JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем обогащение небольших внеклеточных везикул, полученных из ткани рака печени, с помощью оптимизированного метода дифференциального ультрацентрифугирования.

Аннотация

Небольшие внеклеточные везикулы (sEV), полученные из ткани, могут отражать функциональное состояние исходных клеток и характеристики интерстициального пространства ткани. Эффективное обогащение этих sEV является важной предпосылкой для изучения их биологической функции и ключом к разработке методов клинического обнаружения и технологии терапевтического носительства. Трудно изолировать sEV от тканей, потому что они обычно сильно загрязнены. Это исследование предоставляет метод быстрого обогащения высококачественных sEV из ткани рака печени. Метод включает в себя четырехступенчатый процесс: инкубацию пищеварительных ферментов (коллагеназы D и ДНКазы Ι) с тканью, фильтрацию через клеточный сетчатый фильтр 70 мкм, дифференциальное ультрацентрифугирование и фильтрацию через мембранный фильтр 0,22 мкм. Благодаря оптимизации стадии дифференциального ультрацентрифугирования и добавлению ступени фильтрации чистота электромобилей, полученных этим методом, выше, чем при классическом дифференциальном ультрацентрифугировании. Он предоставляет важную методологию и вспомогательные данные для изучения sEV тканевого происхождения.

Введение

Малые внеклеточные везикулы (sEV) имеют диаметр от 30 до 150 нм и секретируются различными клетками1. Они могут общаться с тканевыми клетками и регулировать локальное или отдаленное микроокружение, транспортируя важные биологические молекулы, такие как липиды, белки, ДНК и РНК, к различным органам, тканям, клеткам и внутриклеточным частям. Таким образом, они также могут изменять поведение клеток-реципиентов 2,3. Выделение и очистка специфических электромобилей является важной предпосылкой для изучения их биологического поведения во время развития и течения заболевания. Дифференциальное ультрацентрифугирование, считающееся золотым стандартом, обычно используется для отделения sEV от тканей, в которых они обычно находятся4. С помощью этого метода можно удалить тканевый мусор, клеточный мусор, крупные везикулы и апоптотические тела, оставив только sEV.

Было показано, что коллагеназа D и ДНКаза I не влияют на молекулярные характеристики клеток или везикул, при этом свойства обоих ферментов способствуют высвобождению везикул во внеклеточном матриксе 5. Эти ферменты использовались для извлечения sEV из ткани метастатической меланомы человека, ткани рака толстой кишки и ткани слизистой оболочки толстой кишки 5,6,7. Однако концентрация и время переваривания коллагеназы D и ДНКазы I в этих методах различаются, что приводит к противоречивым выводам. Чтобы избежать соосаждения других подтипов sEV, исследователи удалили более крупные внеклеточные везикулы (0,1 мкм или 0,2 мкм в диаметре) путем фильтрации и/или дифференциального центрифугирования8. В зависимости от исходной ткани могут потребоваться различные методы выделения и очистки 9,10.

Использование традиционного метода дифференциального ультрацентрифугирования для извлечения sEV из ткани печени приводит к образованию слоя белого вещества на поверхности надосадочной жидкости без какого-либо способа определения его свойств. В предыдущем исследовании11 было обнаружено, что этот слой белого вещества влияет на чистоту электромобилей. Хотя количество частиц и концентрация белка в образцах, выделенных традиционным методом, были выше, чем в современных методах, коэффициент вариации был большим, возможно, потому, что многие загрязняющие вещества могут привести к плохой повторяемости результатов. То есть, используя моющее средство (т.е. детектируя растворимость частиц в 1% Triton X-100), мы обнаружили, что чистота sEV, полученных этим методом, была больше. Следовательно, мы используем этот метод для выделения и очистки sEV, полученных из ткани колоректального рака, для протеомных исследований.

В настоящее время исследования sEVs при раке печени сосредоточены в основном на сыворотке, плазме и надосадочной жидкостиклеточной культуры 12,13,14. Тем не менее, sEV, полученные из ткани рака печени, могут более точно отражать физиологическую патологию и окружающее микроокружение рака печени и эффективно избегать деградации и загрязнения других EV15,16. С использованием дифференциального ультрацентрифугирования этот метод позволяет обогатить выход и получить высококачественные sEV, обеспечивая важную основу для дальнейшего изучения рака печени. Этот метод позволяет разделить ткань рака печени путем резкого разделения и диссоциировать коллагеназой D и ДНКазой I. Затем клеточный мусор, крупные везикулы и апоптотические тела дополнительно удаляются фильтрацией и дифференциальным ультрацентрифугированием. Наконец, sEV выделяют и очищают для последующих исследований.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Ткань рака печени человека была собрана у пациентов с диагнозом злокачественное новообразование печени в Первой дочерней больнице Медицинского университета Ганнана. Все пациенты подписали форму информированного согласия, а сбор образцов тканей человека был одобрен комитетом по этике Первой дочерней больницы Медицинского университета Ганнань. Подробные сведения обо всех материалах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов .

1. Подготовка

  1. Поместите шейкер для обесцвечивания переноса в инкубатор и установите температуру 37 °C. На рисунке 1 показано все остальное необходимое оборудование.
  2. Очистите скальпель и щипцы, сбрызнув их 75% спиртом.
  3. Приготовьте пищеварительный раствор, отмерив 6 мг коллагеназы D (4 мг/мл) и 24 мкл ДНКазы Ι (80 ЕД/мл) и добавив их к 1,5 мл основной среды RPMI-1640. Перемешивайте путем легкой инверсии до полного растворения добавок.
  4. Заранее увлажните клеточные сетчатые фильтры размером 70 мкм и 0,22 мкм физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS).
  5. Поместите 100-миллиметровую стерильную чашку для культивирования клеток на холодильник, чтобы удерживать ткани печени после размораживания.
  6. В течение 15 мин после выделения тканей гепатоцеллюлярной карциномы смыть кровь с поверхности тканевого блока PBS, перенести ткань в стерильную замороженную пробирку и хранить при -80 °C до проведения эксперимента не более 2 недель.

2. Диссоциация тканей

  1. Извлеките образец ткани из морозильной камеры при температуре -80 °C и поместите примерно 400 мг ткани, разрезанной на фрагменты размером 2 мм x 2 мм x 2 мм, в 10-сантиметровую чашку для культивирования клеток на холодильнике.
  2. Переместите ткань в 6-луночную пластину с 1,5 мл пищеварительного раствора; затем поместите пластину на шейкер для обесцвечивания переноса (20 об/мин) для инкубации в течение 20 минут при 37 ° C для полной диссоциации ткани рака печени и высвобождения sEV.
  3. Выньте 6-луночную тарелку из инкубатора и поместите ее на холодильник. Добавьте 80 мкл ингибитора фосфатазы и 200 мкл полного раствора ингибитора протеазы, чтобы остановить пищеварение.
  4. Переведите пищеварительный раствор в клеточный фильтр 70 мкм и медленно отфильтруйте его, чтобы удалить крупный тканевый мусор. Соберите фильтрат и поместите его в центрифужную пробирку объемом 2 мл.

3. Дифференциальное ультрацентрифугирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы центрифугирования при температуре 4 °C.

  1. Центрифугируйте фильтрат при 500 × г в течение 10 мин и соберите надосадочную жидкость в новую центрифужную пробирку объемом 2 мл. Затем можно удалить большую часть мелкого тканевого мусора.
  2. Центрифугируют надосадочную жидкость при 3000 × г в течение 20 мин для удаления клеточного мусора. Осторожно перенесите надосадочную жидкость в новую центрифужную пробирку до тех пор, пока кончик пипетки не коснется белого вещества на поверхности.
  3. Центрифугируют оставшуюся жидкость при 3 000 × г в течение 3 мин; Затем аспирируйте надосадочную жидкость, чтобы облегчить сбор везикул. Чтобы обеспечить чистоту электромобилей, убедитесь, что белое вещество не всасывается.
  4. Центрифугируют собранную надосадочную жидкость при дозе 12 000 × г в течение 20 мин и переносят 900 мкл надосадочной жидкости в ультрацентрифужную пробирку объемом 4,7 мл. Центрифугируют оставшуюся жидкость при 12 000 × г в течение 3 мин, а затем собирают и смешивают оба надосадочных продукта в одну и ту же ультрацентрифужную пробирку. Полностью заполните тюбик PBS.
  5. Центрифугируют надосадочные жидкости при дозе 100 000 × г в течение 60 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу, заполнив ультрацентрифужную пробирку PBS и снова центрифугируя при 100 000 × г в течение 60 мин. Ресуспендируйте гранулу 50 мкл PBS.
  6. Аспирируют суспензию sEV с помощью стерильного шприца объемом 1 мл и фильтруют ее через мембранный фильтр 0,22 мкм. Соберите фильтрат в центрифужную пробирку объемом 600 мкл и храните его при температуре -80 °C для дальнейшего анализа.

4. Оценка качества обогащения

  1. Наблюдайте за морфологией sEV под просвечивающим электронным микроскопом.
    1. Затем капните 10 мкл образца sEV на медную сетку, инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут и очистите стерильной дистиллированной водой, используя абсорбирующую бумагу для удаления лишней жидкости.
    2. Капните 10 мкл 2% уранилацетата на медную сетку для негативного окрашивания в течение 1 мин. Используйте фильтровальную бумагу, чтобы впитать жидкость на поверхности медной сетки, и высушите ее в течение 2 минут под лампой накаливания.
    3. Наблюдайте за медной сеткой под просвечивающим электронным микроскопом и изображением при 80 кВ.
  2. Используйте проточный цитометр наночастиц для определения распределения по размерам и чистоты sEV.
    1. Перед запуском машины подготовьте пробирки, содержащие 200 мкл контроля качества, 200 мкл наносфер кремнезема, 2 x 200 мкл сверхчистой воды, 2 x 200 мкл чистящего раствора и 200 мкл PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед тестированием образцов sEV необходимо провести контроль качества на приборе и проверить стандарт размера частиц (распределение по размерам должно быть рассчитано с использованием стандартных кривых, генерируемых несколькими наномикросферами разного диаметра [68-155 нм] при одном и том же условии обнаружения). Шарики контроля качества и наносферы кремнезема разбавляли в 100 раз сверхчистой водой в общем объеме 200 мкл.
    2. Проверьте объем чистящего раствора (>10 мл) и обратите внимание на разницу между уровнями жидкости оболочки и отработанной жидкости (20-30 см).
    3. Выключите основное питание прибора; Через 20 секунд включите компьютер и дождитесь звуковых сигналов, указывающих на то, что прибор правильно подключен для запуска программного обеспечения.
    4. Нажмите « Пуск », чтобы включить камеру, лазер и воздушный насос.
    5. Нажмите на кнопку «Поток оболочки-Пуск» и поместите сверхчистую воду на погрузочную платформу. Через 4 минуты (обратный отсчет инструмента) нажмите на Sample-Boosting | Выборка-выгрузка.
    6. Через 30 секунд поместите заготовку на загрузочную платформу и нажмите «Повышение пробы» | Выборка-выгрузка. Затем поместите пробирку со сверхчистой водой на грузовую платформу и одновременно нажмите « Повышение пробы» | Обтекание-продувка оболочки.
    7. Нажмите « Ручное управление» и поместите трубку для концентрации частиц на загрузочную платформу. Затем нажмите на Sample-Boosting в течение 1 минуты и одновременно выберите 250 нм Std FL SiNPs контроль качества в поле «SAMP. Инф."
    8. Нажмите на Sample-Sampling и включите детектор, нажав на SPCM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно увидеть форму сигнала в реальном времени.
    9. Нажмите « Автоматический отбор проб» и введите 1.0 в «Набор для отбора проб», чтобы зафиксировать давление на уровне 1 кПа. Нажмите на панель инструментов и выберите «Большой сигнал».
    10. Отрегулируйте горизонтальное положение лазера и установите лазер на 2 мкм; затем нажмите на L или R , чтобы убедиться, что сигнал сильный и равномерный.
    11. Нажмите « Время записи», чтобы собрать данные, которые по завершении автоматически перейдут в буфер. Затем сохраните данные в файле Naf и нажмите «Sample-Unload».
    12. Поместите пробирку с чистящим раствором на загрузочную платформу, нажмите « Повышение пробы», а через 1 минуту нажмите « Выгрузка пробы». Используйте сверхчистую воду, чтобы удалить остатки чистящего раствора с наконечника капилляра.
    13. Поместите стандартную пробирку размером частиц на загрузочную платформу и нажмите « Повышение пробы » в течение 1 минуты.
    14. Выберите 68-155 нм Std FL SiNPs контроля качества в разделе «SAMP. Inf» и нажмите « Sample-Sampling». Затем нажмите на панель инструментов и выберите «Маленький сигнал».
    15. Нажмите « Время записи», чтобы собрать данные, которые по завершении автоматически перейдут в буфер . Затем сохраните данные в файле Naf и нажмите «Sample-Unload».
    16. Поместите пробирку с чистящим раствором на загрузочную платформу, нажмите « Повышение пробы» и нажмите « Выгрузка пробы через 1 минуту». Используйте сверхчистую воду, чтобы удалить остатки чистящего раствора с наконечника капилляра.
    17. Поместите трубу PBS на грузовую платформу; нажмите на Sample-Boosting в течение 1 минуты.
    18. Выберите 68-155 нм Std FL SiNPs контроля качества в разделе «SAMP. Inf» и нажмите « Sample-Sampling». Затем нажмите на панель инструментов и выберите «Маленький сигнал».
    19. Нажмите « Время записи», чтобы собрать данные, которые по завершении автоматически перейдут в буфер . Сохраните данные в файле Naf и нажмите «Sample-Unload».
    20. Поместите трубку с чистящим раствором на загрузочную платформу, нажмите « Повышение пробы » и « Выгрузка образца» через 1 минуту. Используйте сверхчистую воду, чтобы удалить остатки чистящего раствора с наконечника капилляра.
    21. Проверьте информацию об образце, как описано ранее в шагах 4.2.17-4.2.20; измените PBS (этап 4.2.17) на образец sEV и проанализируйте данные.
  3. Далее идентифицируйте sEV по вестерн-блоттингу.
    1. Определите концентрацию белка в sEV и тканях с помощью набора для количественного определения белка BCA в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Рассчитайте объем загрузки sEV (например, для 5 мкг белка на лунку) на основе этих количественных результатов. Добавьте загрузочный буфер в соотношении 1:4 и перемешайте смесь.
    3. После денатурации в металлической ванне с температурой 100 °C (сухой термостат) в течение 10 мин отделяют белок на 12% полиакриламидном геле при 60 В в течение 80 мин.
    4. Перенесите гель на мембрану поливинилидендифторида 0,22 мкм при 220 мА в течение 2 ч с использованием буфера для переноса (25 мМ Tris, 192 мМ глицина, 20% метанола).
    5. Заблокируйте мембрану 5% обезжиренным сухим молоком в трис-буферизованном физиологическом растворе Tween (TBST) на 1 ч при комнатной температуре и инкубируйте с первичным антителом (моноклональное антитело CD9 кролика, моноклональное антитело CD63 кролика, моноклональное антитело TSG101 кролика, моноклональное антитело против человека GM130 мыши) на ночь при температуре 4 ° C. Разбавьте первичные антитела в 5% обезжиренном молоке в соотношении 1:1000.
    6. После трех промывок TBST инкубируйте мембрану с конъюгированным вторичным антителом пероксидазы хрена (HRP) при комнатной температуре в течение 1 часа.
    7. Определите антитело, связанное с HRP, с помощью субстрата для блоттинга ECL, а затем соберите и проанализируйте изображения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

sEV из тканей рака печени человека сыграли решающую роль в диагностике, лечении и прогнозе пациентов с раком печени. В этом методе использовались обычные лабораторные инструменты для выделения и очистки sEV, полученных из тканей рака печени; это может обеспечить методологическую поддерж?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол описывает воспроизводимый метод извлечения sEV из ткани рака печени. Высококачественные sEV получают путем резкой изоляции тканей, обработки пищеварительными ферментами, дифференциального ультрацентрифугирования, а также фильтрации и очистки фильтрующей мембраны 0,22 мкм....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят Первую дочернюю больницу Медицинского университета Ганнань за поддержку этой работы. Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (грант No 82260422).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm Membrane Filter UnitMillexSLGPR33RB
1 mL Sterile syringeHubei Xianming Medical Instrument CompanyYL01329
2% Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400-2
4.7 mL Centrifuge TubeBeckman Coulter361621
6-well Cell cuture plateLABSELECT11110
50 mL BeakerTianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales CompanyCF2100800
70 µm Cell strainerBiosharpBS-70-XBS
100 mm Cell culture dishCELL TERCS016-0128
600 µL Centrifuge tubeAxygenMCT060C
BCA protein quantification kitThermo FisherRJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TLBeckman A95761
BioRad Mini trans-blotBio-Rad1703930
BioRad Mini-ProteanBio-Rad1645050
CD63 AntibodyAbcamab134045
CD9 AntibodyAbcamab263019
Centrifuge 5430REppendorf5428HQ527333
Cleaning SolutionNanoFCMC1801
Collagenase DRoche11088866001
Copper netHenan Zhongjingkeyi Technology CompanyDJZCM-15-N1
Dry ThermostatHangzhou allsheng instruments companyAS-01030-00
FITC Anti Human CD9 AntibodyElabscienceE-AB-F1086C
GlycineSolarbioG8200
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody ProteintechSA00001-1
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody ProteintechSA00001-2
MethanolShanghai Zhenxing Chemical Company
Nanoparticle flow cytometerNanoFCM INCFNAN30E20112368
Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)Roche4906845001
Phosphate Buffered Saline(PBS)ServicebioG4202
Polyvinylidene Difluoride MembraneSolarbioISEQ00010
QC BeadsNanoFCMQS2502
RPMI-1640 basic mediumBiological Industries C11875500BT
ScalpelGuangzhou Kehua Trading CompanyNN-0623-1
Silica NanospheresNanoFCMS16M-Exo
Transference Decoloring Shaker TS-8Kylin-BellE0018
Transmission Electron MicroscopeThermo ScientificTalos L120C
TrisSolarbioT8060
TSG101 AntibodyProteintech28283-1-AP
TweezerGuangzhou Lige Technology CompanyLG01-105-4X

Ссылки

  1. Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
  2. Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).
  3. Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
  4. Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
  5. Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).
  6. Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).
  7. Jang, S. C., et al. Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420(2019).
  8. Muralidharan-Chari, V., et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).
  9. Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle. FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).
  10. Zhou, X., et al. Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice. Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).
  11. Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).
  12. Fang, T., et al. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).
  13. Huang, X., et al. RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma. Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).
  14. Chen, L., et al. HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway. Cell Death & Disease. 9 (5), 513(2018).
  15. Jingushi, K., et al. Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin. International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).
  16. Camino, T., et al. Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены