Клеточная культура IDG-SW3 в трехмерном внеклеточном матриксе

Резюме

Здесь мы представляем протокол культивирования клеток IDG-SW3 в трехмерном (3D) внеклеточном матриксе.

Аннотация

Остеоциты считаются непролиферативными клетками, которые терминально дифференцируются от остеобластов. Остеобласты, встроенные в костный внеклеточный матрикс (остеоид), экспрессируют ген Pdpn с образованием клеточных дендритов и превращением в преостеоциты. Позже преостеоциты экспрессируют ген Dmp1 , способствуя минерализации матрикса и, таким образом, превращаясь в зрелые остеоциты. Этот процесс называется остеоцитогенезом. IDG-SW3 — хорошо известная клеточная линия для исследований остеоцитогенеза in vitro . Во многих предыдущих методах коллаген I использовался в качестве основного или единственного компонента культивируемого матрикса. Однако, помимо коллагена I, остеоид также содержит основное вещество, которое является важным компонентом, способствующим клеточному росту, адгезии и миграции. Кроме того, матричное вещество прозрачно, что повышает прозрачность коллагенового геля I-образного типа и, таким образом, помогает исследовать образование дендритов с помощью методов визуализации. Таким образом, в данной работе подробно описан протокол создания 3D-геля с использованием внеклеточного матрикса вместе с коллагеном I для выживания IDG-SW3. В данной работе были проанализированы дендритообразование и экспрессия генов в процессе остеоцитогенеза. Через 7 дней остеогенного культивирования под флуоресцентным конфокальным микроскопом отчетливо наблюдалась обширная дендритная сеть. ПЦР в реальном времени показала, что уровни мРНК Pdpn и Dmp1 непрерывно повышались в течение 3 недель. На 4-й неделе стереомикроскоп показал непрозрачный гель, заполненный минеральными частицами, что соответствовало рентгенофлуоресцентному анализу (XRF). Эти результаты свидетельствуют о том, что данный культуральный матрикс успешно способствует переходу от остеобластов к зрелым остеоцитам.

Введение

Остеоциты представляют собой терминально дифференцированные клетки, полученные из остеобластов ^1,2. После того, как остеобласт погребен остеоидом, он подвергается остеоцитогенезу и экспрессирует ген Pdpn для образования преостеоцитов, ген Dmp1 для ^{минерализации остеоида} и гены Sost и Fgf23 для функционирования в качестве зрелого остеоцита в костной ткани³. Здесь используется система 3D-культивирования для выявления удлинения дендритов и экспрессии генов-маркеров в процессе остеоцитогенеза.

Клетки IDG-SW3 предста....

протокол

Этот протокол подходит для культивирования клеток в четырех лунках 24-луночных планшетов. При подготовке нескольких образцов или планшетов количество реагентов должно быть соответственно увеличено.

1. Приготовление коллагеновой смеси I

ПРИМЕЧАНИЕ: Коллаген I и матриксный гель базальной мембраны быстро схватываются при комнатной температуре. Поэтому с коллагеном следует обращаться со льдом (от 2 °C до 8 °C). Все используемые наконечники и трубки должны быть предварительно охлаждены, если не указано иное. Все процедуры следует выполнять в защитном кожухе.

1. Поместите все реагенты и центрифу....

Результаты

После окрашивания живых/мертвых клеток клетки визуализировали с помощью конфокального лазерного микроскопа. Все клетки были кальцеин-AM-положительными (зеленый цвет), а EthD-1-положительных клеток (красный цвет) в полевых условиях почти отсутствовали, что указывает на то, что гелевая сист?.......

Обсуждение

Критическим моментом в этом протоколе является то, что шаги 1 и шаг 2 должны выполняться на льду, чтобы предотвратить спонтанную коагуляцию. В этом методе конечная концентрация коллагена I составила 1,2 мг/мл. Таким образом, оптимальный объем_ddH2Oдолжен быть рассчитан в соответствии с .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid	Hyclone	SH30042.01
15 mL tubes	Corning, NY, USA	430791
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, MO, USA	S8761
ascorbic acid	Sigma-Aldrich, MO, USA	A4544
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogenizer	BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China	SKSI
laser confocal fluorescence microscopy	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	LSM 800
Live/Dead Cell Imaging kit	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel matrix	Corning, NY, USA	356234
MEM (10X), no glutamine	Thermo Fisher Scientific	21430079
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, MO, USA	158127
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.FS
stereo microscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
X-ray fluorescence	EDAX, USA	EAGLE III
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422