IDG-SW3 Zellkultur in einer dreidimensionalen extrazellulären Matrix

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Kultivierung von IDG-SW3-Zellen in einer dreidimensionalen (3D) extrazellulären Matrix vor.

Zusammenfassung

Osteozyten gelten als nicht-proliferative Zellen, die sich terminalmäßig von Osteoblasten unterscheiden. Osteoblasten, die in die extrazelluläre Matrix des Knochens (Osteoid) eingebettet sind, exprimieren das Pdpn-Gen , um zelluläre Dendriten zu bilden und sich in Präosteozyten umzuwandeln. Später exprimieren Präosteozyten das Dmp1-Gen , um die Matrixmineralisierung zu fördern und sich dadurch in reife Osteozyten umzuwandeln. Dieser Prozess wird als Osteozytogenese bezeichnet. IDG-SW3 ist eine bekannte Zelllinie für In-vitro-Studien zur Osteozytogenese. Viele frühere Methoden haben Kollagen I als Haupt- oder einzige Komponente der Kultivierungsmatrix verwendet. Neben Kollagen I enthält das Osteoid jedoch auch eine Grundsubstanz, die eine wichtige Komponente bei der Förderung des Zellwachstums, der Adhäsion und der Migration ist. Darüber hinaus ist die Matrixsubstanz transparent, was die Transparenz des Kollagen-I-gebildeten Gels erhöht und somit die Erforschung der Dendritenbildung durch bildgebende Verfahren unterstützt. Daher wird in dieser Arbeit ein Protokoll zur Etablierung eines 3D-Gels unter Verwendung einer extrazellulären Matrix zusammen mit Kollagen I für das Überleben von IDG-SW3 beschrieben. In dieser Arbeit wurden die Dendritenbildung und die Genexpression während der Osteozytogenese untersucht. Nach 7 Tagen osteogener Kultur konnte unter einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop deutlich ein ausgedehntes Dendritennetzwerk beobachtet werden. Die Real-Time-PCR zeigte, dass die mRNA-Spiegel von Pdpn und Dmp1 über 3 Wochen kontinuierlich anstiegen. In Woche 4 zeigte das Stereomikroskop ein undurchsichtiges Gel, das mit Mineralpartikeln gefüllt war, was mit dem Röntgenfluoreszenz-Assay (RFA) übereinstimmte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Kulturmatrix den Übergang von Osteoblasten zu reifen Osteozyten erfolgreich erleichtert.

Einleitung

Osteozyten sind terminale differenzierte Zellen, die von Osteoblasten abstammen ^1,2. Sobald der Osteoblast vom Osteoid begraben ist, durchläuft er eine Osteozytogenese und exprimiert das Pdpn-Gen, um Präosteozyten zu bilden, das Dmp1-Gen^{, um das Osteoid zu mineralisieren, und die} Sost- und Fgf23-Gene, um als reifer Osteozyt im Knochengewebe zu fungieren³. Hier wird ein 3D-Kultivierungssystem eingeführt, um die Dendritenverlängerung und die Markergenexpression im Osteozytogeneseprozess zu identifizieren.

IDG-SW3-Zellen sind eine immortalisierte primäre Zelllinie, die von transgenen Mäusen abstammt und die Differenzierung von Osteoblasten bis hin zu späten Osteozyten erweitern oder replizieren können, wenn sie in verschiedenen Medien kultiviert^{werden 4}. Im Vergleich zu MLO-A5, MLO-Y4 und anderen Zelllinien sind das Expressionsprofil funktioneller Proteine, die Fähigkeit, Kalziumsalzablagerungen durchzuführen, und die Reaktionen auf verschiedene Hormone in IDG-SW3-Zellen eher die gleichen wie die von primären Osteozyten im Knochengewebe⁴.

Im Vergleich zu 2D-Systemen sind 3D-Kultivierungssysteme besser in der Lage, die In-vivo-Zellwachstumsumgebung nachzuahmen, einschließlich des Nährstoffgradienten, der geringen mechanischen Steifigkeit und des umgebenden mechanischen Bereichs (Tabelle 1). Die meisten der bisherigen Methoden zur Kultivierung osteoblastischer Zellen in einem 3D-System verwendeten Kollagen I als einzigartige Komponente in Formulierungen ^4,5,6, da Kollagen-I-Fasern als Ort der Kalzium- und Phosphorablagerung dienen. Ein unverzichtbarer Bestandteil des Osteoids, die extrazelluläre Matrix, enthält jedoch eine große Gruppe zellulärer Faktoren, die das Zellwachstum, die Adhäsion und die Migration fördern ^7,8 und ist transparent und für die bildgebende Beobachtung geeignet. Daher verwendet dieses Protokoll Matrigel (im Folgenden als Basalmembranmatrix bezeichnet) als sekundäre Komponente für die Osteozytogenese-Studie.

Protokoll

Dieses Protokoll eignet sich für die Kultivierung von Zellen in vier Wells mit 24-Well-Platten. Bei der Vorbereitung mehrerer Proben oder Platten sollten die Mengen der Reagenzien entsprechend erhöht werden.

1. Herstellung der Kollagen-I-Mischung

HINWEIS: Kollagen I und Basalmembran-Matrix-Gel schnell bei Raumtemperatur. Daher sollte Kollagen auf Eis (2 °C bis 8 °C) gehandhabt werden. Alle verwendeten Spitzen und Röhrchen müssen vorgekühlt werden, sofern nicht anders angegeben. Alle Eingriffe sollten in einer Schutzhaube durchgeführt werden.

1. Alle Reagenzien und Zentrifugenröhrchen auf Eis legen.
2. Langsam 0,48 ml Kollagen I (5 mg/ml) und 0,1 ml 10x Minimum Essential Medium (MEM) (mit Phenolrot) in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen pipettieren, das auf Eis aufbewahrt wird. Gut mischen, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren.
3. Verwenden Sie entsprechend der Farbpalette des Phenolrotindikators ein angemessenes Volumen von 7,5 % (w/v) NaHCO₃ (ca. 0,2 ml), um den Phenolrotindikator auf Orange einzustellen, was anzeigt, dass der pH-Wert im Bereich von 7,0-7,4 liegt.
   HINWEIS: Abhängig vom pH-Wert des Mediums wird ein Volumen NaHCO₃ verwendet, um den pH-Wert auf etwa 7,0-7,4 zu bringen. Zusätzlich wird NaOH zur pH-Neutralisation eingesetzt.
4. Das Endvolumen der Mischung wird auf 1 ml erhöht, indem ein geeignetes Volumen ddH₂O hinzugefügt wird. Gut mischen, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, um die Verwendung vorzubereiten.
   ANMERKUNG: Das endgültige Volumen von_ddH2Ohängt von der Menge an NaHCO3 oder NaOH ab, die in Schritt 1.3 verwendet wurde.

2. Herstellung des Zell-Matrix-Gemisches

1. Langsam 0,9 ml Basalmembranmatrix in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen auf dem Eis pipettieren.
2. Die IDG-SW3-Zellen werden in einem T25-Kolben mit 4 ml vollständigem Medium (Alpha-MEM mit 10 % fötalem Kälberserum [FBS]), ergänzt mit 50 U/ml INF-γ bei 33 °C, kultiviert.
3. Sobald die IDG-SW3-Zellen eine Konfluenz von 90 % erreicht haben, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4 während des gesamten Protokolls) mit einer Pipette. Die Zellen werden mit 0,5 ml 0,25%iger Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei 37 °C für 30 s verdaut.
4. Inaktivieren Sie das Trypsin durch Zugabe von 3,5 ml vollständigem Medium (Alpha-MEM mit 10 % fötalem Kälberserum [FBS]). Die 4-ml-Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.
5. Die Zellsuspension wird bei 300 × g für 5 min bei 4 °C heruntergeschleudert. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml des kompletten Mediums auf Eis.
6. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und stellen Sie die endgültige Zelldichte mit dem gesamten Medium auf 4 × 10⁵ Zellen/ml ein. 0,1 ml der hergestellten Zellsuspension werden zu 0,9 ml der extrazellulären Matrix aus Schritt 2.1 gegeben. Gut mischen, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren.
   HINWEIS: Wenn eine zellfreie Kontrolle erforderlich ist, fügen Sie 0,1 ml des vollständigen Mediums zu 0,9 ml extrazellulärer Matrix als Negativkontrolle hinzu.

3. Beschichtung der Zell-Gel-Mischung

1. Mischen Sie die beiden Mischungen aus Schritt 2.6 und Schritt 1.4 vorsichtig gut auf 2 ml, indem Sie auf dem Eis auf und ab pipettieren. Pipettieren Sie 0,5 ml der Endmischung in jede Vertiefung (vier Vertiefungen einer 24-Well-Platte). Bei 37 °C für 1 h inkubieren, um ein Zell-Gel-Gemisch zu bilden.
2. 0,5 ml osteogenes Medium (vollständiges Medium mit 50 μg/ml Ascorbinsäure und 4 mM β-Glycerophosphat, auch bekannt als osteogenes Induktionsmedium)⁴ in die Zell-Gel-Mischung in jeder Vertiefung geben, um die osteogene Differenzierung bei 37 °C zu beginnen. Betrachten Sie dies als Tag 0.
3. Ersetzen Sie alle 2 Tage die Hälfte des Mediums durch frisches osteogenes Medium, das bei 37 °C gehalten wird. Setzen Sie die Kultivierung 35 Tage lang fort.

4. Identifizierung der Zelllebensfähigkeit und der zellulären Dendriten mit einem konfokalen Mikroskop

1. Zellfärbung
   HINWEIS: Calcein-Acetoxymethylester (Calcein AM) ist ein zelldurchlässiger Farbstoff, der zur Bestimmung der Zelllebensfähigkeit verwendet werden kann. Ethidium-Homodimer-I (EthD-1) durchdringt nicht die Membran intakter/lebensfähiger Zellen⁹. Somit kann Calcein AM/EthD-1 verwendet werden, um die Lebensfähigkeit von Zellen und zelluläre Dendriten zu identifizieren.
   1. An Tag 1 und Tag 7 der Kultur die Calcein-AM-Stammlösung (4 mM in DMSO) und die EthD-1-Stammlösung (2 mM in DMSO/H₂O 1:4 [v/v]) aus dem Gefrierschrank nehmen und auf Raumtemperatur erwärmen lassen.
      HINWEIS: Die mineralisierte Matrix hat ein starkes Autofluoreszenzsignal, so dass das Präosteozytenstadium ohne Dmp1-Expression innerhalb von 7 Tagen nach der Kultivierung⁴ besser für die Beobachtung der Zellfärbung geeignet ist.
   2. 4 μl der 2 mM EthD-1 Stammlösung und 5 μl der 4 mM Calcein-AM-Stammlösung zu 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS) von Dulbecco geben und gut mischen. Daraus ergeben sich ca. 2 μM Calcein AM und 4 μM EthD-1 als Arbeitslösungen.
   3. Pipettieren Sie 0,5 ml der Arbeitslösung in die Vertiefungen in der 24-Well-Platte. 30-45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die Zell-Gel-Matrix zu färben.
   4. Nach der Inkubation ca. 0,5 ml frisches D-PBS in eine neue 35-mm-Kulturschale mit Glasboden geben. Decken Sie die Schale ab, um eine Kontamination oder Austrocknung der Proben zu verhindern.
   5. Die gefärbte Zell-Gel-Matrix aus Schritt 4.1.3 wird mit einer Ellbogenpinzette vorsichtig in die 35-mm-Kulturschale aus Schritt 4.1.4 überführt. Vermeiden Sie es, die Zell-Gel-Matrix zu beschädigen oder zu scheren.
   6. Betrachten Sie die markierten Zellen unter einem konfokalen Laser-Fluoreszenzmikroskop.
2. Scanning-Set für Mikroskope
   1. Stellen Sie die 35-mm-Schüssel auf die Bühne. Wählen Sie die Bereiche der Zell-Gel-Matrix aus, die mit einem 10-fach-Objektiv durch das Okular abgetastet werden sollen. Objektive mit höherer Vergrößerung werden aufgrund der Größe der verlängerten Dendriten nicht empfohlen.
   2. Wählen Sie die optischen Filter aus. Calcein kann mit einem Standard-Fluorescein-Bandpassfilter grün angezeigt werden, und EthD-1 kann mit Filtern für Propidiumiodid oder den Farbstoff Texas Red rot als rot angesehen werden. Wählen Sie den "Zeilenmodus" für das Scannen und stellen Sie die "Lochblende" auf 2 μm ein.
   3. Wählen Sie eine Datentiefe von 8 Bit Datentiefe und eine Bildauflösung von 1.024 Pixel x 1.024 Pixel.
   4. Bild mit sequentieller Zeilenabtastung mit den optimalen Laser- und Detektoreinstellungen (halten Sie eine minimale Laserenergie ein, um ein mögliches Photobleichen zu vermeiden).
      HINWEIS: Die optimale Detektoreinstellung hängt von den endgültigen Fluoreszenzsignalen ab.
3. Sammeln eines "Z-Stapels" von Bildern
   1. Definieren Sie entsprechend dem grünen Kanalsignal die obere und untere Position der zu scannenden Zell-Gel-Matrix, indem Sie während des kontinuierlichen Scannens durch die Probe fokussieren.
   2. Nachdem die Ober- und Unterseite der Probe festgelegt wurden, wählen Sie den gewünschten Scanrahmen aus. Starten Sie den Scanvorgang. Die Probe wird von oben nach unten mit den ausgewählten Einstellungen aus Schritt 4.2 gescannt, wodurch eine Bildergalerie erstellt wird.
4. Identifizierung der Zelllebensfähigkeit.
   1. Wählen Sie ein Segment aus Schritt 4.3 aus. Die grünen und roten Kanäle zeigen lebende bzw. tote Zellen an.
5. Identifizierung von Zelldendriten.
   1. Wählen Sie den einzelnen grünen Kanal aus, um 3D-Rekonstruktionen mit der Bilderfassungssoftware zu erstellen. Die Tiefeninformationen werden als eine Reihe von Regenbogen-Pseudofarbenbildern angezeigt. Die Dendriten, die sich am unteren Rand des Gels befinden, werden rot dargestellt, während die Dendriten an der Oberseite blau dargestellt werden.

5. Identifizierung des Aussehens mit einem Stereomikroskop

1. Entfernen Sie an Tag 1, Tag 7, Tag 21 und Tag 35 der Kultur das Nährmedium und waschen Sie die Gele in der Platte zweimal mit D-PBS. Geben Sie 0,5 ml 4% (v/v) Paraformaldehyd in D-PBS in die Vertiefung, um die Zell-Gel-Matrix in der Platte für 10 Minuten bei Raumtemperatur zu fixieren.
2. Entfernen Sie das Paraformaldehyd aus der Vertiefung und waschen Sie die Zell-Gel-Matrix noch zwei weitere Male mit D-PBS in der Platte. Lassen Sie 0,5 ml D-PBS für die Bildgebung in jeder Vertiefung.
3. Legen Sie die Platte auf den Tisch und wählen Sie die optimale Position durch das Okular mit einem 0,5-fach-Objektiv. Bilden Sie die Vollfeldansicht der Zell-Gel-Matrix in der Platte einzeln mit "automatischer Belichtung" unter dem Hellfeld ab.

6. Identifizierung von Mineralablagerungen mit einem RFA-Assay

1. Prüfen Sie am Tag 35 der Kultur, ob der flüssige Stickstoff ausreichend ist. Starten Sie das RFA-System. Öffnen Sie den Probenraum und übertragen Sie die Gele mit einer Ellbogenpinzette von der Platte in die Mitte des Probentisches des Instruments. Schließen Sie den Probenraum und warten Sie 30 Minuten, damit das Gerät abkühlen kann, bevor Sie es verwenden.
2. Stellen Sie die "Belichtungszeit" auf 35 ms, den "Spektrumbereich" auf 0-40 keV und den "Elektrischen Strom" auf 770 μA für die Aufnahmeeinrichtung ein.
3. Wählen Sie drei bis fünf Scan-Stellen für die Analyse aus, indem Sie den Probentisch verschieben.
4. Wählen Sie die zu erkennenden Elemente (Ca und P) aus. Starten Sie die Erkennung, und exportieren Sie die Ergebnisse.
   HINWEIS: Ca und P sind die am häufigsten vorkommenden Elemente in Hydroxylapatit.

7. Identifizierung der funktionellen Genexpression

1. An Tag 1, Tag 7, Tag 21, Tag 28 und Tag 35 der Kultur wird das Nährmedium entfernt und die Zell-Gel-Matrix zweimal mit eiskaltem D-PBS in der Platte gewaschen.
2. Übertragen Sie die Gele mit einer Ellbogenpinzette von der Platte in ein 2,0-ml-Röhrchen (je nach Kulturzeit schrumpft die Zell-Gel-Matrix allmählich auf etwa 0,1 ml am 35. Tag). Stellen Sie sicher, dass sich ein Gel in einer Tube befindet. Geben Sie 1 ml Phenolchloroform und zwei sterile Schlagperlen aus Edelstahl (4 mm, als Lysematrix) in jedes Röhrchen. Setzen Sie die Röhrchen symmetrisch in den vorgekühlten Probenschlitz des mechanischen Schlaghomogenisators.
3. Stellen Sie die Schwebung auf eine Frequenz von 55 Hz und eine Amplitude von 1 cm in jeder 1-minütigen mechanischen Schwebung mit einer Pause von 10 s ein, mit insgesamt sechs Zyklen. Beginne mit dem Perlenschlagen.
4. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus der Zell-Gel-Matrix mit der Phenol-Chloroform-Isoamylachohol-Methode. Transkribieren Sie 2 μg Gesamt-RNA in cDNA mit zufälligen Hexamer-Primern.
5. Entwerfen Sie Primer, die auf β-Aktin, Pdpn, Dmp1, Sost und Fgf23 abzielen, für die Real-Time-PCR (Tabelle 2). β-Aktin ist das Haushaltsgen, das für die Normalisierung verwendet wird. Die Gene Pdpn¹⁰ und Dmp1 11 werden hauptsächlich in Prä-Osteozyten und mineralisierten Osteozyten exprimiert, während Sost¹² und Fgf23 ¹³ hauptsächlich in reifen Osteozyten exprimiert werden.
6. Stellen Sie das Röhrchen mit dem beheizten Deckel auf 105 °C auf einen Thermocycler und führen Sie die PCR-Amplifikation mit den folgenden PCR-Zykluseinstellungen durch: 95 °C für 5 s und 60 °C für 30 s für 35 Zyklen mit einem ersten Denaturierungsschritt bei 95 °C für 5 min und einem letzten Verlängerungsschritt bei 60 °C für 30 s. Analysieren Sie die Faltenänderungen mit der ΔΔCt-Methode.

Ergebnisse

Nach der Färbung lebender/toter Zellen wurden die Zellen mit einem konfokalen Lasermikroskop sichtbar gemacht. Alle Zellen waren Calcein-AM-positiv (grüne Farbe), und es gab fast keine EthD-1-positiven Zellen (rote Farbe) im Feld, was darauf hindeutet, dass das mit dieser Methode hergestellte Gelsystem sehr gut für die Osteozytogenese geeignet ist (Abbildung 1A, links). Um die räumliche Verteilung der Zellen besser bestimmen zu können, wurde ein Pseudofarbenbild gewählt, um die Zellden...

Diskussion

Ein kritischer Punkt in diesem Protokoll ist, dass die Schritte 1 und 2 auf Eis durchgeführt werden müssen, um eine spontane Gerinnung zu verhindern. Bei dieser Methode betrug die Endkonzentration von Kollagen I 1,2 mg/ml. Daher sollte ein optimales_{ddH2O-Volumen}berechnet werden, das zu den verschiedenen Kollagenen verschiedener Hersteller passt.

In vivo beinhaltet die Osteozytogenese eine polare Bewegung von Osteoblasten von der Oberfläche ins Innere des trabekulären Kn...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid	Hyclone	SH30042.01
15 mL tubes	Corning, NY, USA	430791
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, MO, USA	S8761
ascorbic acid	Sigma-Aldrich, MO, USA	A4544
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogenizer	BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China	SKSI
laser confocal fluorescence microscopy	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	LSM 800
Live/Dead Cell Imaging kit	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel matrix	Corning, NY, USA	356234
MEM (10X), no glutamine	Thermo Fisher Scientific	21430079
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, MO, USA	158127
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.FS
stereo microscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
X-ray fluorescence	EDAX, USA	EAGLE III
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422