Um método de enriquecimento para pequenas vesículas extracelulares derivadas do tecido de câncer de fígado

Resumo

Descrevemos aqui o enriquecimento de pequenas vesículas extracelulares derivadas de tecido de câncer hepático através de um método otimizado de ultracentrifugação diferencial.

Resumo

Pequenas vesículas extracelulares (EVs) derivadas do tecido podem refletir o estado funcional das células-fonte e as características do espaço intersticial do tecido. O enriquecimento eficiente desses sEVs é um pré-requisito importante para o estudo de sua função biológica e uma chave para o desenvolvimento de técnicas de detecção clínica e tecnologia de carreadores terapêuticos. É difícil isolar os sEVs do tecido porque eles geralmente estão fortemente contaminados. Este estudo fornece um método para o enriquecimento rápido de sEVs de alta qualidade do tecido do cancro do fígado. O método envolve um processo de quatro etapas: incubação de enzimas digestivas (colagenase D e DNase Ι) com tecido, filtração através de filtro celular de 70 μm, ultracentrifugação diferencial e filtração através de filtro de membrana de 0,22 μm. Devido à otimização da etapa de ultracentrifugação diferencial e à adição de uma etapa de filtração, a pureza dos sEVs obtidos por este método é maior do que a obtida pela ultracentrifugação diferencial clássica. Ele fornece uma metodologia importante e dados de apoio para o estudo de sEVs derivados de tecido.

Introdução

Pequenas vesículas extracelulares (EVs) têm aproximadamente 30 nm a 150 nm de diâmetro e são secretadas por várias células¹. Eles podem se comunicar com as células do tecido e regular o microambiente local ou distante, transportando moléculas biológicas importantes, como lipídios, proteínas, DNA e RNA para vários órgãos, tecidos, células e partes intracelulares. Assim, também podem alterar o comportamento das células receptoras ^2,3. O isolamento e purificação de sEVs específicos é um pré-requisito essencial para estudar seu comportamento biológico durante o desenvolvimento e curso da doença. A ultracentrifugação diferencial, considerada padrão-ouro, é comumente usada para separar os EVs dos tecidos nos quais normalmente residem⁴. Restos teciduais, restos celulares, grandes vesículas e corpos apoptóticos podem ser removidos por essa técnica, restando apenas os sEVs.

Demonstrou-se que a colagenase D e a DNase I não afetam as características moleculares das células ou vesículas, sendo que as propriedades de ambas as enzimas contribuem para a liberação de vesículas na matriz extracelular ⁵. Essas enzimas têm sido utilizadas para extrair EVs de melanoma metastático humano, tecido de câncer de cólon e tecido da mucosa colônica ^5,6,7. Entretanto, a concentração e o tempo de digestão da colagenase D e DNase I nesses métodos diferem, levando a conclusões inconsistentes. Para evitar a coprecipitação de outros subtipos de sEVs, pesquisadores removeram vesículas extracelulares maiores (0,1 μm ou 0,2 μm de diâmetro) por filtração e/ou centrifugação diferencial⁸. Dependendo do tecido fonte, diferentes métodos de isolamento e purificação podem ser necessários ^9,10.

O uso do método tradicional de ultracentrifugação diferencial para extrair sEVs do tecido hepático resulta em uma camada de substância branca na superfície do sobrenadante, sem qualquer maneira de determinar suas propriedades. Em um estudo anterior¹¹, essa camada de substância branca afetou a pureza dos sEVs. Embora o número de partículas e a concentração de proteínas das amostras isoladas pelo método tradicional tenham sido superiores aos do método atual, o coeficiente de variação foi grande, possivelmente porque muitos poluentes podem levar a uma baixa repetibilidade dos resultados. Ou seja, usando detergente (isto é, detectando a solubilidade de partículas em Triton X-100 a 1%), verificamos que a pureza dos sEVs obtidos por esse método foi maior. Assim, usamos este método para isolar e purificar sEVs derivados de tecido de câncer colorretal para pesquisa proteômica.

Atualmente, as pesquisas sobre sEVs no câncer de fígado estão focadas principalmente no soro, plasma e sobrenadante da cultura celular^12,13,14. No entanto, os EVs derivados do tecido do câncer de fígado podem refletir com mais precisão a patologia fisiológica e o microambiente circundante do câncer de fígado e efetivamente evitar a degradação e a poluição de outros EVs^15,16. Com o uso de ultracentrifugação diferencial, este método pode enriquecer o rendimento e obter sEVs de alta qualidade, fornecendo uma base importante para o estudo posterior do câncer de fígado. Este método permite que o tecido do câncer de fígado seja separado por separação nítida e seja dissociado pela colagenase D e DNase I. Em seguida, os debris celulares, as grandes vesículas e os corpos apoptóticos são removidos por filtração e ultracentrifugação diferencial. Finalmente, os sEVs são isolados e purificados para estudos posteriores.

Protocolo

O tecido de câncer de fígado humano foi coletado de pacientes diagnosticados com malignidade hepática no Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina de Gannan. Todos os pacientes assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido, e a coleta de amostras de tecido humano foi aprovada pelo comitê de ética do First Affiliated Hospital of Gannan Medical University. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, equipamentos e softwares usados neste protocolo.

1. Preparo

1. Coloque o agitador descorante de transferência na incubadora e ajuste a temperatura em 37 °C. Consulte a Figura 1 para todos os outros equipamentos necessários.
2. Limpe o bisturi e a pinça pulverizando-os com álcool a 75%.
3. Preparar a solução digestiva medindo 6 mg de colagenase D (4 mg/mL) e 24 μL de DNase Ι (80 U/mL) e adicionando-os a 1,5 mL de meio básico RPMI-1640. Misture por inversão suave até que os aditivos estejam completamente dissolvidos.
4. Previamente umedecer filtros celulares de 70 μm e 0,22 μm com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS).
5. Coloque uma placa de cultura de células estéril de 100 mm na caixa de gelo para segurar os tecidos do fígado após o descongelamento.
6. Dentro de 15 minutos após o isolamento do tecido do carcinoma hepatocelular, lave o sangue na superfície do bloco de tecido com PBS, transfira o tecido para um tubo congelado estéril e armazene-o a -80 °C até o experimento por não mais de 2 semanas.

2. Dissociação tecidual

1. Retire a amostra de tecido do congelador de -80 °C e coloque aproximadamente 400 mg do tecido - cortado em fragmentos de 2 mm x 2 mm x 2 mm - na placa de cultura celular de 10 cm na caixa de gelo.
2. Mover o tecido para uma placa de 6 poços com 1,5 mL da solução digestiva; em seguida, colocar a placa no agitador descolorante de transferência (20 rpm/min) para incubar por 20 min a 37 °C para dissociação completa do tecido do câncer de fígado e liberação dos sEVs.
3. Retire a placa de 6 poços da incubadora e coloque-a na caixa de gelo. Adicionar 80 μL de inibidor de fosfatase e 200 μL de solução completa de inibidor de protease para interromper a digestão.
4. Transfira a solução digestiva para o filtro celular de 70 μm e filtre-a lentamente para remover quaisquer grandes detritos de tecido. Recolher o filtrado e colocá-lo num tubo de centrifugação de 2 ml.

3. Ultracentrifugação diferencial

NOTA: Execute todas as etapas de centrifugação a 4 °C.

1. Centrifugar o filtrado a 500 × g durante 10 min e recolher o sobrenadante num novo tubo de centrifugação de 2 ml. A maioria dos pequenos detritos de tecido pode então ser removida.
2. Centrifugar o sobrenadante a 3.000 × g por 20 min para remover detritos celulares. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga até que a ponta da pipeta esteja prestes a tocar a substância branca na superfície.
3. Centrifugar o líquido restante a 3.000 × g por 3 min; Em seguida, aspirar o sobrenadante para facilitar a coleta das vesículas. Para garantir a pureza dos sEVs, certifique-se de que a substância branca não é aspirada.
4. Centrifugar o sobrenadante coletado a 12.000 × g por 20 min e transferir 900 μL do sobrenadante para um tubo de ultracentrífuga de 4,7 mL. Centrifugar o líquido restante a 12.000 × g por 3 min e, em seguida, coletar e misturar ambos os sobrenadantes no mesmo tubo de ultracentrífuga. Encha o tubo completamente com PBS.
5. Centrifugar os sobrenadantes a 100.000 × g por 60 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet enchendo o tubo ultracentrífugo com PBS e centrifugando novamente a 100.000 × g por 60 min. Ressuspender o pellet com 50 μL de PBS.
6. Aspirar a suspensão de sEV usando uma seringa estéril de 1 mL e filtrá-la através de um filtro de membrana de 0,22 μm. Recolher o filtrado num tubo de centrifugação de 600 μL e armazená-lo a -80 °C para análise posterior.

4. Avaliação da qualidade do enriquecimento

1. Observar a morfologia dos sEVs sob microscópio eletrônico de transmissão.
   1. Em seguida, solte 10 μL da amostra de sEV em uma rede de cobre, incube à temperatura ambiente por 10 min e limpe-a com água destilada estéril, usando papel absorvente para remover o excesso de líquido.
   2. Lançar 10 μL de acetato de uranila a 2% sobre a rede de cobre para coloração negativa por 1 min. Use papel de filtro para absorver o líquido na superfície da rede de cobre e seque-o por 2 minutos sob uma lâmpada incandescente.
   3. Observe a tela de cobre sob microscópio eletrônico de transmissão e imagem a 80 kV.
2. Use um citômetro de fluxo de nanopartículas para determinar a distribuição de tamanho e pureza dos sEVs.
   1. Antes da máquina ser ligada, prepare tubos contendo 200 μL de controle de qualidade, 200 μL de nanoesferas de sílica, 2 x 200 μL de água ultrapura, 2 x 200 μL de solução de limpeza e 200 μL de PBS.
      NOTA: Antes de testar as amostras de sEV, é necessário realizar o controle de qualidade no instrumento e testar o padrão de tamanho de partícula (a distribuição de tamanho deve ser calculada usando curvas padrão geradas com várias nanomicroesferas de diâmetros diferentes [68-155 nm] sob a mesma condição de detecção). Esferas de QC e nanoesferas de sílica foram diluídas 100x com água ultrapura em um volume total de 200 μL.
   2. Verificar o volume da solução de limpeza (>10 mL) e observar a diferença entre os níveis do líquido da bainha e do líquido residual (20-30 cm).
   3. Desligue a fonte de alimentação principal do instrumento; Após 20 s, ligue o computador e aguarde os sinais sonoros indicando que o instrumento está conectado corretamente para executar o software.
   4. Clique em Iniciar para ligar a câmera, o laser e a bomba de ar.
   5. Clique em Bainha Flow-Start Up e coloque água ultrapura na plataforma de carregamento. Após 4 min (contagem regressiva do instrumento), clique em Sample-Boosting | Amostra-Descarga.
   6. Após 30 s, coloque o tubo em branco na plataforma de carregamento e clique em Sample-Boosting | Amostra-Descarga. Em seguida, coloque o tubo que segura a água ultrapura na plataforma de carregamento e, simultaneamente, clique em Sample-Boost | Bainha Flow-Purge.
   7. Clique em Operação Manual e coloque o tubo de concentração de partículas na plataforma de carregamento. Em seguida, clique em Sample-Boosting por 1 min e selecione simultaneamente o controle de qualidade de 250 nm Std FL SiNPs em "SAMP. Inf."
   8. Clique em Amostragem-Amostragem e ligue o detector clicando em SPCM.
      NOTA: Neste ponto, a forma de onda do sinal em tempo real pode ser vista.
   9. Clique em Auto Sampling e insira 1.0 em Sampling SET para fixar a pressão em 1 KPa. Clique na barra de ferramentas e selecione Sinal grande.
   10. Ajustar a posição horizontal do laser e ajustá-lo a 2 μm; em seguida, clique em L ou R para se certificar de que o sinal é forte e uniforme.
   11. Clique em Time to Record para coletar os dados, que saltarão automaticamente para o Buffer quando terminarem. Em seguida, salve os dados em um arquivo Naf e clique em Sample-Unload.
   12. Coloque o tubo da solução de limpeza na plataforma de carregamento, clique em Sample-Boosting e, após 1 min, clique em Sample-Unload. Use água ultrapura para remover a solução de limpeza residual da ponta capilar.
   13. Coloque o tubo padrão de tamanho de partícula na plataforma de carregamento e clique em Sample-Boosting por 1 min.
   14. Selecione 68-155 nm Std FL SiNPs controle de qualidade em "SAMP. Inf" e clique em Amostragem-Amostragem. Em seguida, clique na barra de ferramentas e selecione Sinal pequeno.
   15. Clique em Time to Record para coletar os dados, que saltarão automaticamente para o Buffer quando terminarem. Em seguida, salve os dados em um arquivo Naf e clique em Sample-Unload.
   16. Coloque o tubo da solução de limpeza na plataforma de carregamento, clique em Sample-Boosting e clique em Sample-Unload após 1 min. Use água ultrapura para remover a solução de limpeza residual da ponta capilar.
   17. Colocar o tubo PBS na plataforma de carga; clique em Sample-Boosting por 1 min.
   18. Selecione 68-155 nm Std FL SiNPs controle de qualidade em "SAMP. Inf" e clique em Amostragem-Amostragem. Em seguida, clique na barra de ferramentas e selecione Sinal pequeno.
   19. Clique em Time to Record para coletar dados, que saltarão automaticamente para o Buffer quando terminar. Salve os dados em um arquivo Naf e clique em Sample-Unload.
   20. Coloque o tubo da solução de limpeza na plataforma de carregamento, clique em Sample-Boost e Sample-Unload após 1 min. Use água ultrapura para remover a solução de limpeza residual da ponta capilar.
   21. Verifique as informações de amostra descritas anteriormente nas etapas 4.2.17-4.2.20; alterar o PBS (etapa 4.2.17) para a amostra de sEV e analisar os dados.
3. Identifique ainda mais os sEVs por western blot.
   1. Determine as concentrações de proteínas dos sEVs e tecidos usando o kit de quantificação de proteína BCA de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Calcule o volume de carga de sEVs (por exemplo, para 5 μg de proteína por poço) com base nesses resultados quantitativos. Adicione o tampão de carga na proporção de 1:4 e espalhe a mistura.
   3. Após a desnaturação em banho metálico a 100 °C (termostato seco) durante 10 minutos, separar a proteína num gel de poliacrilamida a 12% a 60 V durante 80 minutos.
   4. Transferir o gel para uma membrana de difluoreto de polivinilideno 0,22 μm a 220 mA por 2 h usando tampão de transferência (Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol 20%).
   5. Bloquear a membrana com 5% de leite em pó desnatado em solução salina Tween tamponada com Tris (TBST) por 1 h à temperatura ambiente e incubar com anticorpo primário (anticorpo CD9 monoclonal de coelho, anticorpo CD63 monoclonal de coelho anti-humano, anticorpo anti-humano TSG101 monoclonal de coelho, anticorpo GM130 monoclonal de camundongo anti-humano) durante a noite a 4 °C. Diluir os anticorpos primários em leite desnatado a 5% a 1:1.000.
   6. Após três lavagens com TBST, incubar a membrana com anticorpo secundário conjugado à horseradish peroxidase (HRP) à temperatura ambiente por 1 h.
   7. Detectar o anticorpo ligado à HRP usando o substrato de blotting ECL e, em seguida, coletar e analisar as imagens.

Resultados

Os sEVs de tecidos de câncer de fígado humano têm desempenhado um papel crucial no diagnóstico, tratamento e prognóstico de pacientes com câncer de fígado. Este método usou instrumentos de laboratório comuns para isolar e purificar sEVs derivados de tecidos de câncer de fígado; isso pode fornecer suporte metodológico para o estudo de EVs. A Figura 2 ilustra o processo geral de enriquecimento de EVs de tecidos de câncer de fígado. Os sEVs nos espaços intercelulares dos tecidos ...

Discussão

Este protocolo descreve um método repetível para extrair sEVs do tecido de câncer de fígado. Os sEVs de alta qualidade são obtidos por isolamento tecidual nítido, tratamento com enzimas digestivas, ultracentrifugação diferencial e filtração e purificação da membrana filtrante de 0,22 μm. Para a análise a jusante, é extremamente importante garantir a alta pureza dos sEVs. No processo de centrifugação diferencial, uma camada de substâncias brancas (composição desconhecida) aparecerá na superfície do s...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Membrane Filter Unit	Millex	SLGPR33RB
1 mL Sterile syringe	Hubei Xianming Medical Instrument Company	YL01329
2% Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400-2
4.7 mL Centrifuge Tube	Beckman Coulter	361621
6-well Cell cuture plate	LABSELECT	11110
50 mL Beaker	Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company	CF2100800
70 µm Cell strainer	Biosharp	BS-70-XBS
100 mm Cell culture dish	CELL TER	CS016-0128
600 µL Centrifuge tube	Axygen	MCT060C
BCA protein quantification kit	Thermo Fisher	RJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TL	Beckman	A95761
BioRad Mini trans-blot	Bio-Rad	1703930
BioRad Mini-Protean	Bio-Rad	1645050
CD63 Antibody	Abcam	ab134045
CD9 Antibody	Abcam	ab263019
Centrifuge 5430R	Eppendorf	5428HQ527333
Cleaning Solution	NanoFCM	C1801
Collagenase D	Roche	11088866001
Copper net	Henan Zhongjingkeyi Technology Company	DJZCM-15-N1
Dry Thermostat	Hangzhou allsheng instruments company	AS-01030-00
FITC Anti Human CD9 Antibody	Elabscience	E-AB-F1086C
Glycine	Solarbio	G8200
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody	Proteintech	SA00001-1
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody	Proteintech	SA00001-2
Methanol	Shanghai Zhenxing Chemical Company
Nanoparticle flow cytometer	NanoFCM INC	FNAN30E20112368
Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)	Roche	4906845001
Phosphate Buffered Saline(PBS)	Servicebio	G4202
Polyvinylidene Difluoride Membrane	Solarbio	ISEQ00010
QC Beads	NanoFCM	QS2502
RPMI-1640 basic medium	Biological Industries	C11875500BT
Scalpel	Guangzhou Kehua Trading Company	NN-0623-1
Silica Nanospheres	NanoFCM	S16M-Exo
Transference Decoloring Shaker TS-8	Kylin-Bell	E0018
Transmission Electron Microscope	Thermo Scientific	Talos L120C
Tris	Solarbio	T8060
TSG101 Antibody	Proteintech	28283-1-AP
Tweezer	Guangzhou Lige Technology Company	LG01-105-4X