Cultivo celular IDG-SW3 en matriz extracelular tridimensional

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para el cultivo de células IDG-SW3 en una matriz extracelular tridimensional (3D).

Resumen

Se considera que los osteocitos son células no proliferativas que se diferencian terminalmente de los osteoblastos. Los osteoblastos incrustados en la matriz extracelular ósea (osteoide) expresan el gen Pdpn para formar dendritas celulares y transformarse en preosteocitos. Más tarde, los preosteocitos expresan el gen Dmp1 para promover la mineralización de la matriz y, por lo tanto, transformarse en osteocitos maduros. Este proceso se denomina osteocitogénesis. IDG-SW3 es una línea celular bien conocida para estudios in vitro de osteocitogénesis. Muchos métodos anteriores han utilizado colágeno I como el componente principal o único de la matriz de cultivo. Sin embargo, además del colágeno I, el osteoide también contiene una sustancia fundamental, que es un componente importante para promover el crecimiento, la adhesión y la migración celular. Además, la sustancia de la matriz es transparente, lo que aumenta la transparencia del gel formado por colágeno I y, por lo tanto, ayuda a la exploración de la formación de dendritas a través de técnicas de imagen. Así, en este trabajo se detalla un protocolo para establecer un gel 3D utilizando una matriz extracelular junto con colágeno I para la supervivencia de IDG-SW3. En este trabajo se analizó la formación de dendritas y la expresión génica durante la osteocitogénesis. Después de 7 días de cultivo osteogénico, se observó claramente una extensa red de dendritas bajo un microscopio confocal de fluorescencia. La PCR en tiempo real mostró que los niveles de ARNm de Pdpn y Dmp1 aumentaron continuamente durante 3 semanas. En la semana 4, el microscopio estereoscópico reveló un gel opaco lleno de partículas minerales, consistente con el ensayo de fluorescencia de rayos X (XRF). Estos resultados indican que esta matriz de cultivo facilita con éxito la transición de osteoblastos a osteocitos maduros.

Introducción

Los osteocitos son células terminalmente diferenciadas derivadas de osteoblastos ^1,2. Una vez que el osteoblasto es enterrado por el osteoide, se somete a osteocitogénesis y expresa el gen Pdpn para formar preosteocitos, el gen Dmp1 para ^{mineralizar el osteoide y los} genes Sost y Fgf23 para funcionar como un osteocito maduro en el tejido óseo³. Aquí, se introduce un sistema de cultivo 3D para identificar la extensión de las dendritas y la expresión génica de marcadores en el proceso de osteocitogénesis.

Las células IDG-SW3 son una línea celular primaria inmortalizada derivada de ratones transgénicos y pueden expandirse o replicarse osteoblastos a la diferenciación tardía de osteocitos cuando se cultivan en diferentes medios⁴. En comparación con MLO-A5, MLO-Y4 y otras líneas celulares, es más probable que el perfil de expresión de las proteínas funcionales, la capacidad de realizar la deposición de sales de calcio y las respuestas a diversas hormonas en las células IDG-SW3 sean las mismas que las de los osteocitos primarios en el tejido óseo⁴.

En comparación con los sistemas 2D, los sistemas de cultivo 3D son más capaces de imitar el entorno de crecimiento celular in vivo, incluido el gradiente de nutrientes, la baja rigidez mecánica y el rango mecánico circundante (Tabla 1). La mayoría de los métodos anteriores para cultivar células osteoblásticas en un sistema 3D utilizaban colágeno I como componente único en las formulaciones ^4,5,6, porque las fibras de colágeno I sirven como sitio de deposición de calcio y fósforo. Sin embargo, un constituyente indispensable en el osteoide, la matriz extracelular, contiene un gran grupo de factores celulares que promueven el crecimiento, la adhesión y la migración celular ^7,8 y es transparente y conveniente para la observación por imágenes. Por lo tanto, este protocolo utiliza Matrigel (en adelante, matriz de membrana basal) como componente secundario para el estudio de osteocitogénesis.

Protocolo

Este protocolo es adecuado para el cultivo de células en cuatro pocillos de placas de 24 pocillos. Si se preparan varias muestras o placas, las cantidades de los reactivos deben aumentarse en consecuencia.

1. Preparación de la mezcla de colágeno I

NOTA: El colágeno I y la matriz de la membrana basal se gelifican rápidamente a temperatura ambiente. Por lo tanto, el colágeno debe manipularse en hielo (2 °C a 8 °C). Todas las puntas y tubos utilizados deben estar preenfriados a menos que se indique lo contrario. Todos los procedimientos deben realizarse en una capucha de seguridad.

1. Coloque todos los reactivos y los tubos de centrífuga sobre hielo.
2. Pipetear lentamente 0,48 ml de colágeno I (5 mg/ml) y 0,1 ml de medio esencial mínimo (MEM) 10x (con rojo de fenol) en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml mantenido en hielo. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo suavemente.
3. De acuerdo con la paleta de colores del indicador rojo fenol, use un volumen apropiado de 7.5% (p/v) NaHCO₃ (aproximadamente 0.2 mL) para ajustar el indicador rojo fenol a naranja, lo que indica que el valor de pH está en el rango de 7.0-7.4.
   NOTA: Dependiendo del pH del medio, se utiliza un volumen de NaHCO₃ para llevar el pH a aproximadamente 7,0-7,4. Además, el NaOH se utiliza para la neutralización del pH.
4. Lleve el volumen final de la mezcla hasta 1 ml agregando un volumen apropiado de ddH₂O. Mezcle bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para prepararse para su uso.
   NOTA: El volumen final de_ddH2O dependerá de la cantidad de NaHCO 3 o NaOH utilizada en el paso_1.3 .

2. Preparación de la mezcla célula-matriz

1. Pipetear lentamente 0,9 ml de matriz de membrana basal en un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml sobre el hielo.
2. Cultivo de las células IDG-SW3 en un matraz T25 con 4 mL de medio completo (alfa-MEM que contiene 10% de suero fetal bovino [FBS]) suplementado con 50 U/mL de INF-γ a 33 °C.
3. Una vez que las células IDG-SW3 alcancen el 90% de confluencia, retire el medio y lave las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4 durante todo el protocolo) con una pipeta. Digiera las células con 0,5 mL de ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,25% a 37 °C durante 30 s.
4. Inactivar la tripsina añadiendo 3,5 mL de medio completo (alfa-MEM que contiene un 10% de suero fetal bovino [FBS]). Transfiera la suspensión celular de 4 ml a un tubo de centrífuga de 15 ml.
5. Centrifugar la suspensión celular a 300 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 1 mL del medio completo en hielo.
6. Cuente las células con un hemocitómetro y ajuste la densidad celular final con el medio completo a 4 × 10⁵ células/mL. Añadir 0,1 mL de la suspensión celular preparada a 0,9 mL de la matriz extracelular del paso 2.1. Mezcle bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
   NOTA: Si se necesita un control libre de células, agregue 0,1 ml del medio completo a 0,9 ml de matriz extracelular como control negativo.

3. Enchapado de la mezcla de células y gel

1. Mezcle suavemente las dos mezclas del paso 2.6 y el paso 1.4 a 2 ml pipeteando hacia arriba y hacia abajo sobre el hielo. Pipetear 0,5 ml de la mezcla final en cada pocillo (cuatro pocillos de una placa de 24 pocillos). Incubar a 37 °C durante 1 h para formar una mezcla de células y gel.
2. Añadir 0,5 mL de medio osteogénico (medio completo que contiene 50 μg/mL de ácido ascórbico y 4 mM de β-glicerofosfato, también conocido como medio de inducción osteogénico)⁴ a la mezcla de célula y gel en cada pocillo para iniciar la diferenciación osteogénica a 37 °C. Considéralo como el Día 0.
3. Cada 2 días, sustituya la mitad del medio por medio osteogénico fresco mantenido a 37 °C. Continuar el cultivo durante 35 días.

4. Identificación de la viabilidad celular y de las dendritas celulares mediante un microscopio confocal

1. Tinción celular
   NOTA: El éster acetoximetílico de calceína (calceína AM) es un colorante permeado por células que se puede usar para determinar la viabilidad celular. El homodímero de etidio-I (EthD-1) no atraviesa la membrana de las células intactas/viables⁹. Por lo tanto, la calceína AM/EthD-1 se puede utilizar para identificar la viabilidad celular y las dendritas celulares.
   1. En el día 1 y el día 7 del cultivo, retire la solución madre de calceína AM (4 mM en DMSO) y la solución madre de EthD-1 (2 mM en DMSO/H₂O 1:4 [v/v]) del congelador y deje que se calienten a temperatura ambiente.
      NOTA: La matriz mineralizada tiene una fuerte señal de autofluorescencia, por lo que la etapa de preosteocitos sin expresión de Dmp1 dentro de los 7 días posteriores al cultivo⁴ es más adecuada para la observación de la tinción celular.
   2. Agregue 4 μL de la solución madre de EthD-1 de 2 mM y 5 μL de la solución madre de calceína AM de 4 mM a 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (D-PBS) de Dulbecco y mezcle bien. Esto da aproximadamente 2 μM de calceína AM y 4 μM de EthD-1 como soluciones de trabajo.
   3. Pipetear 0,5 ml de la solución de trabajo en los pocillos de la placa de 24 pocillos. Incubar durante 30-45 min a temperatura ambiente para teñir la matriz de célula y gel.
   4. Después de la incubación, agregue aproximadamente 0,5 ml de D-PBS fresco a una nueva placa de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm. Cubra el plato para evitar la contaminación o el secado de las muestras.
   5. Con unas pinzas con punta de codo, transfiera con cuidado la matriz de gel celular teñida del paso 4.1.3 a la placa de cultivo de 35 mm del paso 4.1.4. Evite dañar o cortar la matriz de célula y gel.
   6. Observe las células marcadas bajo un microscopio láser de fluorescencia confocal.
2. Equipo de escaneo microscópico
   1. Coloque el plato de 35 mm en el escenario. Seleccione las regiones de la matriz célula-gel que se van a escanear a través del ocular con un objetivo de 10x. No se recomiendan objetivos de mayor aumento debido al tamaño de las dendritas extendidas.
   2. Seleccione los filtros ópticos. La calceína se puede ver como verde con un filtro de paso de banda de fluoresceína estándar, y EthD-1 se puede ver como rojo con filtros para yoduro de propidio o tinte rojo de Texas. Seleccione el "modo de línea" para escanear y ajuste el "agujero de alfiler" a 2 μm.
   3. Seleccione una profundidad de datos de 8 bits y una resolución de imagen de 1.024 píxeles x 1.024 píxeles.
   4. Imagen mediante escaneo lineal secuencial con los ajustes óptimos del láser y del detector (mantenga una energía láser mínima para evitar un posible fotoblanqueo).
      NOTA: La configuración óptima del detector depende de las señales de fluorescencia finales.
3. Recopilación de una "pila z" de imágenes
   1. De acuerdo con la señal del canal verde, defina las posiciones superior e inferior de la matriz de célula y gel que se escaneará enfocándose a través de la muestra mientras escanea continuamente, .
   2. Una vez que se hayan especificado la parte superior e inferior de la muestra, seleccione el marco de escaneo deseado. Comience a escanear. La muestra se escaneará de arriba a abajo con la configuración seleccionada del paso 4.2, generando una galería de imágenes.
4. Identificación de la viabilidad celular.
   1. Seleccione un sector del paso 4.3. Los canales verde y rojo indican células vivas y muertas, respectivamente.
5. Identificación de dendritas celulares.
   1. Seleccione el único canal verde para generar reconstrucciones 3D con el software de adquisición de imágenes. La información de profundidad se muestra como una serie de imágenes de pseudocolor del arco iris. Las dendritas ubicadas en la parte inferior del gel se muestran en rojo, mientras que las de la parte superior se muestran en azul.

5. Identificación de la apariencia mediante un microscopio estereoscópico

1. En el día 1, el día 7, el día 21 y el día 35 del cultivo, retire el medio de cultivo y lave los geles en la placa dos veces con D-PBS. Agregue 0,5 mL de paraformaldehído al 4% (v/v) en D-PBS al pocillo para fijar la matriz de célula y gel en la placa durante 10 min a temperatura ambiente.
2. Retire el paraformaldehído del pocillo y lave la matriz de célula y gel dos veces más con D-PBS en la placa. Deje 0,5 ml de D-PBS en cada pocillo para la obtención de imágenes.
3. Coloque la placa en la platina y seleccione la posición óptima a través del ocular con un objetivo de 0,5x. Visualice la vista de campo completo de la matriz de célula y gel en la placa individualmente utilizando la "exposición automática" bajo el campo brillante.

6. Identificación de la deposición mineral con un ensayo XRF

1. En el día 35 del cultivo, compruebe si el nitrógeno líquido es suficiente. Inicie el sistema XRF. Abra la sala de muestras y transfiera los geles con pinzas con punta de codo desde la placa hasta el centro de la etapa de muestra del instrumento. Cierre la sala de muestras y espere 30 minutos para que el instrumento se enfríe antes de usarlo.
2. Establezca el "Tiempo de exposición" en 35 ms, el "Rango de espectro" en 0-40 keV y la "Corriente eléctrica" en 770 μA para la configuración de adquisición.
3. Elija de tres a cinco sitios de escaneo para el análisis moviendo la etapa de muestra.
4. Seleccione los elementos (Ca y P) para la detección. Inicie la detección y exporte los resultados.
   NOTA: El Ca y el P son los elementos más abundantes en la hidroxiapatita.

7. Identificación de la expresión génica funcional

1. En el día 1, el día 7, el día 21, el día 28 y el día 35 del cultivo, retire el medio de cultivo y lave la matriz de gel celular dos veces con D-PBS helado en la placa.
2. Transfiera los geles con pinzas con punta de codo de la placa a un tubo de 2,0 ml (según el tiempo de cultivo, la matriz de célula y gel se reducirá gradualmente hasta aproximadamente 0,1 ml el día 35). Asegúrese de que se coloque un gel en un tubo. Añadir 1 ml de fenol-cloroformo y dos perlas de acero inoxidable estériles (4 mm, como matriz de lisado) en cada tubo. Coloque los tubos simétricamente en la ranura de muestra preenfriada del homogeneizador de batido mecánico.
3. Ajuste el batido a una frecuencia de 55 Hz y una amplitud de 1 cm en cada 1 minuto de batido mecánico con una pausa de 10 s, con seis ciclos en total. Comienza a batir cuentas.
4. Extraiga el ARN total de la matriz célula-gel mediante el método de fenol-cloroformo-isoamilachohol. Transcriba inversamente 2 μg de ARN total a ADNc con cebadores de hexámero aleatorios.
5. Diseñe cebadores dirigidos a la β-actina, Pdpn, Dmp1, Sost y Fgf23 para la PCR en tiempo real (Tabla 2). β-actina es el gen de mantenimiento utilizado para la normalización. Los genes Pdpn¹⁰ y Dmp1 11 se expresan principalmente en preosteocitos y osteocitos mineralizados, mientras que Sost¹² y Fgf23 ¹³ se expresan principalmente en osteocitos maduros.
6. Coloque el tubo en un termociclador con la tapa calentada ajustada a 105 °C y realice la amplificación por PCR utilizando los siguientes ajustes de ciclo de PCR: 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 30 s durante 35 ciclos con un paso inicial de desnaturalización a 95 °C durante 5 min y un paso de extensión final a 60 °C durante 30 s. Analice los cambios de pliegue con el método ΔΔCt.

Resultados

Después de la tinción de células vivas/muertas, las células se visualizaron utilizando un microscopio láser confocal. Todas las células eran calceína AM positivas (color verde), y casi no había células EthD-1 positivas (color rojo) en el campo, lo que indica que el sistema de gel producido por este método es altamente adecuado para la osteocitogénesis (Figura 1A, izquierda). Para determinar mejor la distribución espacial de las células, se eligió una imagen en pseudocolor para ...

Discusión

Un punto crítico en este protocolo es que los pasos 1 y 2 deben realizarse en hielo para evitar la coagulación espontánea. En este método, la concentración final de colágeno I fue de 1,2 mg/mL. Por lo tanto, se debe calcular un volumen óptimo de ddH₂O para que coincida con los diferentes colágenos de varios fabricantes.

In vivo, la osteocitogénesis implica un movimiento polar de los osteoblastos desde la superficie hacia el interior del hueso trabecular

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid	Hyclone	SH30042.01
15 mL tubes	Corning, NY, USA	430791
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, MO, USA	S8761
ascorbic acid	Sigma-Aldrich, MO, USA	A4544
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogenizer	BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China	SKSI
laser confocal fluorescence microscopy	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	LSM 800
Live/Dead Cell Imaging kit	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel matrix	Corning, NY, USA	356234
MEM (10X), no glutamine	Thermo Fisher Scientific	21430079
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, MO, USA	158127
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.FS
stereo microscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
X-ray fluorescence	EDAX, USA	EAGLE III
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422