Um método de enriquecimento para pequenas vesículas extracelulares derivadas do tecido de câncer de fígado

Resumo

Descrevemos aqui o enriquecimento de pequenas vesículas extracelulares derivadas de tecido de câncer hepático através de um método otimizado de ultracentrifugação diferencial.

Resumo

Pequenas vesículas extracelulares (EVs) derivadas do tecido podem refletir o estado funcional das células-fonte e as características do espaço intersticial do tecido. O enriquecimento eficiente desses sEVs é um pré-requisito importante para o estudo de sua função biológica e uma chave para o desenvolvimento de técnicas de detecção clínica e tecnologia de carreadores terapêuticos. É difícil isolar os sEVs do tecido porque eles geralmente estão fortemente contaminados. Este estudo fornece um método para o enriquecimento rápido de sEVs de alta qualidade do tecido do cancro do fígado. O método envolve um processo de quatro etapas: incubação de enzimas digestivas (colagenase D e DNase Ι) com tecido, filtração através de filtro celular de 70 μm, ultracentrifugação diferencial e filtração através de filtro de membrana de 0,22 μm. Devido à otimização da etapa de ultracentrifugação diferencial e à adição de uma etapa de filtração, a pureza dos sEVs obtidos por este método é maior do que a obtida pela ultracentrifugação diferencial clássica. Ele fornece uma metodologia importante e dados de apoio para o estudo de sEVs derivados de tecido.

Introdução

Pequenas vesículas extracelulares (EVs) têm aproximadamente 30 nm a 150 nm de diâmetro e são secretadas por várias células¹. Eles podem se comunicar com as células do tecido e regular o microambiente local ou distante, transportando moléculas biológicas importantes, como lipídios, proteínas, DNA e RNA para vários órgãos, tecidos, células e partes intracelulares. Assim, também podem alterar o comportamento das células receptoras ^2,3. O isolamento e purificação de sEVs específicos é um pré-requisito essencial para estudar seu comportamento biológico durante o desenvolvimento e curso da do....

Protocolo

O tecido de câncer de fígado humano foi coletado de pacientes diagnosticados com malignidade hepática no Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina de Gannan. Todos os pacientes assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido, e a coleta de amostras de tecido humano foi aprovada pelo comitê de ética do First Affiliated Hospital of Gannan Medical University. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, equipamentos e softwares usados neste protocolo.

1. Preparo

1. Coloque o agitador descorante de transferência na incubadora e ajuste a temper....

Resultados

Os sEVs de tecidos de câncer de fígado humano têm desempenhado um papel crucial no diagnóstico, tratamento e prognóstico de pacientes com câncer de fígado. Este método usou instrumentos de laboratório comuns para isolar e purificar sEVs derivados de tecidos de câncer de fígado; isso pode fornecer suporte metodológico para o estudo de EVs. A Figura 2 ilustra o processo geral de enriquecimento de EVs de tecidos de câncer de fígado. Os sEVs nos espaços intercelulares dos tecidos .......

Discussão

Este protocolo descreve um método repetível para extrair sEVs do tecido de câncer de fígado. Os sEVs de alta qualidade são obtidos por isolamento tecidual nítido, tratamento com enzimas digestivas, ultracentrifugação diferencial e filtração e purificação da membrana filtrante de 0,22 μm. Para a análise a jusante, é extremamente importante garantir a alta pureza dos sEVs. No processo de centrifugação diferencial, uma camada de substâncias brancas (composição desconhecida) aparecerá na superfície do s.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Membrane Filter Unit	Millex	SLGPR33RB
1 mL Sterile syringe	Hubei Xianming Medical Instrument Company	YL01329
2% Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400-2
4.7 mL Centrifuge Tube	Beckman Coulter	361621
6-well Cell cuture plate	LABSELECT	11110
50 mL Beaker	Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company	CF2100800
70 µm Cell strainer	Biosharp	BS-70-XBS
100 mm Cell culture dish	CELL TER	CS016-0128
600 µL Centrifuge tube	Axygen	MCT060C
BCA protein quantification kit	Thermo Fisher	RJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TL	Beckman	A95761
BioRad Mini trans-blot	Bio-Rad	1703930
BioRad Mini-Protean	Bio-Rad	1645050
CD63 Antibody	Abcam	ab134045
CD9 Antibody	Abcam	ab263019
Centrifuge 5430R	Eppendorf	5428HQ527333
Cleaning Solution	NanoFCM	C1801
Collagenase D	Roche	11088866001
Copper net	Henan Zhongjingkeyi Technology Company	DJZCM-15-N1
Dry Thermostat	Hangzhou allsheng instruments company	AS-01030-00
FITC Anti Human CD9 Antibody	Elabscience	E-AB-F1086C
Glycine	Solarbio	G8200
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody	Proteintech	SA00001-1
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody	Proteintech	SA00001-2
Methanol	Shanghai Zhenxing Chemical Company
Nanoparticle flow cytometer	NanoFCM INC	FNAN30E20112368
Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)	Roche	4906845001
Phosphate Buffered Saline(PBS)	Servicebio	G4202
Polyvinylidene Difluoride Membrane	Solarbio	ISEQ00010
QC Beads	NanoFCM	QS2502
RPMI-1640 basic medium	Biological Industries	C11875500BT
Scalpel	Guangzhou Kehua Trading Company	NN-0623-1
Silica Nanospheres	NanoFCM	S16M-Exo
Transference Decoloring Shaker TS-8	Kylin-Bell	E0018
Transmission Electron Microscope	Thermo Scientific	Talos L120C
Tris	Solarbio	T8060
TSG101 Antibody	Proteintech	28283-1-AP
Tweezer	Guangzhou Lige Technology Company	LG01-105-4X