زراعة خلايا IDG-SW3 في مصفوفة ثلاثية الأبعاد خارج الخلية

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لزراعة خلايا IDG-SW3 في مصفوفة ثلاثية الأبعاد (3D) خارج الخلية.

Abstract

تعتبر الخلايا العظمية خلايا غير تكاثرية متمايزة بشكل نهائي عن بانيات العظم. تعبر بانيات العظم المضمنة في المصفوفة العظمية خارج الخلية (العظمية) عن جين Pdpn لتكوين الزوائد الشجيرية الخلوية والتحول إلى خلايا ما قبل العظم. في وقت لاحق ، تعبر الخلايا العظمية السابقة عن جين Dmp1 لتعزيز تمعدن المصفوفة وبالتالي تتحول إلى خلايا عظمية ناضجة. وتسمى هذه العملية تكوين الخلايا العظمية. IDG-SW3 هو خط خلايا معروف للدراسات في المختبر لتكوين الخلايا العظمية. استخدمت العديد من الطرق السابقة الكولاجين I باعتباره المكون الرئيسي أو الوحيد لمصفوفة الاستزراع. ومع ذلك ، بالإضافة إلى الكولاجين الأول ، يحتوي العظم العظمي أيضا على مادة أرضية ، وهي عنصر مهم في تعزيز نمو الخلايا والالتصاق والهجرة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مادة المصفوفة شفافة ، مما يزيد من شفافية هلام الكولاجين I ، وبالتالي يساعد في استكشاف تكوين التغصنات من خلال تقنيات التصوير. وبالتالي ، فإن هذه الورقة تفصل بروتوكولا لإنشاء هلام ثلاثي الأبعاد باستخدام مصفوفة خارج الخلية جنبا إلى جنب مع الكولاجين I لبقاء IDG-SW3. في هذا العمل ، تم تحليل تكوين التغصنات والتعبير الجيني أثناء تكوين الخلايا العظمية. بعد 7 أيام من الثقافة العظمية ، لوحظت شبكة تغصنات واسعة النطاق بوضوح تحت مجهر متحد البؤر مضان. أظهر تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي أن مستويات mRNA من Pdpn و Dmp1 زادت باستمرار لمدة 3 أسابيع. في الأسبوع 4 ، كشف المجهر المجسم عن هلام معتم مليء بالجزيئات المعدنية ، بما يتفق مع مقايسة مضان الأشعة السينية (XRF). تشير هذه النتائج إلى أن مصفوفة الثقافة هذه تسهل بنجاح الانتقال من بانيات العظم إلى الخلايا العظمية الناضجة.

Introduction

الخلايا العظمية هي خلايا متمايزة بشكل نهائي مشتقة من بانيات العظم ^1,2. بمجرد دفن بانيات العظم بواسطة العظم العظمي ، فإنه يخضع لتكوين الخلايا العظمية ويعبر عن جين Pdpn لتشكيل الخلايا العظمية ، وجين Dmp1^{لتمعدن العظم ، وجينات} Sost و Fgf23 لتعمل كخلية عظمية ناضجة في أنسجة العظام³. هنا ، يتم تقديم نظام زراعة 3D لتحديد امتداد التغصنات والتعبير الجيني علامة في عملية تكوين الخلايا العظمية.

خلايا IDG-SW3 هي خط خلايا أولي خالد مشتق من الفئران المعدلة وراثيا ويمكنها توسيع أو تكرار بانيات العظم إلى تمايز الخلايا العظمية المتأخرة عند زراعتها في وسائط مختلفة⁴. بالمقارنة مع MLO-A5 و MLO-Y4 وخطوط الخلايا الأخرى ، من المرجح أن يكون ملف تعريف التعبير للبروتينات الوظيفية ، والقدرة على أداء ترسب ملح الكالسيوم ، والاستجابات للهرمونات المختلفة في خلايا IDG-SW3 هي نفسها تلك الموجودة في الخلايا العظمية الأولية في الأنسجة العظمية⁴.

بالمقارنة مع أنظمة 2D ، فإن أنظمة الزراعة ثلاثية الأبعاد أكثر قدرة على محاكاة بيئة النمو الخلوي في الجسم الحي ، بما في ذلك تدرج المغذيات ، والصلابة الميكانيكية المنخفضة ، والنطاق الميكانيكي المحيط (الجدول 1). استخدمت معظم الطرق السابقة لزراعة الخلايا العظمية في نظام ثلاثي الأبعاد الكولاجين I كمكون فريد في التركيبات⁴،^{5،6 ،} لأن ألياف الكولاجين I تعمل كموقع لترسب الكالسيوم والفوسفور. ومع ذلك ، فإن المكون الذي لا غنى عنه في العظم ، المصفوفة خارج الخلية ، يحتوي على مجموعة كبيرة من العوامل الخلوية التي تعزز النمو الخلوي والالتصاق والهجرة ^7,8 وهو شفاف ومناسب لمراقبة التصوير. وبالتالي ، يستخدم هذا البروتوكول Matrigel (المشار إليه فيما يلي باسم مصفوفة الغشاء القاعدي) كمكون ثانوي لدراسة تكوين الخلايا العظمية.

Protocol

هذا البروتوكول مناسب لزراعة الخلايا في أربعة آبار من 24 صفيحة. في حالة تحضير عينات أو ألواح متعددة ، يجب زيادة كميات الكواشف وفقا لذلك.

1. تحضير خليط الكولاجين الأول

ملاحظة: الكولاجين I وهلام مصفوفة الغشاء القاعدي بسرعة في درجة حرارة الغرفة. لذلك ، يجب التعامل مع الكولاجين على الثلج (2 درجة مئوية إلى 8 درجات مئوية). يجب تبريد جميع الأطراف والأنابيب المستخدمة ما لم يذكر خلاف ذلك. يجب تنفيذ جميع الإجراءات في غطاء أمان.

1. ضع جميع الكواشف وأنابيب الطرد المركزي على الجليد.
2. ماصة ببطء 0.48 مل من الكولاجين I (5 مجم / مل) و 0.1 مل من 10x الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) (مع الفينول الأحمر) في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل يتم الاحتفاظ به على الجليد. تخلط جيدا عن طريق سحب اللأعلى ولأسفل برفق.
3. وفقا للوحة ألوان مؤشر الفينول الأحمر ، استخدم حجما مناسبا بنسبة 7.5٪ (وزن / حجم) NaHCO₃ (حوالي 0.2 مل) لضبط مؤشر الفينول الأحمر إلى اللون البرتقالي ، مما يشير إلى أن قيمة الأس الهيدروجيني في حدود 7.0-7.4.
   ملاحظة: اعتمادا على الرقم الهيدروجيني للوسط ، يتم استخدام حجم NaHCO₃ لرفع الرقم الهيدروجيني إلى حوالي 7.0-7.4. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام NaOH لتحييد الأس الهيدروجيني.
4. ارفع الحجم النهائي للخليط إلى 1 مل عن طريق إضافة حجم مناسب من ddH₂O. امزج جيدا عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل للتحضير للاستخدام.
   ملاحظة: يعتمد الحجم النهائي ل ddH₂O على كمية NaHCO 3 أو NaOH المستخدمة في الخطوة_1.3 .

2. تحضير خليط مصفوفة الخلية

1. ماصة ببطء 0.9 مل من مصفوفة الغشاء القاعدي في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل على الجليد.
2. استزرع خلايا IDG-SW3 في دورق T25 مع 4 مل من الوسط الكامل (alpha-MEM يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني [FBS]) مع 50 وحدة / مل INF-γ عند 33 درجة مئوية.
3. بمجرد أن تصل خلايا IDG-SW3 إلى التقاء 90٪ ، قم بإزالة الوسط ، واغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، درجة الحموضة 7.4 طوال البروتوكول) باستخدام ماصة. هضم الخلايا مع 0.5 مل من 0.25٪ حمض التربسين-إيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
4. قم بإلغاء تنشيط التربسين بإضافة 3.5 مل من الوسط الكامل (alpha-MEM يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني [FBS]). انقل تعليق الخلية 4 مل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
5. قم بتدوير معلق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من الوسط الكامل على الثلج.
6. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم واضبط كثافة الخلية النهائية باستخدام الوسط الكامل إلى 4 × 10⁵ خلايا / مل. أضف 0.1 mL من معلق الخلية المحضر إلى 0.9 mL من المصفوفة خارج الخلية من الخطوة 2.1. تخلط جيدا عن طريق سحب بلطف لأعلى ولأسفل.
   ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى عنصر تحكم خال من الخلايا ، أضف 0.1 مل من الوسط الكامل إلى 0.9 مل من المصفوفة خارج الخلية كعنصر تحكم سلبي.

3. تصفيح خليط هلام الخلية

1. اخلطي الخليطين جيدا من الخطوة 2.6 والخطوة 1.4 إلى 2 مل عن طريق سحب الثلج لأعلى ولأسفل. ماصة 0.5 مل من الخليط النهائي في كل بئر (أربعة آبار من صفيحة 24 بئر). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لتشكيل خليط هلام الخلية.
2. أضف 0.5 مل من الوسط العظمي المنشأ (وسط كامل يحتوي على 50 ميكروغرام / مل من حمض الأسكوربيك و 4 مللي مول β-glycerophosphate ، المعروف أيضا باسم وسط الحث العظمي)⁴ إلى خليط هلام الخلية في كل بئر لبدء التمايز العظمي عند 37 درجة مئوية. اعتبر هذا اليوم 0.
3. كل 2 يوم، استبدل نصف الوسط بوسط عظمي جديد يتم الحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية. استمر في الزراعة لمدة 35 يوما.

4. تحديد صلاحية الخلية والتشعبات الخلوية باستخدام مجهر متحد البؤر

1. تلطيخ الخلايا
   ملاحظة: Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) عبارة عن صبغة ذات خلايا يمكن استخدامها لتحديد صلاحية الخلية. Ethidium homodimer-I (EthD-1) لا يعبر غشاء الخلايا السليمة / القابلة للحياة⁹. وبالتالي ، يمكن استخدام الكالسيين AM / EthD-1 لتحديد صلاحية الخلية والتشعبات الخلوية.
   1. في اليوم الأول واليوم 7 من المزرعة ، قم بإزالة محلول مخزون calcein AM (4 mM في DMSO) ومحلول مخزون EthD-1 (2 mM في DMSO / H₂O 1: 4 [v / v]) من الفريزر ، واتركها تسخن إلى درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: تحتوي المصفوفة المعدنية على إشارة تألق ذاتي قوية ، وبالتالي فإن مرحلة الخلايا قبل العظمية بدون تعبير Dmp1 في غضون 7 أيام من الزراعة⁴ تكون أكثر ملاءمة لمراقبة تلطيخ الخلايا.
   2. أضف 4 ميكرولتر من محلول مخزون EthD-1 2 mM و 5 ميكرولتر من محلول مخزون 4 mM Calcein AM إلى 2 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (D-PBS) ، واخلطه جيدا. هذا يعطي ما يقرب من 2 ميكرومتر كالسيين AM و 4 ميكرومتر EthD-1 كحلول عمل.
   3. ماصة 0.5 مل من محلول العمل في الآبار في لوحة 24 بئرا. احتضان لمدة 30-45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتلطيخ مصفوفة هلام الخلية.
   4. بعد الحضانة ، أضف ما يقرب من 0.5 مل من D-PBS الطازج إلى طبق استزراع جديد بقاع زجاجي مقاس 35 مم. قم بتغطية الطبق لمنع تلوث العينات أو تجفيفها.
   5. باستخدام ملقط ذو رأس الكوع ، انقل بعناية مصفوفة هلام الخلية الملطخة من الخطوة 4.1.3 إلى طبق الاستزراع 35 مم من الخطوة 4.1.4. تجنب إتلاف أو قص مصفوفة هلام الخلية.
   6. عرض الخلايا المسمى تحت المجهر الفلوري متحد البؤر بالليزر.
2. مجموعة المسح المجهري
   1. ضع طبق 35 مم على المسرح. حدد مناطق مصفوفة هلام الخلية المراد مسحها ضوئيا من خلال العدسة باستخدام هدف 10x. لا يوصى بأهداف التكبير العالي بسبب حجم التشعبات الممتدة.
   2. حدد المرشحات البصرية. يمكن النظر إلى Calcein على أنه أخضر مع مرشح تمرير نطاق فلوريسئين قياسي ، ويمكن رؤية EthD-1 باللون الأحمر مع مرشحات ليوديد البروبيديوم أو صبغة تكساس الحمراء. حدد "وضع الخط" للمسح واضبط "الثقب" على 2 ميكرومتر.
   3. حدد عمق بيانات يبلغ 8 بت ودقة وضوح صورة تبلغ 1024 بكسل × 1024 بكسل.
   4. الصورة باستخدام المسح الضوئي الخطي المتسلسل مع إعدادات الليزر والكاشف المثلى (احتفظ بأقل قدر من طاقة الليزر لتجنب التبييض الضوئي المحتمل).
      ملاحظة: يعتمد الإعداد الأمثل للكاشف على إشارات التألق النهائية.
3. جمع "z-stack" من الصور
   1. وفقا لإشارة القناة الخضراء ، حدد المواضع العلوية والسفلية لمصفوفة هلام الخلية المراد مسحها ضوئيا من خلال التركيز عبر العينة أثناء المسح المستمر.
   2. بمجرد تحديد الجزء العلوي والسفلي من العينة ، حدد إطار المسح المطلوب. ابدأ المسح. سيتم مسح العينة ضوئيا من أعلى إلى أسفل باستخدام الإعدادات المحددة من الخطوة 4.2 ، مما يؤدي إلى إنشاء معرض للصور.
4. تحديد صلاحية الخلية.
   1. حدد شريحة واحدة من الخطوة 4.3. تشير القنوات الخضراء والحمراء إلى الخلايا الحية والميتة ، على التوالي.
5. تحديد الزوائد الشجيرية الخلوية.
   1. حدد القناة الخضراء الواحدة لإنشاء عمليات إعادة بناء 3D باستخدام برنامج الحصول على الصور. يتم عرض معلومات العمق كسلسلة من صور الألوان الزائفة لقوس قزح. يتم عرض الزوائد الشجيرية الموجودة في الجزء السفلي من الجل باللون الأحمر ، بينما يتم عرض تلك الموجودة في الجزء العلوي باللون الأزرق.

5. تحديد المظهر باستخدام المجهر المجسم

1. في اليوم 1 واليوم 7 واليوم 21 واليوم 35 من الثقافة ، قم بإزالة وسط الاستزراع ، واغسل المواد الهلامية في الطبق مرتين باستخدام D-PBS. أضف 0.5 مل من 4٪ (v / v) بارافورمالدهيد في D-PBS إلى البئر لإصلاح مصفوفة هلام الخلية في اللوحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2. قم بإزالة paraformaldehyde في البئر وغسل مصفوفة هلام الخلية مرتين أخريين باستخدام D-PBS في اللوحة. اترك 0.5 مل من D-PBS في كل بئر للتصوير.
3. ضع اللوحة على المسرح وحدد الموضع الأمثل من خلال العدسة باستخدام هدف 0.5x. تخيل عرض المجال الكامل لمصفوفة هلام الخلية في اللوحة بشكل فردي باستخدام "التعرض التلقائي" أسفل الحقل الساطع.

6. تحديد ترسب المعادن باستخدام مقايسة XRF

1. في اليوم 35 من الثقافة ، تحقق مما إذا كان النيتروجين السائل كافيا. بدء تشغيل نظام XRF. افتح غرفة العينة وانقل المواد الهلامية بالملقط ذي رأس الكوع من اللوحة إلى منتصف مرحلة العينة للأداة. أغلق غرفة العينة وانتظر لمدة 30 دقيقة للسماح للأداة بالتبريد قبل الاستخدام.
2. اضبط "وقت التعرض" على 35 مللي ثانية ، و "نطاق الطيف" على 0-40 كيلو فولت ، و "التيار الكهربائي" على 770 ميكروأمبير لإعداد الاستحواذ.
3. اختر ثلاثة إلى خمسة مواقع مسح للتحليل عن طريق تحريك مرحلة العينة.
4. حدد العناصر (Ca و P) للكشف. ابدأ الكشف وتصدير النتائج.
   ملاحظة: الكالسيوم و P هما العنصران الأكثر وفرة في هيدروكسيباتيت.

7. تحديد التعبير الجيني الوظيفي

1. في اليوم 1 واليوم 7 واليوم 21 واليوم 28 واليوم 35 من الثقافة ، قم بإزالة وسط الزراعة وغسل مصفوفة هلام الخلية مرتين باستخدام D-PBS البارد في اللوحة.
2. انقل المواد الهلامية باستخدام ملقط برأس الكوع من اللوحة إلى أنبوب سعة 2.0 مل (وفقا لوقت المزرعة ، ستتقلص مصفوفة هلام الخلية تدريجيا إلى حوالي 0.1 مل في اليوم 35). تأكد من وضع هلام واحد في أنبوب واحد. أضف 1 مل من الفينول كلوروفورم واثنين من حبات الضرب المعقمة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ (4 مم ، كمصفوفة تحليل) في كل أنبوب. ضع الأنابيب بشكل متماثل في فتحة العينة المبردة مسبقا لمجاهد الضرب الميكانيكي.
3. اضبط الضرب على تردد 55 هرتز وسعة 1 سم في كل دقيقة واحدة من الضرب الميكانيكي مع توقف مؤقت لمدة 10 ثوان ، مع ست دورات في المجموع. ابدأ الضرب بالخرزة.
4. استخرج الحمض النووي الريبي الكلي من مصفوفة هلام الخلية باستخدام طريقة الفينول - الكلوروفورم - إيزاميلاتشوهول. نسخ عكسي 2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي إلى cDNA باستخدام بادئات سداسية عشوائية.
5. تصميم الاشعال التي تستهدف β-actin و Pdpn و Dmp1 و Sost و Fgf23 لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (الجدول 2). β-Actin هو جين التدبير المنزلي المستخدم للتطبيع. يتم التعبير عن جينات Pdpn¹⁰ و Dmp1 11 بشكل أساسي في الخلايا العظمية السابقة والخلايا العظمية المعدنية ، في حين يتم التعبير عن Sost¹² و Fgf23 ¹³ بشكل أساسي في الخلايا العظمية الناضجة.
6. ضع الأنبوب على جهاز تدوير حراري مع ضبط الغطاء المسخن على 105 درجة مئوية وقم بإجراء تضخيم PCR باستخدام إعدادات دورة PCR التالية: 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية لمدة 35 دورة مع خطوة تمسخ أولية عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وخطوة تمديد نهائية عند 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. تحليل تغييرات الطي باستخدام طريقة ΔΔCt.

النتائج

بعد تلطيخ الخلايا الحية / الميتة ، تم تصور الخلايا باستخدام مجهر ليزر متحد البؤر. كانت جميع الخلايا إيجابية للكالسيين AM (اللون الأخضر) ، ولم تكن هناك تقريبا خلايا إيجابية EthD-1 (اللون الأحمر) في الحقل ، مما يشير إلى أن نظام الهلام المصنوع بهذه الطريقة مناسب للغاية لتكوين الخلايا العظمية (

Discussion

النقطة الحرجة في هذا البروتوكول هي أنه يجب تنفيذ الخطوتين 1 و 2 على الجليد لمنع التخثر التلقائي. في هذه الطريقة ، كان التركيز النهائي للكولاجين I 1.2 مجم / مل. وبالتالي ، يجب حساب حجم ddH₂O الأمثل لمطابقة الكولاجين المختلفة من مختلف الشركات المصنعة.

في الجسم الحي ، ينطوي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid	Hyclone	SH30042.01
15 mL tubes	Corning, NY, USA	430791
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, MO, USA	S8761
ascorbic acid	Sigma-Aldrich, MO, USA	A4544
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogenizer	BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China	SKSI
laser confocal fluorescence microscopy	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	LSM 800
Live/Dead Cell Imaging kit	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel matrix	Corning, NY, USA	356234
MEM (10X), no glutamine	Thermo Fisher Scientific	21430079
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, MO, USA	158127
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.FS
stereo microscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
X-ray fluorescence	EDAX, USA	EAGLE III
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422