肝癌组织来源于小细胞外囊泡的富集方法

摘要

在这里，我们描述了通过优化的差分超速离心方法富集来自肝癌组织的小细胞外囊泡。

摘要

来源于组织的小细胞外囊泡（sEV）可以反映源细胞的功能状态和组织间质空间的特征。这些sEVs的高效富集是研究其生物学功能的重要前提，也是临床检测技术和治疗载体技术发展的关键。很难从组织中分离出sEV，因为它们通常受到严重污染。本研究提供了一种从肝癌组织中快速富集高质量sEV的方法。该方法涉及一个四步过程:消化酶（胶原酶D和DNase Ι）与组织的孵育，通过70μm细胞过滤器过滤，差分超速离心，并通过0.22μm膜过滤器过滤。由于差示超速离心步骤的优化和过滤步骤的加入，该方法获得的sEV纯度高于经典差示超速离心。它为组织来源的sEV研究提供了重要的方法和支持数据。

引言

小细胞外囊泡（sEV）的直径约为30nm至150nm，由各种细胞分泌¹。它们可以与组织细胞交流，通过将重要的生物分子（如脂质、蛋白质、DNA 和 RNA）运送到各种器官、组织、细胞和细胞内部分来调节局部或远处的微环境。因此，它们还可以改变受体细胞^2，3的行为。特定sEV的分离和纯化是研究其在疾病发展和过程中的生物学行为的重要先决条件。差速超速离心 - 被视为金标准 - 通常用于将sEV与其^{通常所在的组织}分离4。组织碎片、细胞碎片、大囊泡和凋亡小体可以通过这种技术去除，只留下sEV。

胶原酶D和DNase I已被证明不会影响细胞或囊泡的分子特征，这两种酶的特性都有助于细胞外基质中囊泡的释放⁵。这些酶已用于从人转移性黑色素瘤组织、结肠癌组织和结肠粘膜组织中提取 sEV⁵，^6，7。然而，这些方法中胶原酶D和DNase I的浓度和消化时间不同，导致结论不一致。为了避免其他sEV亚型的共沉淀，研究人员通过过滤和/或差速离心去除了较大的细胞外囊泡（直径0.1μm或0.2μm8^）。根据来源组织的不同，可能需要不同的分离和纯化方法^9，10。

使用传统的差示超速离心方法从肝组织中提取sEV会在上清液表面形成一层白质，而无法确定其性质。在之前的研究¹¹中，发现这层白质会影响sEV的纯度。虽然传统方法分离的样品颗粒数和蛋白质浓度高于现有方法，但变异系数较大，可能是因为许多污染物会导致结果的重复性差。也就是说，使用洗涤剂（即检测颗粒在1%Triton X-100中的溶解度），我们发现通过这种方法获得的sEV的纯度更高。因此，我们使用这种方法分离和纯化来自结直肠癌组织的sEV，用于蛋白质组学研究。

目前，sEVs在肝癌中的研究主要集中在血清、血浆和细胞培养物的上清液¹²，^13，14上。然而，来源于肝癌组织的sEV可以更准确地反映肝癌的生理病理和周围微环境，有效避免其他EV的降解和污染^15，16。利用差示超速离心，该方法可富产率，获得高质量的sEVs，为肝癌的进一步研究提供重要依据。该方法使肝癌组织能够通过尖锐分离分离，并通过胶原酶D和DNase I解离。然后，通过过滤和差示超速离心进一步去除细胞碎片、大囊泡和凋亡小体。最后，分离并纯化sEV以供后续研究。

研究方案

从甘南医科大学附属第一医院诊断为肝恶性肿瘤的患者中采集人肝癌组织。所有患者均签署知情同意书，人体组织样本采集经甘南医科大学第一附属医院伦理委员会批准。有关此协议中使用的所有材料、设备和软件的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 准备

1. 将转移脱色摇床放入培养箱中，并将温度设置为37°C。 有关所有其他所需设备，请参见 图 1 。
2. 用 75% 的酒精喷洒手术刀和镊子来清洁它们。
3. 通过测量 6 mg 胶原酶 D （4 mg/mL） 和 24 μL 脱氧核糖核酸酶 Ι （80 U/mL） 并将它们添加到 1.5 mL RPMI-1640 碱性培养基中来制备消化溶液。轻轻倒置混合，直到添加剂完全溶解。
4. 事先，用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）润湿70μm和0.22μm细胞过滤器。
5. 将100毫米无菌细胞培养皿放在冰箱上，以在解冻后保持肝组织。
6. 在肝细胞癌组织分离后15分钟内，用PBS冲洗掉组织块表面的血液，将组织转移到无菌冷冻管中，并将其储存在-80°C直至实验不超过2周。

2. 组织解离

1. 从-80°C冰箱中取出组织样品，并将约400mg的组织切成2mm x 2 mm x 2mm片段 - 放入冰盒上的10cm细胞培养皿中。
2. 将组织移动到装有 1.5 mL 消化溶液的 6 孔板中;然后，将板放在转移脱色摇床（20rpm / min）上，在37°C下孵育20分钟，以完全解离肝癌组织并释放sEV。
3. 从培养箱中取出 6 孔板并将其放在冰箱上。加入 80 μL 磷酸酶抑制剂和 200 μL 完全蛋白酶抑制剂溶液以停止消化。
4. 将消化溶液转移到70μm细胞过滤器中并缓慢过滤以去除任何大的组织碎片。收集滤液并将其放入 2 mL 离心管中。

3. 差示超速离心

注意:在4°C下执行所有离心步骤。

1. 将滤液以500× g 离心10分钟，并将上清液收集在新的2 mL离心管中。然后可以去除大多数小组织碎片。
2. 将上清液以3，000× g 离心20分钟以除去细胞碎片。小心地将上清液转移到新的离心管中，直到移液器的尖端即将接触表面上的白色物质。
3. 将剩余的液体以3，000×g离心3分钟;然后，吸出上清液以促进囊泡的收集。为确保sEV的纯度，请确保不吸入白色物质。
4. 将收集的上清液以 12，000 × g 离心 20 分钟，并将 900 μL 上清液转移到 4.7 mL 超速离心管中。将剩余的液体以12，000× g 离心3分钟，然后将两种上清液收集并混合到同一超速离心管中。用PBS完全填充管子。
5. 将上清液以100，000× g 离心60分钟。弃去上清液并通过用PBS填充超速离心管并再次以100，000 ×g 离心60分钟来重悬沉淀。用 50 μL PBS 重悬沉淀。
6. 使用 1 mL 无菌注射器吸出 sEV 悬浮液，并通过 0.22 μm 膜过滤器过滤。将滤液收集在600μL离心管中，并将其储存在-80°C下进行进一步分析。

4. 富集质量评价

1. 在透射电子显微镜下观察sEV的形态。
   1. 然后，将 10 μL sEV 样品滴到铜网上，在室温下孵育 10 分钟，并用无菌蒸馏水清洁，使用吸收纸去除多余的液体。
   2. 将 10 μL 2% 乙酸铀酰滴到铜网上进行阴性染色 1 分钟。使用滤纸吸收铜网表面的液体，并在白炽灯下干燥2分钟。
   3. 在透射电子显微镜下观察铜网并在80 kV下成像。
2. 使用纳米颗粒流式细胞仪确定sEV的尺寸分布和纯度。
   1. 在机器启动之前，准备含有 200 μL 质量控制、200 μL 二氧化硅纳米球、2 x 200 μL 超纯水、2 x 200 μL 清洁溶液和 200 μL PBS 的管。
      注意:在测试sEV样品之前，有必要对仪器进行质量控制并测试粒度标准（尺寸分布必须使用在相同检测条件下由多个不同直径[68-155nm]的纳米微球生成的标准曲线计算）。将QC珠和二氧化硅纳米球用超纯水稀释100倍，总体积为200 μL。
   2. 检查清洁溶液的体积（>10毫升），并注意护套液和废液（20-30厘米）的水平之间的差异。
   3. 关闭仪器的主电源;20 秒后，打开计算机并等待蜂鸣声，表示仪器已正确连接以运行软件。
   4. 单击 启动 以打开相机、激光器和气泵。
   5. 点击 护套流启动，将超纯水放在装载平台上。4 分钟后（仪器倒计时），单击 样品增强 |样品卸载。
   6. 30 秒后，将空白管放在装载平台上，然后单击 样品提升 |样品卸载。然后，将装有超纯水的试管放在装载平台上，同时单击样品 增强 |护套流吹扫。
   7. 单击 手动操作 并将颗粒浓缩管放在装载平台上。然后，单击 样品增强 1 分钟，同时在"SAMP "中选择 250 nm 标准 FL SiNPs 质量控制。Inf."
   8. 单击 "采样 "，然后单击" SPCM"打开检测器。
      注意:此时，可以看到实时信号波形。
   9. 单击自动采样并在采样 SET 中输入 1.0，将压力固定为 1 KPa。单击工具栏并选择大信号。
   10. 调整激光器的水平位置并将激光器设置为 2μm;然后，单击 L 或 R 以确保信号强且均匀。
   11. 单击" 记录时间 "以收集数据，完成后将自动跳转到缓冲区。然后，将数据保存在 Naf 文件中并单击 "采样卸载"。
   12. 将清洁溶液管放在上样平台上，单击样品 提升，1分钟后，单击 样品卸载。使用超纯水从毛细管尖端去除残留的清洁溶液。
   13. 将颗粒大小的标准管放在装载平台上，然后单击样品 提升 1分钟。
   14. 在"SAMP "中选择 68-155 nm 标准 FL SiNPs 质量控制。Inf"，然后单击 "样本采样"。然后，单击 工具栏 并选择 小信号。
   15. 单击" 记录时间 "以收集数据，完成后将自动跳转到 缓冲区 。然后，将数据保存在 Naf 文件中并单击 "采样卸载"。
   16. 将清洁溶液管放在装载平台上，单击样品 提升，1分钟后单击 样品卸载 。使用超纯水从毛细管尖端去除残留的清洁溶液。
   17. 将PBS管放在装载平台上;单击 样品提升 1 分钟。
   18. 在"SAMP "中选择 68-155 nm 标准 FL SiNPs 质量控制。Inf"，然后单击 "样本采样"。然后，单击 工具栏 并选择 小信号。
   19. 单击" 记录时间 "以收集数据，完成后将自动跳转到 缓冲区 。将数据保存在 Naf 文件中，然后单击 "采样卸载"。
   20. 将清洁溶液管放在装载平台上，1分钟后单击样品 提升 和 样品卸载 。使用超纯水去除毛细管尖端残留的清洁溶液。
   21. 按照前面的步骤 4.2.17-4.2.20 中所述检查示例信息;将PBS（步骤4.2.17）更改为sEV样品并分析数据。
3. 通过蛋白质印迹进一步鉴定sEV。
   1. 根据制造商的说明，使用 BCA 蛋白质定量试剂盒确定 sEV 和组织的蛋白质浓度。
   2. 根据这些定量结果计算sEV的上样体积（例如，每孔5μg蛋白质）。以 1:4 的比例加入上样缓冲液并涡旋混合物。
   3. 在100°C金属浴（干恒温器）中变性10分钟后，在60V下将蛋白质在12%聚丙烯酰胺凝胶上分离80分钟。
   4. 使用转印缓冲液（25mM Tris，192mM甘氨酸，20%甲醇）将凝胶以220mA转移到0.22μm聚偏二氟乙烯膜上2小时。
   5. 在室温下用Tris缓冲盐水吐温（TBST）中的5%脱脂奶粉封闭膜1小时，并与一抗（兔单克隆抗人CD9抗体，兔单克隆抗人CD63抗体，兔单克隆抗人TSG101抗体，小鼠单克隆抗人GM130抗体）在4°C孵育过夜。 将一抗在 5% 脱脂牛奶中以 1:1，000 的比例稀释。
   6. 用TBST洗涤三次后，将膜与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗在室温下孵育1小时。
   7. 使用ECL印迹底物检测HRP连接的抗体，然后收集和分析图像。

结果

来自人肝癌组织的sEV在肝癌患者的诊断、治疗和预后中发挥了至关重要的作用。该方法使用普通的实验室仪器分离和纯化来自肝癌组织的sEV;这可能为sEV的研究提供方法学支持。图2说明了从肝癌组织中富集sEV的一般过程。组织细胞间隙中的sEV通过组织切割和酶水解完全释放。此外，消化溶液通过70μm过滤器过滤以去除大的组织碎片。此外，进行差速离心步骤（500 × g、3...

讨论

该协议描述了从肝癌组织中提取sEV的可重复方法。通过尖锐的组织分离、消化酶处理、差示超速离心和 0.22 μm 滤膜过滤和纯化获得高质量的 sEV。对于下游分析，确保sEV的高纯度非常重要。在差速离心过程中，上清液表面会出现一层白色物质（成分不明）。由于该层会污染sEV，我们通过重复离心（3，000 × g 和12，000 × g）并通过0.22 μm膜过滤（补充表S1）尽可能去除它。由...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Membrane Filter Unit	Millex	SLGPR33RB
1 mL Sterile syringe	Hubei Xianming Medical Instrument Company	YL01329
2% Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400-2
4.7 mL Centrifuge Tube	Beckman Coulter	361621
6-well Cell cuture plate	LABSELECT	11110
50 mL Beaker	Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company	CF2100800
70 µm Cell strainer	Biosharp	BS-70-XBS
100 mm Cell culture dish	CELL TER	CS016-0128
600 µL Centrifuge tube	Axygen	MCT060C
BCA protein quantification kit	Thermo Fisher	RJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TL	Beckman	A95761
BioRad Mini trans-blot	Bio-Rad	1703930
BioRad Mini-Protean	Bio-Rad	1645050
CD63 Antibody	Abcam	ab134045
CD9 Antibody	Abcam	ab263019
Centrifuge 5430R	Eppendorf	5428HQ527333
Cleaning Solution	NanoFCM	C1801
Collagenase D	Roche	11088866001
Copper net	Henan Zhongjingkeyi Technology Company	DJZCM-15-N1
Dry Thermostat	Hangzhou allsheng instruments company	AS-01030-00
FITC Anti Human CD9 Antibody	Elabscience	E-AB-F1086C
Glycine	Solarbio	G8200
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody	Proteintech	SA00001-1
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody	Proteintech	SA00001-2
Methanol	Shanghai Zhenxing Chemical Company
Nanoparticle flow cytometer	NanoFCM INC	FNAN30E20112368
Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)	Roche	4906845001
Phosphate Buffered Saline(PBS)	Servicebio	G4202
Polyvinylidene Difluoride Membrane	Solarbio	ISEQ00010
QC Beads	NanoFCM	QS2502
RPMI-1640 basic medium	Biological Industries	C11875500BT
Scalpel	Guangzhou Kehua Trading Company	NN-0623-1
Silica Nanospheres	NanoFCM	S16M-Exo
Transference Decoloring Shaker TS-8	Kylin-Bell	E0018
Transmission Electron Microscope	Thermo Scientific	Talos L120C
Tris	Solarbio	T8060
TSG101 Antibody	Proteintech	28283-1-AP
Tweezer	Guangzhou Lige Technology Company	LG01-105-4X