وضع أنبوب تركيز الجسيمات على منصة التحميل. ثم ، انقر فوق تعزيز العينة لمدة 1 دقيقة وحدد في نفس الوقت 250 نانومتر Std FL SiNPs مراقبة الجودة في "SAMP. إنف."
   8. انقر فوق أخذ العينات وقم بتشغيل الكاشف بالنقر فوق SPCM.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن رؤية شكل موجة الإشارة في الوقت الفعلي.
   9. انقر فوق أخذ العينات التلقائي وأدخل 1.0 في Sampling SET لإصلاح الضغط عند 1 كيلو باسكال. انقر فوق شريط الأدوات وحدد إشارة كبيرة.
   10. اضبط الوضع الأفقي لليزر واضبط الليزر على 2 ميكرومتر ؛ ثم ، انقر فوق L أو R للتأكد من أن الإشارة قوية وموحدة.
   11. انقر فوق وقت التسجيل لجمع البيانات ، والتي ستنتقل تلقائيا إلى Buffer عند الانتهاء. بعد ذلك ، احفظ البيانات في ملف Naf وانقر فوق نموذج إلغاء التحميل.
   12. ضع أنبوب محلول التنظيف على منصة التحميل ، وانقر فوق تعزيز العينة ، وبعد 1 دقيقة ، انقر فوق تفريغ العينة. استخدم الماء عالي النقاء لإزالة محلول التنظيف المتبقي من طرف الشعيرات الدموية.
   13. ضع الأنبوب القياسي بحجم الجسيمات على منصة التحميل وانقر على تعزيز العينة لمدة 1 دقيقة.
   14. حدد 68-155 نانومتر Std FL SiNPs مراقبة الجودة في "SAMP. Inf" وانقر على أخذ عينات العينة. ثم ، انقر فوق شريط الأدوات وحدد إشارة صغيرة.
   15. انقر فوق وقت التسجيل لجمع البيانات ، والتي ستنتقل تلقائيا إلى Buffer عند الانتهاء. بعد ذلك ، احفظ البيانات في ملف Naf وانقر فوق نموذج إلغاء التحميل.
   16. ضع أنبوب محلول التنظيف على منصة التحميل ، وانقر فوق تعزيز العينة ، وانقر فوق تفريغ العينة بعد 1 دقيقة. استخدم الماء عالي النقاء لإزالة محلول التنظيف المتبقي من طرف الشعيرات الدموية.
   17. ضع أنبوب PBS على منصة التحميل ؛ انقر فوق تعزيز العينة لمدة 1 دقيقة.
   18. حدد 68-155 نانومتر Std FL SiNPs مراقبة الجودة في "SAMP. Inf" وانقر على أخذ عينات العينة. ثم ، انقر فوق شريط الأدوات وحدد إشارة صغيرة.
   19. انقر فوق وقت التسجيل لجمع البيانات ، والتي ستنتقل تلقائيا إلى المخزن المؤقت عند الانتهاء. احفظ البيانات في ملف Naf وانقر فوق نموذج إلغاء التحميل.
   20. ضع أنبوب محلول التنظيف على منصة التحميل ، وانقر فوق تعزيز العينة وتفريغ العينة بعد 1 دقيقة. استخدم الماء عالي النقاء لإزالة محلول التنظيف المتبقي من طرف الشعيرات الدموية.
   21. تحقق من معلومات العينة كما هو موضح سابقا في الخطوات 4.2.17-4.2.20 ؛ قم بتغيير PBS (الخطوة 4.2.17) إلى عينة sEV وتحليل البيانات.
3. مزيد من تحديد sEVs بواسطة لطخة الغربية.
   1. تحديد تركيزات البروتين من sEVs والأنسجة باستخدام مجموعة قياس كمية البروتين BCA وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   2. احسب حجم تحميل sEVs (على سبيل المثال ، ل 5 ميكروغرام من البروتين لكل بئر) بناء على هذه النتائج الكمية. أضف مخزن التحميل بنسبة 1: 4 ودوامة الخليط.
   3. بعد تغيير الطبيعة في حمام معدني 100 درجة مئوية (ترموستات جاف) لمدة 10 دقائق ، افصل البروتين على جل بولي أكريلاميد 12٪ عند 60 فولت لمدة 80 دقيقة.
   4. انقل الجل إلى غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيليدين 0.22 ميكرومتر عند 220 مللي أمبير لمدة ساعتين باستخدام مخزن النقل المؤقت (25 مللي متر تريس ، 192 مللي مول جليكاين ، 20٪ ميثانول).
   5. سد الغشاء ب 5٪ حليب جاف منزوع الدسم في Tween محلول ملحي مخزن من Tris (TBST) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة واحتضانه بالجسم المضاد الأساسي (الجسم المضاد CD9 أحادي النسيلة للأرانب ، الجسم المضاد CD63 أحادي النسيلة للأرانب ، الجسم المضاد TSG101 أحادي النسيلة للأرانب ، الجسم المضاد GM130 أحادي النسيلة للفأر) طوال الليل عند 4 درجات مئوية. تمييع الأجسام المضادة الأولية في 5٪ حليب خالي الدسم في 1: 1000.
   6. بعد ثلاث غسلات مع TBST ، احتضان الغشاء مع بيروكسيديز الفجل (HRP) - الجسم المضاد الثانوي المترافق في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
   7. اكتشف الجسم المضاد المرتبط ب HRP باستخدام ركيزة نشاف ECL ، ثم اجمع الصور وحللها.

النتائج

لعبت sEVs من أنسجة سرطان الكبد البشرية دورا حاسما في تشخيص وعلاج وتشخيص مرضى سرطان الكبد. استخدمت هذه الطريقة أدوات مخبرية شائعة لعزل وتنقية sEVs المشتقة من أنسجة سرطان الكبد. قد يوفر هذا دعما منهجيا لدراسة المركبات الكهربائية السريعة. يوضح الشكل 2 العملية العامة لإثراء sEVs من ?...

Discussion

يصف هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار لاستخراج sEVs من أنسجة سرطان الكبد. يتم الحصول على sEVs عالية الجودة عن طريق عزل الأنسجة الحادة ، والعلاج بالإنزيمات الهضمية ، والطرد المركزي التفاضلي ، وترشيح وتنقية غشاء المرشح 0.22 ميكرومتر. بالنسبة لتحليل المصب ، من المهم للغاية ضمان النقاء العالي للم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Membrane Filter Unit	Millex	SLGPR33RB
1 mL Sterile syringe	Hubei Xianming Medical Instrument Company	YL01329
2% Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400-2
4.7 mL Centrifuge Tube	Beckman Coulter	361621
6-well Cell cuture plate	LABSELECT	11110
50 mL Beaker	Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company	CF2100800
70 µm Cell strainer	Biosharp	BS-70-XBS
100 mm Cell culture dish	CELL TER	CS016-0128
600 µL Centrifuge tube	Axygen	MCT060C
BCA protein quantification kit	Thermo Fisher	RJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TL	Beckman	A95761
BioRad Mini trans-blot	Bio-Rad	1703930
BioRad Mini-Protean	Bio-Rad	1645050
CD63 Antibody	Abcam	ab134045
CD9 Antibody	Abcam	ab263019
Centrifuge 5430R	Eppendorf	5428HQ527333
Cleaning Solution	NanoFCM	C1801
Collagenase D	Roche	11088866001
Copper net	Henan Zhongjingkeyi Technology Company	DJZCM-15-N1
Dry Thermostat	Hangzhou allsheng instruments company	AS-01030-00
FITC Anti Human CD9 Antibody	Elabscience	E-AB-F1086C
Glycine	Solarbio	G8200
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody	Proteintech	SA00001-1
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody	Proteintech	SA00001-2
Methanol	Shanghai Zhenxing Chemical Company
Nanoparticle flow cytometer	NanoFCM INC	FNAN30E20112368
Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)	Roche	4906845001
Phosphate Buffered Saline(PBS)	Servicebio	G4202
Polyvinylidene Difluoride Membrane	Solarbio	ISEQ00010
QC Beads	NanoFCM	QS2502
RPMI-1640 basic medium	Biological Industries	C11875500BT
Scalpel	Guangzhou Kehua Trading Company	NN-0623-1
Silica Nanospheres	NanoFCM	S16M-Exo
Transference Decoloring Shaker TS-8	Kylin-Bell	E0018
Transmission Electron Microscope	Thermo Scientific	Talos L120C
Tris	Solarbio	T8060
TSG101 Antibody	Proteintech	28283-1-AP
Tweezer	Guangzhou Lige Technology Company	LG01-105-4X