Un método de enriquecimiento para pequeñas vesículas extracelulares derivadas del tejido de cáncer de hígado

Resumen

Aquí describimos el enriquecimiento de pequeñas vesículas extracelulares derivadas del tejido de cáncer de hígado a través de un método optimizado de ultracentrifugación diferencial.

Resumen

Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) derivadas del tejido pueden reflejar el estado funcional de las células fuente y las características del espacio intersticial del tejido. El enriquecimiento eficiente de estos sEV es un requisito previo importante para el estudio de su función biológica y una clave para el desarrollo de técnicas de detección clínica y tecnología de portadores terapéuticos. Es difícil aislar los sEV del tejido porque generalmente están muy contaminados. Este estudio proporciona un método para el enriquecimiento rápido de sEV de alta calidad a partir de tejido de cáncer de hígado. El método implica un proceso de cuatro pasos: la incubación de enzimas digestivas (colagenasa D y DNasa Ι) con tejido, filtración a través de un filtro celular de 70 μm, ultracentrifugación diferencial y filtración a través de un filtro de membrana de 0,22 μm. Debido a la optimización de la etapa de ultracentrifugación diferencial y la adición de una etapa de filtración, la pureza de los sEV obtenidos por este método es mayor que la lograda por la ultracentrifugación diferencial clásica. Proporciona una metodología importante y datos de apoyo para el estudio de sEV derivados de tejidos.

Introducción

Las vesículas extracelulares pequeñas (sEV) tienen aproximadamente 30 nm a 150 nm de diámetro y son secretadas por varias células¹. Pueden comunicarse con las células de los tejidos y regular el microambiente local o distante mediante el transporte de moléculas biológicas importantes como lípidos, proteínas, ADN y ARN a varios órganos, tejidos, células y partes intracelulares. Por lo tanto, también pueden cambiar el comportamiento de las células receptoras ^2,3. El aislamiento y la purificación de sEV específicos es un requisito previo esencial para estudiar su comportamiento biológico durante el desarrollo y el curso de la enfermedad. La ultracentrifugación diferencial, considerada como el estándar de oro, se usa comúnmente para separar los sEV de los tejidos en los que normalmente residen⁴. Los restos de tejido, los restos celulares, las vesículas grandes y los cuerpos apoptóticos se pueden eliminar mediante esta técnica, dejando solo los sEV.

Se ha demostrado que la colagenasa D y la DNasa I no afectan las características moleculares de las células o vesículas, y las propiedades de ambas enzimas contribuyen a la liberación de vesículas en la matriz extracelular ⁵. Estas enzimas se han utilizado para extraer sEVs del tejido del melanoma metastásico humano, tejido de cáncer de colon y tejido de la mucosa colónica ^5,6,7. Sin embargo, la concentración y el tiempo de digestión de la colagenasa D y la DNasa I en estos métodos difieren, lo que lleva a conclusiones inconsistentes. Para evitar la coprecipitación de otros subtipos de sEVs, los investigadores han eliminado vesículas extracelulares más grandes (0,1 μm o 0,2 μm de diámetro) por filtración y/o centrifugación diferencial⁸. Dependiendo del tejido fuente, pueden ser necesarios diferentes métodos de aislamiento y purificación ^9,10.

El uso del método tradicional de ultracentrifugación diferencial para extraer sEV del tejido hepático da como resultado una capa de materia blanca en la superficie del sobrenadante, sin ninguna forma de determinar sus propiedades. En un estudio previo¹¹, se encontró que esta capa de materia blanca afecta la pureza de los sEV. Aunque el número de partículas y la concentración de proteínas de las muestras aisladas por el método tradicional fueron más altos que los del método actual, el coeficiente de variación fue grande, posiblemente porque muchos contaminantes pueden conducir a una repetibilidad deficiente de los resultados. Es decir, utilizando detergente (es decir, detectando la solubilidad de partículas en Triton X-100 al 1%), encontramos que la pureza de los sEVs obtenidos por este método era mayor. Por lo tanto, utilizamos este método para aislar y purificar sEV derivados del tejido de cáncer colorrectal para la investigación proteómica.

En la actualidad, la investigación sobre sEVs en cáncer de hígado se centra principalmente en suero, plasma y sobrenadante del cultivo celular^12,13,14. Sin embargo, los sEV derivados del tejido del cáncer de hígado pueden reflejar con mayor precisión la patología fisiológica y el microambiente circundante del cáncer de hígado y evitar eficazmente la degradación y contaminación de otros EV^15,16. Con el uso de la ultracentrifugación diferencial, este método puede enriquecer el rendimiento y obtener sEV de alta calidad, proporcionando una base importante para el estudio posterior del cáncer de hígado. Este método permite que el tejido del cáncer de hígado se separe por separación aguda y se disocie por la colagenasa D y la DNasa I. Luego, los desechos celulares, las vesículas grandes y los cuerpos apoptóticos se eliminan aún más mediante filtración y ultracentrifugación diferencial. Finalmente, los sEV se aíslan y purifican para estudios posteriores.

Protocolo

Se recolectó tejido de cáncer de hígado humano de pacientes diagnosticados con neoplasia maligna hepática en el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Gannan. Todos los pacientes firmaron un formulario de consentimiento informado, y la recolección de muestras de tejido humano fue aprobada por el comité de ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Gannan. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, equipos y software utilizados en este protocolo.

1. Preparación

1. Coloque el agitador de decoloración de transferencia en la incubadora y ajuste la temperatura a 37 °C. Consulte la Figura 1 para todos los demás equipos necesarios.
2. Limpie el bisturí y las pinzas rociándolas con alcohol al 75%.
3. Preparar la solución digestiva midiendo 6 mg de colagenasa D (4 mg/ml) y 24 μL de DNasa Ι (80 U/ml) y añadiéndolas a 1,5 mL de medio básico RPMI-1640. Mezclar por inversión suave hasta que los aditivos estén completamente disueltos.
4. Por adelantado, humedezca los filtros celulares de 70 μm y 0,22 μm con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
5. Coloque una placa de cultivo celular estéril de 100 mm en la nevera para contener los tejidos hepáticos después de la descongelación.
6. Dentro de los 15 minutos después del aislamiento del tejido del carcinoma hepatocelular, enjuague la sangre en la superficie del bloque de tejido con PBS, transfiera el tejido a un tubo congelado estéril y guárdelo a -80 °C hasta el experimento durante no más de 2 semanas.

2. Disociación tisular

1. Extraer la muestra de tejido del congelador de −80 °C y colocar aproximadamente 400 mg del tejido cortado en fragmentos de 2 mm x 2 mm x 2 mm en la placa de cultivo celular de 10 cm en la nevera.
2. Mueva el tejido a una placa de 6 pocillos con 1.5 ml de la solución digestiva; a continuación, coloque la placa en el agitador de decoloración de transferencia (20 rpm/min) para incubar durante 20 min a 37 °C para la disociación completa del tejido canceroso hepático y la liberación de los sEV.
3. Retire la placa de 6 pocillos de la incubadora y colóquela en la nevera. Añadir 80 μL de inhibidor de la fosfatasa y 200 μL de solución completa de inhibidor de la proteasa para detener la digestión.
4. Transfiera la solución digestiva al filtro de células de 70 μm y fílela lentamente para eliminar cualquier residuo de tejido grande. Recoja el filtrado y colóquelo en un tubo de centrífuga de 2 ml.

3. Ultracentrifugación diferencial

NOTA: Realice todos los pasos de centrifugación a 4 °C.

1. Centrifugar el filtrado a 500 × g durante 10 min y recoger el sobrenadante en un nuevo tubo de centrífuga de 2 ml. La mayoría de los pequeños restos de tejido se pueden eliminar.
2. Centrifugar el sobrenadante a 3.000 × g durante 20 minutos para eliminar los restos celulares. Transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga hasta que la punta de la pipeta esté a punto de tocar la sustancia blanca en la superficie.
3. Centrifugar el líquido restante a 3.000 × g durante 3 min; Luego, aspire el sobrenadante para facilitar la recolección de vesículas. Para garantizar la pureza de los sEV, asegúrese de que la sustancia blanca no esté aspirada.
4. Centrifugar el sobrenadante recogido a 12.000 × g durante 20 min y transferir 900 μL del sobrenadante a un tubo de ultracentrífuga de 4,7 ml. Centrifugar el líquido restante a 12.000 × g durante 3 min y luego recoger y mezclar ambos sobrenadantes en el mismo tubo de ultracentrífuga. Llene el tubo completamente con PBS.
5. Centrifugar los sobrenadantes a 100.000 × g durante 60 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet llenando el tubo de ultracentrífuga con PBS y centrifugando nuevamente a 100,000 × g durante 60 min. Resuspender el pellet con 50 μL de PBS.
6. Aspirar la suspensión sEV con una jeringa estéril de 1 ml y filtrarla a través de un filtro de membrana de 0,22 μm. Recoja el filtrado en un tubo de centrífuga de 600 μL y guárdelo a -80 °C para su posterior análisis.

4. Evaluación de la calidad del enriquecimiento

1. Observe la morfología de los sEV bajo un microscopio electrónico de transmisión.
   1. Luego, deje caer 10 μL de la muestra de sEV en una red de cobre, incube a temperatura ambiente durante 10 minutos y límpiela con agua destilada estéril, usando papel absorbente para eliminar el exceso de líquido.
   2. Deje caer 10 μL de acetato de uranilo al 2% en la red de cobre para la tinción negativa durante 1 min. Use papel de filtro para absorber el líquido en la superficie de la red de cobre y séquelo durante 2 minutos bajo una lámpara incandescente.
   3. Observe la malla de cobre bajo un microscopio electrónico de transmisión e imagen a 80 kV.
2. Utilice un citómetro de flujo de nanopartículas para determinar la distribución del tamaño y la pureza de los sEV.
   1. Antes de arrancar la máquina, prepare tubos que contengan 200 μL de control de calidad, 200 μL de nanoesferas de sílice, 2 x 200 μL de agua ultrapura, 2 x 200 μL de solución de limpieza y 200 μL de PBS.
      NOTA: Antes de probar las muestras de sEV, es necesario realizar un control de calidad en el instrumento y probar el estándar de tamaño de partícula (la distribución del tamaño debe calcularse utilizando curvas estándar generadas con varias nanomicroesferas de diferentes diámetros [68-155 nm] bajo la misma condición de detección). Las perlas de control de calidad y las nanoesferas de sílice se diluyeron 100 veces con agua ultrapura en un volumen total de 200 μL.
   2. Compruebe el volumen de la solución de limpieza (>10 ml) y observe la diferencia entre los niveles del líquido de la vaina y el líquido residual (20-30 cm).
   3. Apague la fuente de alimentación principal del instrumento; Después de 20 s, encienda la computadora y espere los pitidos que indican que el instrumento está conectado correctamente para ejecutar el software.
   4. Haga clic en Iniciar para encender la cámara, el láser y la bomba de aire.
   5. Haga clic en Sheath Flow-Start Up y coloque agua ultrapura en la plataforma de carga. Después de 4 minutos (cuenta atrás del instrumento), haga clic en Sample-Boosting | Muestra-Descargar.
   6. Después de 30 s, coloque el tubo en blanco en la plataforma de carga y haga clic en Sample-Boosting | Muestra-Descargar. Luego, coloque el tubo que contiene el agua ultrapura en la plataforma de carga y, simultáneamente, haga clic en Sample-Boosting | Purga de flujo de vaina.
   7. Haga clic en Operación manual y coloque el tubo de concentración de partículas en la plataforma de carga. Luego, haga clic en Sample-Boosting durante 1 min y seleccione simultáneamente el control de calidad de 250 nm Std FL SiNPs en "SAMP. Inf."
   8. Haga clic en Muestreo de muestras y encienda el detector haciendo clic en SPCM.
      NOTA: En este punto, se puede ver la forma de onda de la señal en tiempo real.
   9. Haga clic en Muestreo automático e introduzca 1.0 en Sampling SET para fijar la presión en 1 KPa. Haga clic en la barra de herramientas y seleccione Señal grande.
   10. Ajuste la posición horizontal del láser y ajuste el láser a 2 μm; luego, haga clic en L o R para asegurarse de que la señal sea fuerte y uniforme.
   11. Haga clic en Time to Record para recopilar los datos, que saltarán automáticamente a Buffer cuando terminen. Luego, guarde los datos en un archivo Naf y haga clic en Sample-Unload.
   12. Coloque el tubo de solución de limpieza en la plataforma de carga, haga clic en Sample-Boosting, y después de 1 minuto, haga clic en Sample-Unloading. Use agua ultrapura para eliminar la solución de limpieza residual de la punta capilar.
   13. Coloque el tubo estándar del tamaño de partícula en la plataforma de carga y haga clic en Sample-Boosting durante 1 min.
   14. Seleccione el control de calidad de SiNPs Std FL de 68-155 nm en "SAMP. Inf" y haga clic en Muestreo de muestras. Luego, haga clic en la barra de herramientas y seleccione Señal pequeña.
   15. Haga clic en Time to Record para recopilar los datos, que saltarán automáticamente a Buffer cuando terminen. Luego, guarde los datos en un archivo Naf y haga clic en Sample-Unload.
   16. Coloque el tubo de solución de limpieza en la plataforma de carga, haga clic en Sample-Boosting y haga clic en Sample-Unload después de 1 min. Use agua ultrapura para eliminar la solución de limpieza residual de la punta capilar.
   17. Coloque el tubo PBS en la plataforma de carga; haga clic en Sample-Boosting durante 1 minuto.
   18. Seleccione el control de calidad de SiNPs Std FL de 68-155 nm en "SAMP. Inf" y haga clic en Muestreo de muestras. Luego, haga clic en la barra de herramientas y seleccione Señal pequeña.
   19. Haga clic en Time to Record para recopilar datos, que saltarán automáticamente a Buffer cuando termine. Guarde los datos en un archivo Naf y haga clic en Sample-Unload.
   20. Coloque el tubo de solución de limpieza en la plataforma de carga, haga clic en Aumento de muestras y Descarga de muestras después de 1 minuto. Use agua ultrapura para eliminar la solución de limpieza residual de la punta capilar.
   21. Compruebe la información de ejemplo como se describió anteriormente en los pasos 4.2.17-4.2.20; cambie el PBS (paso 4.2.17) a la muestra sEV y analice los datos.
3. Identifique aún más los sEV por Western blot.
   1. Determine las concentraciones de proteínas de los sEV y tejidos utilizando el kit de cuantificación de proteínas BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   2. Calcule el volumen de carga de sEV (por ejemplo, para 5 μg de proteína por pocillo) basándose en estos resultados cuantitativos. Agregue el búfer de carga en una proporción de 1: 4 y voltee la mezcla.
   3. Después de la desnaturalización en un baño metálico a 100 °C (termostato seco) durante 10 min, separe la proteína en un gel de poliacrilamida al 12% a 60 V durante 80 min.
   4. Transfiera el gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno de 0,22 μm a 220 mA durante 2 h utilizando tampón de transferencia (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% metanol).
   5. Bloquear la membrana con leche en polvo descremada al 5% en Tween salino tamponado con Tris (TBST) durante 1 h a temperatura ambiente e incubar con el anticuerpo primario (anticuerpo CD9 monoclonal monoclonal de conejo, anticuerpo CD63 monoclonal humano de conejo, anticuerpo anti-humano monoclonal de conejo TSG101 anticuerpo, anticuerpo monoclonal de ratón GM130 humano) durante la noche a 4 °C. Diluir los anticuerpos primarios en leche descremada al 5% a 1:1.000.
   6. Después de tres lavados con TBST, incubar la membrana con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) a temperatura ambiente durante 1 h.
   7. Detecte el anticuerpo vinculado a HRP utilizando sustrato de transferencia ECL y luego recopile y analice las imágenes.

Resultados

Los sEV de los tejidos de cáncer de hígado humano han desempeñado un papel crucial en el diagnóstico, tratamiento y pronóstico de pacientes con cáncer de hígado. Este método utilizó instrumentos de laboratorio comunes para aislar y purificar sEV derivados de tejidos de cáncer de hígado; esto puede proporcionar apoyo metodológico para el estudio de los sEV. La figura 2 ilustra el proceso general de enriquecimiento de los sEV de los tejidos del cáncer de hígado. Los sEV en los es...

Discusión

Este protocolo describe un método repetible para extraer sEV del tejido del cáncer de hígado. Los sEV de alta calidad se obtienen mediante aislamiento tisular nítido, tratamiento con enzimas digestivas, ultracentrifugación diferencial y filtración y purificación de membrana filtrante de 0,22 μm. Para el análisis posterior, es extremadamente importante garantizar la alta pureza de los sEV. En el proceso de centrifugación diferencial, aparecerá una capa de sustancias blancas (composición desconocida) en la supe...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Membrane Filter Unit	Millex	SLGPR33RB
1 mL Sterile syringe	Hubei Xianming Medical Instrument Company	YL01329
2% Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400-2
4.7 mL Centrifuge Tube	Beckman Coulter	361621
6-well Cell cuture plate	LABSELECT	11110
50 mL Beaker	Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company	CF2100800
70 µm Cell strainer	Biosharp	BS-70-XBS
100 mm Cell culture dish	CELL TER	CS016-0128
600 µL Centrifuge tube	Axygen	MCT060C
BCA protein quantification kit	Thermo Fisher	RJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TL	Beckman	A95761
BioRad Mini trans-blot	Bio-Rad	1703930
BioRad Mini-Protean	Bio-Rad	1645050
CD63 Antibody	Abcam	ab134045
CD9 Antibody	Abcam	ab263019
Centrifuge 5430R	Eppendorf	5428HQ527333
Cleaning Solution	NanoFCM	C1801
Collagenase D	Roche	11088866001
Copper net	Henan Zhongjingkeyi Technology Company	DJZCM-15-N1
Dry Thermostat	Hangzhou allsheng instruments company	AS-01030-00
FITC Anti Human CD9 Antibody	Elabscience	E-AB-F1086C
Glycine	Solarbio	G8200
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody	Proteintech	SA00001-1
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody	Proteintech	SA00001-2
Methanol	Shanghai Zhenxing Chemical Company
Nanoparticle flow cytometer	NanoFCM INC	FNAN30E20112368
Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)	Roche	4906845001
Phosphate Buffered Saline(PBS)	Servicebio	G4202
Polyvinylidene Difluoride Membrane	Solarbio	ISEQ00010
QC Beads	NanoFCM	QS2502
RPMI-1640 basic medium	Biological Industries	C11875500BT
Scalpel	Guangzhou Kehua Trading Company	NN-0623-1
Silica Nanospheres	NanoFCM	S16M-Exo
Transference Decoloring Shaker TS-8	Kylin-Bell	E0018
Transmission Electron Microscope	Thermo Scientific	Talos L120C
Tris	Solarbio	T8060
TSG101 Antibody	Proteintech	28283-1-AP
Tweezer	Guangzhou Lige Technology Company	LG01-105-4X