Un metodo di arricchimento per piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato

Riepilogo

Qui descriviamo l'arricchimento di piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato attraverso un metodo di ultracentrifugazione differenziale ottimizzato.

Abstract

Piccole vescicole extracellulari (sEV) derivate dal tessuto possono riflettere lo stato funzionale delle cellule sorgente e le caratteristiche dello spazio interstiziale del tessuto. L'arricchimento efficiente di questi veicoli elettrici è un prerequisito importante per lo studio della loro funzione biologica e una chiave per lo sviluppo di tecniche di rilevamento clinico e tecnologia di supporto terapeutico. È difficile isolare i sEV dal tessuto perché di solito sono fortemente contaminati. Questo studio fornisce un metodo per il rapido arricchimento di sEV di alta qualità dal tessuto del cancro del fegato. Il metodo prevede un processo in quattro fasi: l'incubazione di enzimi digestivi (collagenasi D e DNasi Ι) con tessuto, filtrazione attraverso un filtro cellulare da 70 μm, ultracentrifugazione differenziale e filtrazione attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm. Grazie all'ottimizzazione della fase di ultracentrifugazione differenziale e all'aggiunta di una fase di filtrazione, la purezza dei sEV ottenuti con questo metodo è superiore a quella ottenuta dalla classica ultracentrifugazione differenziale. Fornisce un'importante metodologia e dati di supporto per lo studio dei sEV derivati dai tessuti.

Introduzione

Le piccole vescicole extracellulari (sEV) hanno un diametro di circa 30-150 nm e sono secrete da varie cellule¹. Possono comunicare con le cellule dei tessuti e regolare il microambiente locale o distante trasportando importanti molecole biologiche come lipidi, proteine, DNA e RNA a vari organi, tessuti, cellule e parti intracellulari. Pertanto, possono anche modificare il comportamento delle celle riceventi ^2,3. L'isolamento e la purificazione di specifici sEV è un prerequisito essenziale per studiare il loro comportamento biologico durante lo sviluppo e il decorso della malattia. L'ultracentrifugazione differenziale, considerata il gold standard, è comunemente usata per separare i sEV dai tessuti in cui risiedono normalmente⁴. Detriti tissutali, detriti cellulari, grandi vescicole e corpi apoptotici possono essere rimossi con questa tecnica, lasciando solo i sEV.

È stato dimostrato che la collagenasi D e la DNasi I non influenzano le caratteristiche molecolari delle cellule o delle vescicole, con le proprietà di entrambi gli enzimi che contribuiscono al rilascio di vescicole nella matrice extracellulare ⁵. Questi enzimi sono stati utilizzati per estrarre sEVs dal tessuto melanoma metastatico umano, dal tessuto del cancro del colon e dal tessuto della mucosa del colon ^5,6,7. Tuttavia, la concentrazione e il tempo di digestione della collagenasi D e della DNasi I in questi metodi differiscono, portando a conclusioni incoerenti. Per evitare la coprecipitazione di altri sottotipi di sEV, i ricercatori hanno rimosso vescicole extracellulari più grandi (0,1 μm o 0,2 μm di diametro) mediante filtrazione e/o centrifugazione differenziale⁸. A seconda del tessuto di origine, possono essere necessari diversi metodi di isolamento e purificazione ^9,10.

Utilizzando il tradizionale metodo di ultracentrifugazione differenziale per estrarre i sEV dal tessuto epatico si ottiene uno strato di sostanza bianca sulla superficie del surnatante, senza alcun modo di determinarne le proprietà. In uno studio precedente¹¹, questo strato di sostanza bianca è stato trovato per influenzare la purezza dei sEV. Sebbene il numero di particelle e la concentrazione proteica dei campioni isolati con il metodo tradizionale fossero superiori a quelli del metodo attuale, il coefficiente di variazione era elevato, probabilmente perché molti inquinanti possono portare a una scarsa ripetibilità dei risultati. Cioè, usando il detergente (cioè, rilevando la solubilità delle particelle in 1% Triton X-100), abbiamo scoperto che la purezza dei sEV ottenuti con questo metodo era maggiore. Quindi, usiamo questo metodo per isolare e purificare i sEV derivati dal tessuto del cancro del colon-retto per la ricerca proteomica.

Attualmente, la ricerca sulle EV nel cancro del fegato si concentra principalmente sul siero, sul plasma e sul surnatante della coltura cellulare^12,13,14. Tuttavia, le sEV derivate dal tessuto del cancro del fegato possono riflettere più accuratamente la patologia fisiologica e il microambiente circostante del cancro del fegato ed evitare efficacemente la degradazione e l'inquinamento di altri EV^15,16. Con l'uso dell'ultracentrifugazione differenziale, questo metodo può arricchire la resa e ottenere sEV di alta qualità, fornendo una base importante per l'ulteriore studio del cancro del fegato. Questo metodo consente al tessuto del cancro del fegato di essere separato da una netta separazione e di essere dissociato dalla collagenasi D e DNasi I. Quindi, i detriti cellulari, le grandi vescicole e i corpi apoptotici vengono ulteriormente rimossi mediante filtrazione e ultracentrifugazione differenziale. Infine, i sEV vengono isolati e purificati per studi successivi.

Protocollo

Il tessuto del cancro del fegato umano è stato raccolto da pazienti con diagnosi di malignità epatica presso il primo ospedale affiliato della Gannan Medical University. Tutti i pazienti hanno firmato un modulo di consenso informato e la raccolta di campioni di tessuto umano è stata approvata dal comitato etico del primo ospedale affiliato della Gannan Medical University. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, le attrezzature e il software utilizzati in questo protocollo.

1. Preparazione

1. Posizionare lo shaker decolorante di trasferimento nell'incubatore e impostare la temperatura a 37 °C. Vedere la Figura 1 per tutte le altre attrezzature necessarie.
2. Pulire il bisturi e la pinza spruzzandoli con alcool al 75%.
3. Preparare la soluzione digestiva misurando 6 mg di collagenasi D (4 mg/ml) e 24 μL di DNasi Ι (80 U/mL) e aggiungendoli a 1,5 mL di terreno basico RPMI-1640. Mescolare per inversione delicata fino a completa dissoluzione degli additivi.
4. In anticipo, inumidire i filtri cellulari da 70 μm e 0,22 μm con 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
5. Posizionare una capsula di coltura cellulare sterile da 100 mm sulla ghiacciaia per contenere i tessuti del fegato dopo lo scongelamento.
6. Entro 15 minuti dopo l'isolamento del tessuto del carcinoma epatocellulare, sciacquare il sangue sulla superficie del blocco tissutale con PBS, trasferire il tessuto in un tubo congelato sterile e conservarlo a -80 ° C fino all'esperimento per non più di 2 settimane.

2. Dissociazione tissutale

1. Rimuovere il campione di tessuto dal congelatore a -80 °C e introdurre circa 400 mg di tessuto tagliato in frammenti di 2 mm x 2 mm x 2 mm nella capsula di coltura cellulare da 10 cm sulla ghiacciaia.
2. Spostare il tessuto in una piastra a 6 pozzetti con 1,5 ml della soluzione digestiva; quindi, posizionare la piastra sullo shaker decolorante transfert (20 rpm/min) per incubare per 20 minuti a 37 °C per la completa dissociazione del tessuto tumorale del fegato e il rilascio dei sEV.
3. Rimuovere la piastra a 6 pozzetti dall'incubatore e posizionarla sulla ghiacciaia. Aggiungere 80 μL di inibitore della fosfatasi e 200 μL di soluzione completa di inibitore della proteasi per interrompere la digestione.
4. Trasferire la soluzione digestiva nel filtro cellulare da 70 μm e filtrarla lentamente per rimuovere eventuali detriti tissutali di grandi dimensioni. Raccogliere il filtrato e metterlo in una provetta da centrifuga da 2 ml.

3. Ultracentrifugazione differenziale

NOTA: Eseguire tutte le fasi di centrifugazione a 4 °C.

1. Centrifugare il filtrato a 500 × g per 10 minuti e raccogliere il surnatante in una nuova provetta da centrifuga da 2 ml. La maggior parte dei piccoli detriti tissutali può quindi essere rimossa.
2. Centrifugare il surnatante a 3.000 × g per 20 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire con cautela il surnatante in una nuova provetta da centrifuga fino a quando la punta della pipetta sta per toccare la sostanza bianca sulla superficie.
3. Centrifugare il liquido rimanente a 3.000 × g per 3 minuti; Quindi, aspirare il surnatante per facilitare la raccolta delle vescicole. Per garantire la purezza dei sEV, assicurarsi che la sostanza bianca non sia aspirata.
4. Centrifugare il surnatante raccolto a 12.000 × g per 20 minuti e trasferire 900 μL del surnatante in una provetta da ultracentrifuga da 4,7 ml. Centrifugare il liquido rimanente a 12.000 × g per 3 minuti, quindi raccogliere e mescolare entrambi i surnatanti nella stessa provetta ultracentrifuga. Riempire completamente il tubo con PBS.
5. Centrifugare i surnatanti a 100.000 × g per 60 minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet riempiendo il tubo ultracentrifugo con PBS e centrifugando nuovamente a 100.000 × g per 60 minuti. Risospendere il pellet con 50 μL di PBS.
6. Aspirare la sospensione sEV utilizzando una siringa sterile da 1 mL e filtrarla attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm. Raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga da 600 μL e conservarlo a -80 °C per ulteriori analisi.

4. Valutazione della qualità dell'arricchimento

1. Osservare la morfologia dei sEV al microscopio elettronico a trasmissione.
   1. Quindi, far cadere 10 μL del campione sEV su una rete di rame, incubare a temperatura ambiente per 10 minuti e pulirlo con acqua distillata sterile, utilizzando carta assorbente per rimuovere il liquido in eccesso.
   2. Versare 10 μL di acetato di uranile al 2% sulla rete di rame per una colorazione negativa per 1 minuto. Utilizzare carta da filtro per assorbire il liquido sulla superficie della rete di rame e asciugarlo per 2 minuti sotto una lampada ad incandescenza.
   3. Osservare la maglia di rame al microscopio elettronico a trasmissione e l'immagine a 80 kV.
2. Utilizzare un citometro a flusso di nanoparticelle per determinare la distribuzione dimensionale e la purezza dei sEV.
   1. Prima di avviare la macchina, preparare provette contenenti 200 μL di controllo qualità, 200 μL di nanosfere di silice, 2 x 200 μL di acqua ultrapura, 2 x 200 μL di soluzione detergente e 200 μL di PBS.
      NOTA: Prima di testare i campioni sEV, è necessario effettuare un controllo di qualità sullo strumento e testare lo standard granulometrico (la distribuzione dimensionale deve essere calcolata utilizzando curve standard generate con diverse nanomicrosfere di diametri diversi [68-155 nm] nella stessa condizione di rivelazione). Le perle di QC e le nanosfere di silice sono state diluite 100 volte con acqua ultrapura in un volume totale di 200 μL.
   2. Controllare il volume della soluzione detergente (>10 ml) e notare la differenza tra i livelli del liquido della guaina e del liquido di scarto (20-30 cm).
   3. Spegnere l'alimentazione principale dello strumento; Dopo 20 s, accendere il computer e attendere i segnali acustici che indicano che lo strumento è collegato correttamente per eseguire il software.
   4. Fare clic su Start Up per accendere la fotocamera, il laser e la pompa dell'aria.
   5. Fare clic su Sheath Flow-Start Up e posizionare acqua ultrapura sulla piattaforma di carico. Dopo 4 minuti (conto alla rovescia dello strumento), fare clic su Sample-Boosting | Campionamento-Scarico.
   6. Dopo 30 secondi, posizionare il tubo grezzo sulla piattaforma di carico e fare clic su Sample-Boosting | Campionamento-Scarico. Quindi, posizionare il tubo che contiene l'acqua ultrapura sulla piattaforma di carico e, contemporaneamente, fare clic su Sample-Boosting | Spurgo del flusso della guaina.
   7. Fare clic su Funzionamento manuale e posizionare il tubo di concentrazione delle particelle sulla piattaforma di carico. Quindi, fare clic su Sample-Boosting per 1 minuto e contemporaneamente selezionare il controllo di qualità 250 nm Std FL SiNPs in "SAMP. Inf."
   8. Fare clic su Campionamento campione e accendere il rilevatore facendo clic su SPCM.
      NOTA: A questo punto, è possibile visualizzare la forma d'onda del segnale in tempo reale.
   9. Fare clic su Campionamento automatico e immettere 1.0 in Sampling SET per fissare la pressione a 1 KPa. Fare clic sulla barra degli strumenti e selezionare Segnale grande.
   10. Regolare la posizione orizzontale del laser e impostare il laser su 2 μm; quindi, fai clic su L o R per assicurarti che il segnale sia forte e uniforme.
   11. Fare clic su Time to Record per raccogliere i dati, che salteranno automaticamente a Buffer al termine. Quindi, salvare i dati in un file Naf e fare clic su Sample-Unload.
   12. Posizionare il tubo della soluzione detergente sulla piattaforma di carico, fare clic su Sample-Boosting e, dopo 1 minuto, fare clic su Sample-Unload. Utilizzare acqua ultrapura per rimuovere la soluzione detergente residua dalla punta capillare.
   13. Posizionare il tubo standard di dimensioni delle particelle sulla piattaforma di carico e fare clic su Sample-Boosting per 1 minuto.
   14. Selezionare il controllo di qualità 68-155 nm Std FL SiNPs in "SAMP. Inf" e fare clic su Campionamento campione. Quindi, fai clic sulla barra degli strumenti e seleziona Piccolo segnale.
   15. Fare clic su Time to Record per raccogliere i dati, che salteranno automaticamente a Buffer al termine. Quindi, salvare i dati in un file Naf e fare clic su Sample-Unload.
   16. Posizionare il tubo della soluzione detergente sulla piattaforma di carico, fare clic su Sample-Boosting e fare clic su Sample-Unload dopo 1 minuto. Utilizzare acqua ultrapura per rimuovere la soluzione detergente residua dalla punta capillare.
   17. Posizionare il tubo PBS sulla piattaforma di carico; clicca su Sample-Boosting per 1 min.
   18. Selezionare il controllo di qualità 68-155 nm Std FL SiNPs in "SAMP. Inf" e fare clic su Campionamento campione. Quindi, fai clic sulla barra degli strumenti e seleziona Piccolo segnale.
   19. Fare clic su Time to Record per raccogliere i dati, che salteranno automaticamente a Buffer al termine. Salvare i dati in un file Naf e fare clic su Sample-Unload.
   20. Posizionare il tubo della soluzione detergente sulla piattaforma di carico, fare clic su Sample-Boosting e Sample-Unload dopo 1 minuto. Utilizzare acqua ultrapura per rimuovere la soluzione detergente residua dalla punta capillare.
   21. Controllare le informazioni di esempio come descritto in precedenza nei passaggi 4.2.17-4.2.20; modificare il PBS (passaggio 4.2.17) nel campione sEV e analizzare i dati.
3. Identifica ulteriormente i sEV per western blot.
   1. Determinare le concentrazioni proteiche dei sEV e dei tessuti utilizzando il kit di quantificazione delle proteine BCA secondo le istruzioni del produttore.
   2. Calcolare il volume di carico dei sEV (ad esempio, per 5 μg di proteine per pozzetto) sulla base di questi risultati quantitativi. Aggiungere il buffer di carico in rapporto 1:4 e vortice la miscela.
   3. Dopo la denaturazione in un bagno metallico a 100 °C (termostato a secco) per 10 minuti, separare la proteina su un gel di poliacrilammide al 12% a 60 V per 80 minuti.
   4. Trasferire il gel su una membrana di difluoruro di polivinilidene da 0,22 μm a 220 mA per 2 ore utilizzando tampone di trasferimento (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% metanolo).
   5. Bloccare la membrana con latte secco scremato al 5% in Tris-buffered saline Tween (TBST) per 1 ora a temperatura ambiente e incubare con anticorpi primari (anticorpo monoclonale di coniglio anti-umano CD9, anticorpo monoclonale di coniglio CD63 anti-umano, anticorpo monoclonale di coniglio anti-umano TSG101, monoclonale di topo anticorpo GM130 umano) per una notte a 4 °C. Diluire gli anticorpi primari nel 5% di latte scremato a 1:1.000.
   6. Dopo tre lavaggi con TBST, incubare la membrana con anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP) a temperatura ambiente per 1 ora.
   7. Rilevare l'anticorpo legato all'HRP utilizzando il substrato di blotting ECL, quindi raccogliere e analizzare le immagini.

Risultati

Le sEV provenienti da tessuti di cancro del fegato umano hanno svolto un ruolo cruciale nella diagnosi, nel trattamento e nella prognosi dei pazienti con cancro al fegato. Questo metodo ha utilizzato strumenti di laboratorio comuni per isolare e purificare i sEV derivati dai tessuti del cancro del fegato; ciò può fornire un supporto metodologico per lo studio delle EV. La Figura 2 illustra il processo generale di arricchimento delle EV dai tessuti del cancro del fegato. Le sEV negli spazi ...

Discussione

Questo protocollo descrive un metodo ripetibile per estrarre i sEV dal tessuto del cancro del fegato. I sEV di alta qualità sono ottenuti mediante isolamento dei tessuti acuti, trattamento con enzimi digestivi, ultracentrifugazione differenziale e filtrazione e purificazione della membrana filtrante da 0,22 μm. Per l'analisi a valle, è estremamente importante garantire l'elevata purezza dei sEV. Nel processo di centrifugazione differenziale, uno strato di sostanze bianche (composizione sconosciuta) apparirà sulla sup...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Membrane Filter Unit	Millex	SLGPR33RB
1 mL Sterile syringe	Hubei Xianming Medical Instrument Company	YL01329
2% Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400-2
4.7 mL Centrifuge Tube	Beckman Coulter	361621
6-well Cell cuture plate	LABSELECT	11110
50 mL Beaker	Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company	CF2100800
70 µm Cell strainer	Biosharp	BS-70-XBS
100 mm Cell culture dish	CELL TER	CS016-0128
600 µL Centrifuge tube	Axygen	MCT060C
BCA protein quantification kit	Thermo Fisher	RJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TL	Beckman	A95761
BioRad Mini trans-blot	Bio-Rad	1703930
BioRad Mini-Protean	Bio-Rad	1645050
CD63 Antibody	Abcam	ab134045
CD9 Antibody	Abcam	ab263019
Centrifuge 5430R	Eppendorf	5428HQ527333
Cleaning Solution	NanoFCM	C1801
Collagenase D	Roche	11088866001
Copper net	Henan Zhongjingkeyi Technology Company	DJZCM-15-N1
Dry Thermostat	Hangzhou allsheng instruments company	AS-01030-00
FITC Anti Human CD9 Antibody	Elabscience	E-AB-F1086C
Glycine	Solarbio	G8200
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody	Proteintech	SA00001-1
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody	Proteintech	SA00001-2
Methanol	Shanghai Zhenxing Chemical Company
Nanoparticle flow cytometer	NanoFCM INC	FNAN30E20112368
Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)	Roche	4906845001
Phosphate Buffered Saline(PBS)	Servicebio	G4202
Polyvinylidene Difluoride Membrane	Solarbio	ISEQ00010
QC Beads	NanoFCM	QS2502
RPMI-1640 basic medium	Biological Industries	C11875500BT
Scalpel	Guangzhou Kehua Trading Company	NN-0623-1
Silica Nanospheres	NanoFCM	S16M-Exo
Transference Decoloring Shaker TS-8	Kylin-Bell	E0018
Transmission Electron Microscope	Thermo Scientific	Talos L120C
Tris	Solarbio	T8060
TSG101 Antibody	Proteintech	28283-1-AP
Tweezer	Guangzhou Lige Technology Company	LG01-105-4X