Eine Anreicherungsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel aus Leberkrebsgewebe

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Anreicherung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Leberkrebsgewebe durch eine optimierte differentielle Ultrazentrifugationsmethode.

Zusammenfassung

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs), die aus Gewebe gewonnen werden, können den funktionellen Status der Quellzellen und die Eigenschaften des interstitiellen Raums des Gewebes widerspiegeln. Die effiziente Anreicherung dieser sEVs ist eine wichtige Voraussetzung für die Untersuchung ihrer biologischen Funktion und ein Schlüssel für die Entwicklung klinischer Nachweistechniken und therapeutischer Trägertechnologien. Es ist schwierig, sEVs aus Gewebe zu isolieren, da sie in der Regel stark kontaminiert sind. Diese Studie liefert eine Methode zur schnellen Anreicherung von hochwertigen sEVs aus Leberkrebsgewebe. Das Verfahren umfasst einen vierstufigen Prozess: die Inkubation von Verdauungsenzymen (Kollagenase D und DNase Ι) mit Gewebe, die Filtration durch ein 70-μm-Zellsieb, die differentielle Ultrazentrifugation und die Filtration durch einen 0,22-μm-Membranfilter. Aufgrund der Optimierung des differentiellen Ultrazentrifugationsschritts und der Hinzufügung eines Filtrationsschritts ist die Reinheit der mit diesem Verfahren erhaltenen sEVs höher als diejenige, die durch die klassische differentielle Ultrazentrifugation erreicht wird. Es liefert eine wichtige Methodik und unterstützende Daten für die Untersuchung von aus Gewebe gewonnenen sEVs.

Einleitung

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) haben einen Durchmesser von etwa 30 nm bis 150 nm und werden von verschiedenen Zellen^{sezerniert 1}. Sie können mit Gewebezellen kommunizieren und die lokale oder entfernte Mikroumgebung regulieren, indem sie wichtige biologische Moleküle wie Lipide, Proteine, DNA und RNA zu verschiedenen Organen, Geweben, Zellen und intrazellulären Teilen transportieren. Somit können sie auch das Verhalten von Empfängerzellen ^2,3 verändern. Die Isolierung und Aufreinigung spezifischer sEVs ist eine wesentliche Voraussetzung, um ihr biologisches Verhalten während der Entstehung und des Krankheitsverlaufs zu untersuchen. Die differentielle Ultrazentrifugation, die als Goldstandard gilt, wird häufig verwendet, um sEVs von den Geweben zu trennen, in denen sie sich normalerweise befinden⁴. Gewebetrümmer, Zelltrümmer, große Vesikel und apoptotische Körper können mit dieser Technik entfernt werden, so dass nur die sEVs übrig bleiben.

Es wurde gezeigt, dass Kollagenase D und DNase I die molekularen Eigenschaften von Zellen oder Vesikeln nicht beeinflussen, wobei die Eigenschaften beider Enzyme zur Freisetzung von Vesikeln in der extrazellulären Matrix beitragen ⁵. Diese Enzyme wurden verwendet, um sEVs aus menschlichem metastasiertem Melanomgewebe, Darmkrebsgewebe und Dickdarmschleimhautgewebe zu extrahieren ^5,6,7. Die Konzentration und Verdauungszeit von Kollagenase D und DNase I in diesen Methoden unterscheiden sich jedoch, was zu widersprüchlichen Schlussfolgerungen führt. Um die Kopräzipitation anderer Subtypen von sEVs zu vermeiden, haben Forscher größere extrazelluläre Vesikel (0,1 μm oder 0,2 μm Durchmesser) durch Filtration und/oder differentielle Zentrifugation entfernt⁸. Je nach Ausgangsgewebe können unterschiedliche Methoden der Isolierung und Reinigung erforderlich sein ^9,10.

Die Verwendung der traditionellen differentiellen Ultrazentrifugationsmethode zur Extraktion von sEVs aus Lebergewebe führt zu einer Schicht weißer Substanz auf der Oberfläche des Überstandes, ohne dass seine Eigenschaften bestimmt werden können. In einer früheren Studie¹¹ wurde festgestellt, dass diese Schicht der weißen Substanz die Reinheit der sEVs beeinflusst. Obwohl die Partikelanzahl und die Proteinkonzentration der mit der traditionellen Methode isolierten Proben höher waren als die der aktuellen Methode, war der Variationskoeffizient groß, möglicherweise weil viele Schadstoffe zu einer schlechten Wiederholbarkeit der Ergebnisse führen können. Das heißt, unter Verwendung von Detergens (d.h. Nachweis der Löslichkeit von Partikeln in 1% Triton X-100) stellten wir fest, dass die Reinheit der mit dieser Methode erhaltenen sEVs größer war. Daher verwenden wir diese Methode, um sEVs aus Darmkrebsgewebe für die Proteomforschung zu isolieren und zu reinigen.

Gegenwärtig konzentriert sich die Forschung zu sEVs bei Leberkrebs hauptsächlich auf Serum, Plasma und den Überstand der Zellkultur^12,13,14. Aus Leberkrebsgewebe gewonnene sEVs können jedoch die physiologische Pathologie und die umgebende Mikroumgebung von Leberkrebs genauer widerspiegeln und den Abbau und die Verschmutzung anderer EVs wirksam verhindern^15,16. Durch den Einsatz der differentiellen Ultrazentrifugation kann diese Methode die Ausbeute anreichern und qualitativ hochwertige sEVs erhalten, was eine wichtige Grundlage für die weitere Untersuchung von Leberkrebs darstellt. Diese Methode ermöglicht es, das Leberkrebsgewebe durch scharfe Trennung zu trennen und durch Kollagenase D und DNase I zu dissoziieren. Dann werden die zellulären Trümmer, großen Vesikel und apoptotischen Körper durch Filtration und differentielle Ultrazentrifugation weiter entfernt. Schließlich werden die sEVs isoliert und für spätere Studien gereinigt.

Protokoll

Menschliches Leberkrebsgewebe wurde von Patienten gesammelt, bei denen im First Affiliated Hospital der Gannan Medical University eine maligne Lebererkrankung diagnostiziert wurde. Alle Patienten unterschrieben eine Einverständniserklärung, und die Entnahme von menschlichen Gewebeproben wurde von der Ethikkommission des First Affiliated Hospital der Gannan Medical University genehmigt. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Vorbereitung

1. Stellen Sie den Transferentfärbungsschüttler in den Inkubator und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein. Siehe Abbildung 1 für alle anderen benötigten Geräte.
2. Reinigen Sie das Skalpell und die Pinzette, indem Sie sie mit 75% Alkohol besprühen.
3. Bereiten Sie die Verdauungslösung vor, indem Sie 6 mg Kollagenase D (4 mg/ml) und 24 μl DNase Ι (80 U/ml) messen und zu 1,5 ml RPMI-1640-Basismedium hinzufügen. Durch leichtes Umdrehen mischen, bis sich die Zusätze vollständig aufgelöst haben.
4. Vorab 70 μm und 0,22 μm Zellsiebe mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) befeuchten.
5. Stellen Sie eine 100 mm sterile Zellkulturschale auf die Kühlbox, um das Lebergewebe nach dem Auftauen zu halten.
6. Spülen Sie innerhalb von 15 Minuten nach der Isolierung des hepatozellulären Karzinomgewebes das Blut auf der Oberfläche des Gewebeblocks mit PBS ab, übertragen Sie das Gewebe in ein steriles gefrorenes Röhrchen und lagern Sie es bis zum Experiment bei -80 ° C für nicht mehr als 2 Wochen.

2. Gewebe-Dissoziation

1. Die Gewebeprobe wird aus dem Gefrierschrank bei −80 °C entnommen und ca. 400 mg des in 2 mm x 2 mm x 2 mm große Fragmente geschnittenen Gewebes in die 10 cm große Zellkulturschale auf dem Eisfach gegeben.
2. Bewegen Sie das Gewebe in eine 6-Well-Platte mit 1,5 ml der Verdauungslösung; Legen Sie dann die Platte auf den Übertragungsentfärbungsschüttler (20 U / min), um sie 20 Minuten lang bei 37 °C zu inkubieren, um das Leberkrebsgewebe vollständig zu dissoziieren und die sEVs freizusetzen.
3. Nehmen Sie die 6-Well-Platte aus dem Inkubator und stellen Sie sie auf die Kühlbox. Fügen Sie 80 μl Phosphatase-Inhibitor und 200 μl vollständige Proteasehemmer-Lösung hinzu, um die Verdauung zu stoppen.
4. Übertragen Sie die Verdauungslösung in das 70-μm-Zellsieb und filtern Sie sie langsam, um große Gewebereste zu entfernen. Sammeln Sie das Filtrat und geben Sie es in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen.

3. Differentielle Ultrazentrifugation

HINWEIS: Führen Sie alle Zentrifugationsschritte bei 4 °C durch.

1. Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 500 × g für 10 min und sammeln Sie den Überstand in einem neuen 2 mL Zentrifugenröhrchen. Die meisten kleinen Gewebereste können dann entfernt werden.
2. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 3.000 × g für 20 Minuten, um Zelltrümmer zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues Zentrifugenröhrchen, bis die Spitze der Pipette im Begriff ist, die weiße Substanz auf der Oberfläche zu berühren.
3. Zentrifugieren Sie die restliche Flüssigkeit bei 3.000 × g für 3 min; Dann saugen Sie den Überstand ab, um das Sammeln von Vesikeln zu erleichtern. Um die Reinheit der sEVs zu gewährleisten, ist darauf zu achten, dass die weiße Substanz nicht abgesaugt wird.
4. Zentrifugieren Sie den gesammelten Überstand bei 12.000 × g für 20 min und überführen Sie 900 μl des Überstands in ein 4,7-ml-Ultrazentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die restliche Flüssigkeit bei 12.000 × g für 3 min und sammeln und mischen Sie dann beide Überstände in demselben Ultrazentrifugenröhrchen. Füllen Sie das Röhrchen vollständig mit PBS.
5. Die Überstände werden bei 100.000 × g 60 min zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie das Ultrazentrifugenröhrchen mit PBS füllen und erneut bei 100.000 × g für 60 min zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Pellet mit 50 μl PBS.
6. Die sEV-Suspension wird mit einer sterilen 1-ml-Spritze abgesaugt und durch einen 0,22-μm-Membranfilter filtriert. Sammeln Sie das Filtrat in einem 600-μl-Zentrifugenröhrchen und lagern Sie es zur weiteren Analyse bei -80 °C.

4. Bewertung der Anreicherungsqualität

1. Beobachten Sie die Morphologie der sEVs unter einem Transmissionselektronenmikroskop.
   1. Lassen Sie dann 10 μl der sEV-Probe auf ein Kupfernetz fallen, inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur und reinigen Sie sie mit sterilem destilliertem Wasser, wobei Sie absorbierendes Papier verwenden, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
   2. Lassen Sie 10 μl 2% Uranylacetat auf das Kupfernetz fallen, um sie 1 Minute lang negativ zu färben. Verwenden Sie Filterpapier, um die Flüssigkeit auf der Oberfläche des Kupfernetzes aufzusaugen, und trocknen Sie es 2 Minuten lang unter einer Glühlampe.
   3. Beobachten Sie das Kupfergewebe unter einem Transmissionselektronenmikroskop und bilden Sie es bei 80 kV ab.
2. Verwenden Sie ein Nanopartikel-Durchflusszytometer, um die Größenverteilung und Reinheit der sEVs zu bestimmen.
   1. Bevor die Maschine gestartet wird, bereiten Sie Röhrchen vor, die 200 μl Qualitätskontrolle, 200 μl Siliziumdioxid-Nanokugeln, 2 x 200 μl Reinstwasser, 2 x 200 μl Reinigungslösung und 200 μl PBS enthalten.
      HINWEIS: Vor dem Testen der sEV-Proben ist es notwendig, eine Qualitätskontrolle am Gerät durchzuführen und den Partikelgrößenstandard zu testen (die Größenverteilung muss anhand von Standardkurven berechnet werden, die mit mehreren Nanomikrokugeln unterschiedlicher Durchmesser [68-155 nm] unter der gleichen Nachweisbedingung erzeugt werden). QC-Kügelchen und Siliziumdioxid-Nanokügelchen wurden 100-fach mit Reinstwasser in einem Gesamtvolumen von 200 μl verdünnt.
   2. Überprüfen Sie das Volumen der Reinigungslösung (>10 ml) und notieren Sie die Differenz zwischen den Füllständen der Mantelflüssigkeit und der Abfallflüssigkeit (20-30 cm).
   3. Schalten Sie die Hauptstromversorgung des Instruments aus. Schalten Sie den Computer nach 20 Sekunden ein und warten Sie, bis die Pieptöne anzeigen, die anzeigen, dass das Gerät ordnungsgemäß angeschlossen ist, um die Software auszuführen.
   4. Klicken Sie auf Start, um die Kamera, den Laser und die Luftpumpe einzuschalten.
   5. Klicken Sie auf Sheath Flow-Start Up und geben Sie Reinstwasser auf die Ladefläche. Nach 4 Minuten (Countdown des Instruments) klicken Sie auf Sample-Boosting | Probe-Entladen.
   6. Legen Sie das leere Röhrchen nach 30 s auf die Ladefläche und klicken Sie auf Sample-Boosting | Probe-Entladen. Stellen Sie dann das Röhrchen mit dem Reinstwasser auf die Ladefläche und klicken Sie gleichzeitig auf Sample-Boosting | Mantel-Strömungsspülung.
   7. Klicken Sie auf Manuelle Bedienung und stellen Sie das Partikelkonzentrationsrohr auf die Ladefläche. Klicken Sie dann für 1 Minute auf Sample-Boosting und wählen Sie gleichzeitig die Qualitätskontrolle von 250 nm Std FL SiNPs in "SAMP. Inf."
   8. Klicken Sie auf Sample-Sampling und schalten Sie den Detektor ein, indem Sie auf SPCM klicken.
      HINWEIS: An diesem Punkt ist die Echtzeit-Signalwellenform zu sehen.
   9. Klicken Sie auf Auto Sampling und geben Sie 1.0 in Sampling SET ein, um den Druck auf 1 KPa zu fixieren. Klicken Sie auf die Symbolleiste und wählen Sie Großes Signal.
   10. Stellen Sie die horizontale Position des Lasers ein und stellen Sie den Laser auf 2 μm ein. Klicken Sie dann auf L oder R , um sicherzustellen, dass das Signal stark und gleichmäßig ist.
   11. Klicken Sie auf Time to Record , um die Daten zu sammeln, die nach Abschluss automatisch in den Puffer springen. Speichern Sie dann die Daten in einer Naf-Datei und klicken Sie auf Sample-Unload.
   12. Legen Sie das Reinigungslösungsrohr auf die Ladeplattform, klicken Sie auf Sample-Boosting und nach 1 Minute auf Sample-Unload. Verwenden Sie Reinstwasser, um die restliche Reinigungslösung von der Kapillarspitze zu entfernen.
   13. Legen Sie das partikelgroße Standardröhrchen auf die Ladefläche und klicken Sie für 1 Minute auf Sample-Boosting .
   14. Wählen Sie die Qualitätskontrolle von 68-155 nm Std FL SiNPs in "SAMP. Inf" und klicken Sie auf Sample-Sampling. Klicken Sie dann auf die Symbolleiste und wählen Sie Kleines Signal.
   15. Klicken Sie auf Time to Record , um die Daten zu sammeln, die nach Abschluss automatisch in den Puffer springen. Speichern Sie dann die Daten in einer Naf-Datei und klicken Sie auf Sample-Unload.
   16. Legen Sie das Reinigungslösungsröhrchen auf die Ladefläche, klicken Sie auf Sample-Boosting und klicken Sie nach 1 Minute auf Sample-Unload . Verwenden Sie Reinstwasser, um die restliche Reinigungslösung von der Kapillarspitze zu entfernen.
   17. Legen Sie das PBS-Rohr auf die Ladefläche. Klicken Sie für 1 Minute auf Sample-Boosting .
   18. Wählen Sie die Qualitätskontrolle von 68-155 nm Std FL SiNPs in "SAMP. Inf" und klicken Sie auf Sample-Sampling. Klicken Sie dann auf die Symbolleiste und wählen Sie Kleines Signal.
   19. Klicken Sie auf Time to Record , um Daten zu sammeln, die nach Abschluss automatisch in den Puffer springen. Speichern Sie die Daten in einer Naf-Datei und klicken Sie auf Sample-Unload.
   20. Stellen Sie das Reinigungslösungsrohr auf die Ladefläche, klicken Sie nach 1 min auf Sample-Boosting und Sample-Unload. Verwenden Sie Reinstwasser, um die restliche Reinigungslösung von der Kapillarspitze zu entfernen.
   21. Überprüfen Sie die Beispielinformationen, wie weiter oben in den Schritten 4.2.17-4.2.20 beschrieben. Ändern Sie den PBS (Schritt 4.2.17) in die sEV-Stichprobe und analysieren Sie die Daten.
3. Identifizieren Sie die sEVs weiter durch Western Blot.
   1. Bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen der sEVs und Gewebe mit dem BCA-Proteinquantifizierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   2. Berechnen Sie das Beladungsvolumen von sEVs (z. B. für 5 μg Protein pro Well) basierend auf diesen quantitativen Ergebnissen. Fügen Sie Ladepuffer im Verhältnis 1:4 hinzu und wirbeln Sie die Mischung.
   3. Nach 10 min Denaturierung in einem 100 °C warmen Metallbad (Trockenthermostat) wird das Protein auf einem 12%igen Polyacrylamid-Gel bei 60 V für 80 min getrennt.
   4. Das Gel wird 2 h lang mit Transferpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20 % Methanol) auf eine 0,22 μm Polyvinylidendifluoridmembran bei 220 mA übertragen.
   5. Blockieren Sie die Membran mit 5% fettfreier Trockenmilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung Tween (TBST) für 1 h bei Raumtemperatur und inkubieren Sie sie mit Primärantikörpern (monoklonaler Anti-Human-CD9-Antikörper von Kaninchen, monoklonaler Anti-Human-CD63-Antikörper von Kaninchen, monoklonaler Anti-Human-TSG101-Antikörper von Kaninchen, monoklonaler Anti-Human-GM130-Antikörper für Mäuse) über Nacht bei 4 °C. Verdünnen Sie die primären Antikörper in 5% fettfreier Milch im Verhältnis 1:1.000.
   6. Nach dreimaligem Waschen mit TBST wird die Membran mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten sekundären Antikörpern bei Raumtemperatur 1 h lang inkubiert.
   7. Erkennen Sie den HRP-verknüpften Antikörper mit ECL-Blotting-Substrat und sammeln und analysieren Sie dann die Bilder.

Ergebnisse

sEVs aus menschlichem Leberkrebsgewebe haben eine entscheidende Rolle bei der Diagnose, Behandlung und Prognose von Patienten mit Leberkrebs gespielt. Bei dieser Methode wurden gängige Laborinstrumente verwendet, um sEVs aus Leberkrebsgewebe zu isolieren und zu reinigen. Dies kann eine methodische Unterstützung für die Untersuchung von sEVs bieten. Abbildung 2 veranschaulicht den allgemeinen Prozess der Anreicherung von sEVs aus Leberkrebsgewebe. sEVs in den Interzellularräumen von Geweb...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine wiederholbare Methode zur Extraktion von sEVs aus Leberkrebsgewebe. Hochwertige sEVs werden durch scharfe Gewebeisolierung, Behandlung mit Verdauungsenzymen, differentielle Ultrazentrifugation und 0,22-μm-Filtermembranfiltration und -reinigung erhalten. Für die nachgeschaltete Analyse ist es äußerst wichtig, die hohe Reinheit der sEVs sicherzustellen. Bei der differentiellen Zentrifugation erscheint eine Schicht weißer Substanzen (unbekannte Zusammensetzung) auf der Oberfläche des ?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Membrane Filter Unit	Millex	SLGPR33RB
1 mL Sterile syringe	Hubei Xianming Medical Instrument Company	YL01329
2% Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400-2
4.7 mL Centrifuge Tube	Beckman Coulter	361621
6-well Cell cuture plate	LABSELECT	11110
50 mL Beaker	Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company	CF2100800
70 µm Cell strainer	Biosharp	BS-70-XBS
100 mm Cell culture dish	CELL TER	CS016-0128
600 µL Centrifuge tube	Axygen	MCT060C
BCA protein quantification kit	Thermo Fisher	RJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TL	Beckman	A95761
BioRad Mini trans-blot	Bio-Rad	1703930
BioRad Mini-Protean	Bio-Rad	1645050
CD63 Antibody	Abcam	ab134045
CD9 Antibody	Abcam	ab263019
Centrifuge 5430R	Eppendorf	5428HQ527333
Cleaning Solution	NanoFCM	C1801
Collagenase D	Roche	11088866001
Copper net	Henan Zhongjingkeyi Technology Company	DJZCM-15-N1
Dry Thermostat	Hangzhou allsheng instruments company	AS-01030-00
FITC Anti Human CD9 Antibody	Elabscience	E-AB-F1086C
Glycine	Solarbio	G8200
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody	Proteintech	SA00001-1
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody	Proteintech	SA00001-2
Methanol	Shanghai Zhenxing Chemical Company
Nanoparticle flow cytometer	NanoFCM INC	FNAN30E20112368
Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)	Roche	4906845001
Phosphate Buffered Saline(PBS)	Servicebio	G4202
Polyvinylidene Difluoride Membrane	Solarbio	ISEQ00010
QC Beads	NanoFCM	QS2502
RPMI-1640 basic medium	Biological Industries	C11875500BT
Scalpel	Guangzhou Kehua Trading Company	NN-0623-1
Silica Nanospheres	NanoFCM	S16M-Exo
Transference Decoloring Shaker TS-8	Kylin-Bell	E0018
Transmission Electron Microscope	Thermo Scientific	Talos L120C
Tris	Solarbio	T8060
TSG101 Antibody	Proteintech	28283-1-AP
Tweezer	Guangzhou Lige Technology Company	LG01-105-4X