Cultivo de Células IDG-SW3 em Matriz Tridimensional Extracelular

Resumo

Apresentamos aqui um protocolo para cultivo de células IDG-SW3 em uma matriz extracelular tridimensional (3D).

Resumo

Os osteócitos são considerados células não proliferativas que se diferenciam terminalmente dos osteoblastos. Osteoblastos embutidos na matriz extracelular óssea (osteóide) expressam o gene Pdpn para formar dendritos celulares e transformar-se em preosteócitos. Posteriormente, os pré-osteócitos expressam o gene Dmp1 para promover a mineralização da matriz e, assim, transformar-se em osteócitos maduros. Esse processo é chamado de osteocitogênese. IDG-SW3 é uma linhagem celular bem conhecida para estudos in vitro de osteocitogênese. Muitos métodos anteriores utilizaram o colágeno I como principal ou único componente da matriz de cultivo. No entanto, além do colágeno I, o osteóide também contém uma substância fundamental, que é um componente importante na promoção do crescimento, adesão e migração celular. Além disso, a substância da matriz é transparente, o que aumenta a transparência do gel formado pelo colágeno I e, assim, auxilia a exploração da formação de dendritos por meio de técnicas de imagem. Assim, este trabalho detalha um protocolo para estabelecer um gel 3D usando uma matriz extracelular juntamente com colágeno I para a sobrevivência do IDG-SW3. Neste trabalho, a formação de dendritos e a expressão gênica foram analisadas durante a osteocitogênese. Após 7 dias de cultura osteogênica, uma extensa rede dendrítica foi claramente observada sob microscópio confocal de fluorescência. A PCR em tempo real mostrou que os níveis de RNAm de Pdpn e Dmp1 aumentaram continuamente por 3 semanas. Na semana 4, o estereomicroscópio revelou um gel opaco preenchido com partículas minerais, consistente com o ensaio de fluorescência de raios X (XRF). Estes resultados indicam que esta matriz de cultura facilita com sucesso a transição de osteoblastos para osteócitos maduros.

Introdução

Os osteócitos são células terminalmente diferenciadas derivadas dos^{osteoblastos1,2}. Uma vez sepultado pelo osteóide, o osteoblasto sofre osteocitogênese e expressa o gene Pdpn para formar preosteócitos, o gene Dmp1 para ^{mineralizar o osteóide e os} genes Sost e Fgf23 para funcionar como osteócito maduro no tecido ósseo3. Aqui, um sistema de cultura 3D é introduzido para identificar a extensão dos dendritos e a expressão gênica de marcadores no processo de osteocitogênese.

As células IDG-SW3 são uma linhagem celular primária imortalizada derivada de camundongos transgênicos e podem expandir ou replicar osteoblastos para diferenciação tardia de osteócitos quando cultivadas em diferentes^meios4. Em comparação com MLO-A5, MLO-Y4 e outras linhagens celulares, o perfil de expressão de proteínas funcionais, a capacidade de realizar deposição de sal de cálcio e as respostas a vários hormônios em células IDG-SW3 são mais prováveis de serem as mesmas que as de osteócitos primários no tecido^ósseo4.

Comparados aos sistemas 2D, os sistemas de cultivo 3D são mais capazes de mimetizar o ambiente de crescimento celular in vivo, incluindo o gradiente de nutrientes, baixa rigidez mecânica e faixa mecânica circundante (Tabela 1). A maioria dos métodos anteriores de cultivo de células osteoblásticas em sistema 3D utilizava o colágeno I como único componente nas formulações ^4,5,6, pois as fibras colágenas I servem como local de deposição de cálcio e fósforo. Entretanto, um constituinte indispensável no osteóide, a matriz extracelular, contém um grande grupo de fatores celulares que promovem o crescimento, adesão e migração^celular7,8 e é transparente e conveniente para a observação por imagem. Assim, este protocolo utiliza o Matrigel (doravante denominado matriz de membrana basal) como componente secundário para o estudo da osteocitogênese.

Protocolo

Este protocolo é adequado para o cultivo de células em quatro poços de placas de 24 poços. Se preparar várias amostras ou placas, as quantidades dos reagentes devem ser aumentadas em conformidade.

1. Preparação da mistura de colágeno I

NOTA: Colágeno I e gel de matriz de membrana basal rapidamente à temperatura ambiente. Portanto, o colágeno deve ser manipulado no gelo (2 °C a 8 °C). Todas as pontas e tubos utilizados devem ser pré-refrigerados, salvo indicação em contrário. Todos os procedimentos devem ser realizados em uma capa de segurança.

1. Coloque todos os reagentes e tubos de centrífuga no gelo.
2. Pipetar lentamente 0,48 mL de colágeno I (5 mg/mL) e 0,1 mL de meio essencial mínimo (MEM) 10x (com vermelho de fenol) para um tubo centrífugo estéril de 15 mL mantido em gelo. Misture bem pipetando para cima e para baixo suavemente.
3. De acordo com a paleta de cores do indicador vermelho fenol, use um volume apropriado de 7,5% (p/v) de NaHCO₃ (aproximadamente 0,2 mL) para ajustar o indicador vermelho de fenol para laranja, o que indica que o valor de pH está na faixa de 7,0-7,4.
   NOTA: Dependendo do pH do meio, um volume de NaHCO₃ é usado para trazer o pH para aproximadamente 7,0-7,4. Além disso, o NaOH é usado para neutralização do pH.
4. Leve o volume final da mistura até 1 mL adicionando um volume apropriado de ddH₂O. Misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo para se preparar para o uso.
   NOTA: O volume final de ddH₂O dependerá da quantidade de NaHCO 3 ou NaOH utilizada no passo_1.3 .

2. Preparação da mistura célula-matriz

1. Pipetar lentamente 0,9 mL de matriz de membrana basal para um novo tubo de centrífuga de 15 mL sobre o gelo.
2. Cultivar as células IDG-SW3 em frasco T25 com 4 mL de meio completo (alfa-MEM contendo 10% de soro fetal bovino [SFB]) suplementado com 50 U/mL de INF-γ a 33 °C.
3. Assim que as células IDG-SW3 atingirem 90% de confluência, retirar o meio e lavar as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4 durante todo o protocolo) com uma pipeta. Digerir as células com 0,5 mL de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,25% a 37 °C por 30 s.
4. Inativar a tripsina adicionando 3,5 mL de meio completo (alfa-MEM contendo 10% de soro fetal bovino [SFB]). Transfira a suspensão de 4 mL de células para um tubo de centrífuga de 15 mL.
5. Gire a suspensão celular a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL do meio completo sobre gelo.
6. Contar as células usando um hemocitômetro e ajustar a densidade celular final com o meio completo para 4 × 10⁵ células/mL. Adicionar 0,1 ml da suspensão celular preparada a 0,9 ml da matriz extracelular do passo 2.1. Misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo.
   NOTA: Se for necessário um controle livre de células, adicione 0,1 mL do meio completo a 0,9 mL de matriz extracelular como controle negativo.

3. Chapeamento da mistura célula-gel

1. Delicadamente, misture bem as duas misturas da etapa 2.6 e da etapa 1.4 a 2 mL, pipetando para cima e para baixo sobre o gelo. Pipetar 0,5 mL da mistura final para cada poço (quatro poços de uma placa de 24 poços). Incubar a 37 °C durante 1 h para formar uma mistura célula-gel.
2. Adicionar 0,5 mL de meio osteogênico (meio completo contendo 50 μg/mL de ácido ascórbico e 4 mM de β-glicerofosfato, também conhecido como meio de indução osteogênica)⁴ à mistura célula-gel em cada poço para iniciar a diferenciação osteogênica a 37 °C. Considere isso como Dia 0.
3. A cada 2 dias, substituir metade do meio por meio osteogênico fresco mantido a 37 °C. Continuar o cultivo por 35 dias.

4. Identificação da viabilidade celular e dos dendritos celulares utilizando microscópio confocal

1. Coloração celular
   NOTA: Calceína acetoximetil éster (calceína AM) é um corante permeático celular que pode ser usado para determinar a viabilidade celular. O homodímero de etídio-I (EthD-1) não atravessa a membrana de células intactas/viáveis⁹. Assim, a calceína AM/EthD-1 pode ser usada para identificar a viabilidade celular e os dendritos celulares.
   1. No Dia 1 e no Dia 7 da cultura, remova a solução-estoque de calceína AM (4 mM em DMSO) e a solução-estoque de EthD-1 (2 mM em DMSO/H₂O 1:4 [v/v]) do freezer e deixe aquecer até a temperatura ambiente.
      NOTA: A matriz mineralizada tem um forte sinal de autofluorescência, de modo que o estágio de pré-osteócito sem expressão de Dmp1 dentro de 7 dias após a cultura⁴ é mais adequado para a observação da coloração celular.
   2. Adicionar 4 μL da solução-mãe de EthD-1 2 mM e 5 μL da solução-mãe de calceína AM de 4 mM a 2 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS) e misturar bem. Isso dá aproximadamente 2 μM de calceína AM e 4 μM de EthD-1 como soluções de trabalho.
   3. Pipetar 0,5 mL da solução de trabalho para os poços na placa de 24 poços. Incubar por 30-45 min à temperatura ambiente para manchar a matriz célula-gel.
   4. Após a incubação, adicionar aproximadamente 0,5 mL de D-PBS fresco a uma nova placa de cultura com fundo de vidro de 35 mm. Cubra o prato para evitar contaminação ou secagem das amostras.
   5. Usando pinça com ponta de cotovelo, transfira cuidadosamente a matriz de gel de célula corada do passo 4.1.3 para a placa de cultura de 35 mm do passo 4.1.4. Evite danificar ou cisalhar a matriz celular-gel.
   6. Visualize as células marcadas sob um microscópio confocal de fluorescência a laser.
2. Conjunto de varredura do microscópio
   1. Coloque o prato de 35 mm no palco. Selecione as regiões da matriz célula-gel a serem escaneadas através da ocular usando uma objetiva de 10x. Objetivos de maior ampliação não são recomendados devido ao tamanho dos dendritos estendidos.
   2. Selecione os filtros ópticos. A calceína pode ser vista como verde com um filtro passa-banda fluoresceína padrão, e o EthD-1 pode ser visto como vermelho com filtros para iodeto de propídio ou corante Texas Red. Selecione o "modo de linha" para digitalização e defina o "pinhole" para 2 μm.
   3. Selecione uma profundidade de dados de 8 bits e uma resolução de imagem de 1.024 pixels x 1.024 pixels.
   4. Imagem usando varredura de linha sequencial com as configurações ideais de laser e detector (mantenha uma energia laser mínima para evitar potencial fotobranqueamento).
      NOTA: A configuração ideal do detector depende dos sinais finais de fluorescência.
3. Coletando uma "pilha z" de imagens
   1. De acordo com o sinal do canal verde, defina as posições superior e inferior da matriz célula-gel a ser escaneada, focalizando através da amostra enquanto escaneia continuamente, .
   2. Depois que a parte superior e inferior da amostra tiverem sido especificadas, selecione o quadro de digitalização desejado. Inicie a digitalização. A amostra será digitalizada de cima para baixo com as configurações selecionadas a partir da etapa 4.2, gerando uma galeria de imagens.
4. Identificação da viabilidade celular.
   1. Selecione uma fatia na etapa 4.3. Os canais verde e vermelho indicam células vivas e mortas, respectivamente.
5. Identificação de dendritos celulares.
   1. Selecione o único canal verde para gerar reconstruções 3D com o software de aquisição de imagens. As informações de profundidade são exibidas como uma série de imagens pseudocoloridas do arco-íris. Os dendritos localizados na parte inferior do gel são exibidos em vermelho, enquanto aqueles na parte superior são exibidos em azul.

5. Identificação da aparência usando um estereomicroscópio

1. No Dia 1, Dia 7, Dia 21 e Dia 35 da cultura, retire o meio de cultura e lave os géis no prato duas vezes com D-PBS. Adicionar 0,5 mL de paraformaldeído a 4% (v/v) em D-PBS ao poço para fixar a matriz célula-gel na placa por 10 min à temperatura ambiente.
2. Retire o paraformaldeído do poço e lave a matriz célula-gel mais duas vezes com D-PBS na placa. Deixar 0,5 mL de D-PBS em cada poço para aquisição de imagens.
3. Coloque a placa no palco e selecione a posição ideal através da ocular usando uma objetiva de 0,5x. Imagem da visão de campo total da matriz célula-gel na placa individualmente usando "exposição automática" sob o campo brilhante.

6. Identificando a deposição mineral com um ensaio de XRF

1. No 35º dia da cultura, verifique se o nitrogênio líquido é suficiente. Inicie o sistema XRF. Abra a sala de amostras e transfira os géis com pinça com ponta de cotovelo da placa para o meio do estágio de amostra do instrumento. Feche a sala de amostras e aguarde 30 min para permitir que o instrumento esfrie antes de usar.
2. Defina o "Tempo de exposição" para 35 ms, a "faixa de espectro" para 0-40 keV e a "Corrente elétrica" para 770 μA para configuração de aquisição.
3. Escolha de três a cinco locais de varredura para análise movendo o estágio de amostragem.
4. Selecione os elementos (Ca e P) para detecção. Inicie a detecção e exporte os resultados.
   NOTA: Ca e P são os elementos mais abundantes na hidroxiapatita.

7. Identificação da expressão gênica funcional

1. No Dia 1, Dia 7, Dia 21, Dia 28 e Dia 35 da cultura, remova o meio de cultura e lave a matriz célula-gel duas vezes com D-PBS gelado na placa.
2. Transfira os géis com pinça com ponta de cotovelo da placa para um tubo de 2,0 mL (de acordo com o tempo de cultura, a matriz célula-gel diminuirá gradualmente para aproximadamente 0,1 mL no Dia 35). Certifique-se de que um gel é colocado em um tubo. Adicionar 1 mL de fenol-clorofórmio e duas esferas estéreis de aço inoxidável (4 mm, como matriz lisante) em cada tubo. Coloque os tubos simetricamente no slot de amostra pré-resfriado do homogeneizador de batimento mecânico.
3. Ajuste o batimento para uma frequência de 55 Hz e uma amplitude de 1 cm a cada 1 min de batimento mecânico com uma pausa de 10 s, com seis ciclos no total. Comece a bater as contas.
4. Extrair o RNA total da matriz célula-gel usando o método fenol-clorofórmio-isoamilachool. Transcrever reversamente 2 μg de RNA total para cDNA com iniciadores hexâmeros aleatórios.
5. Projete primers direcionados para β-actina, Pdpn, Dmp1, Sost e Fgf23 para PCR em tempo real (Tabela 2). β-Actina é o gene housekeeping usado para normalização. Os genes Pdpn¹⁰ e Dmp1 11 são expressos principalmente em pré-osteócitos e osteócitos mineralizados, enquanto Sost¹² e Fgf23 ¹³ são expressos principalmente em osteócitos maduros.
6. Coloque o tubo num termociclador com a tampa aquecida regulada para 105 °C e efectue a amplificação por PCR utilizando as seguintes definições de ciclo de PCR: 95 °C para 5 s e 60 °C para 30 s durante 35 ciclos, com um passo inicial de desnaturação a 95 °C durante 5 minutos e um passo de extensão final a 60 °C durante 30 s. Analise as mudanças de dobra com o método ΔΔCt.

Resultados

Após a coloração de células vivas/mortas, as células foram visualizadas em microscópio confocal a laser. Todas as células eram positivas para calceína AM (cor verde) e quase não havia células positivas para EthD-1 (cor vermelha) no campo, indicando que o sistema de gel feito por este método é altamente adequado para osteocitogênese (Figura 1A, esquerda). Para melhor determinar a distribuição espacial das células, uma imagem pseudocolorida foi escolhida para exibir os dendrito...

Discussão

Um ponto crítico nesse protocolo é que as etapas 1 e 2 devem ser realizadas em gelo para evitar coagulação espontânea. Nesse método, a concentração final de colágeno I foi de 1,2 mg/mL. Assim, um volume ótimo de ddH₂O deve ser calculado para corresponder aos diferentes colágenos de vários fabricantes.

In vivo, a osteocitogênese envolve um movimento polar de osteoblastos da superfície para o interior do osso trabecular14. Este protocolo ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid	Hyclone	SH30042.01
15 mL tubes	Corning, NY, USA	430791
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, MO, USA	S8761
ascorbic acid	Sigma-Aldrich, MO, USA	A4544
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogenizer	BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China	SKSI
laser confocal fluorescence microscopy	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	LSM 800
Live/Dead Cell Imaging kit	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel matrix	Corning, NY, USA	356234
MEM (10X), no glutamine	Thermo Fisher Scientific	21430079
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, MO, USA	158127
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.FS
stereo microscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
X-ray fluorescence	EDAX, USA	EAGLE III
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422